Monospecific 및 소설 형 간염-2 엘리트/DFS70 녹아웃 기판으로 아나 심사 중 혼합된 DFS70 패턴의 동시 구별

이 절차의 전반적인 목표는 Novel HEp-2, Dense fine speckled 70 knockout 기질을 사용하여 항핵 자가항체를 스크리닝하고 단일특이성 및 혼합 고밀도 미세 반점 70 패턴을 동시에 확인하는 개선된 간접 면역형광 분석을 입증하는 것입니다. Novel HEp-2 기질은 ANA라고도 하는 임상적으로 관련된 항핵 항체의 스크리닝을 위해 표준, 간접 면역형광 절차 및 해석 기준을 사용합니다. 주요 장점은 스크리닝 단계에서 조밀하고 미세한 반점이 있는 70 패턴을 질병 관련, 균질한 반점 패턴 또는 까다로운 혼합 패턴과 구별할 수 있다는 것입니다.

절차를 시연하는 것은 품질 관리 실험실의 기술자인 Sofia Badanin이 맡습니다. 기판 슬라이드의 경우, 기존 HEp-2 셀 또는 기존 및 조밀한 미세 반점 70 knockout HEp-2 셀의 혼합물을 포함하는 각 슬라이드에 12개의 웰이 있는 유리 슬라이드를 사용합니다. 기질 슬라이드가 들어 있는 파우치가 최적의 성능을 위해 실온과 평형을 이루도록 하고 샘플을 추가하기 전에 슬라이드 표면의 수분이 응결되는 것을 방지합니다.

이 작업은 10분에서 15분 정도 소요됩니다. 실온과 평형을 이루면 슬라이드와 파우치 측면 사이의 접촉을 피하고 손가락을 사용하여 기판 슬라이드를 조심스럽게 제거합니다. 슬라이드에 라벨을 붙이고 샘플과 접합체 배양 중 슬라이드가 건조되는 것을 방지하기 위해 축축한 종이 타월을 깐 배양 챔버에 넣습니다.

약 50마이크로리터의 음성 대조군과 양성 대조군과 희석된 환자 혈청을 개별 슬라이드 웰에 분배한 후 슬라이드를 배양 챔버에 넣습니다. ANA 검사는 자가면역 질환을 선별하는 첫 번째 단계입니다. 위양성 또는 위음성 결과를 최소화하기 위해 슬라이드에서 환자 샘플의 교차 오염을 피하는 것이 중요합니다.

웰 교차 오염을 방지하려면 웰을 과도하게 채우지 마십시오. 배양실에 뚜껑을 놓고 실온에서 30분 동안 슬라이드를 배양합니다. 환자의 혈청에 ANA가 존재하는 경우, 이 기간 동안 각 의지에 존재하는 세포에 결합합니다.

배양 기간이 끝나면 배양 챔버에서 슬라이드를 제거합니다. 탭 끝에서 슬라이드를 잡고 약 10ml의 재구성된 인산염 완충 식염수 세척 버퍼로 10-15초 동안 부드럽게 헹굽니다. 슬라이드를 PBS 세척 버퍼가 있는 Coplin 용기에 즉시 옮기고 10분 동안 담가둡니다.

나머지 모든 슬라이드에 대해 이 과정을 반복합니다. Coplin 용기에서 한 번에 하나의 슬라이드만 제거합니다. 슬라이드에서 여분의 PBS 세척 버퍼를 제거하려면 종이 타월로 슬라이드를 가볍게 두드리거나 닦아냅니다.

각 웰에 항인간 IgG 형광 접합체라고 표시된 플루오레세인 이소티오시아네이트 한 방울을 부드럽게 바릅니다. 그런 다음 밀폐된 염색 배양실에서 슬라이드를 30분 동안 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 배양 챔버에서 슬라이드를 제거합니다.

탭 끝에서 슬라이드를 잡고 이전과 같이 약 10ml의 PBS 세척 버퍼로 부드럽게 헹굽니다. 슬라이드를 PBS 세척 버퍼가 있는 Coplin 용기에 즉시 옮기고 10분 동안 담가둡니다. 키트에 제공된 커버 슬립을 마른 종이 타월 위에 놓습니다.

커버 슬립의 하단 가장자리에 장착 매체를 일렬로 3-4방울 떨어뜨립니다. 다음으로, 세척 버퍼가 들어 있는 Coplin 용기에서 한 번에 하나의 슬라이드를 꺼냅니다. 여분의 세탁 버퍼를 제거하려면 종이 타월의 슬라이드를 가볍게 두드리거나 닦아내십시오.

슬라이드에 과도한 양의 세탁 버퍼를 남겨두거나, 커버 슬립에 너무 많은 압력을 가하거나, 기포가 유입되지 않도록 하십시오. 이 모든 것은 세포 형태, 그에 따른 형광 패턴 및 반응 강도에 영향을 미칠 수 있습니다. 슬라이드의 아래쪽 가장자리를 커버 슬립의 가장자리에 놓아 슬라이드를 커버 슬립 위로 부드럽게 내립니다.

이렇게 하면 커버 슬립에 있는 장착 매체가 슬라이드의 상단 가장자리로 흐르고 각 웰을 읽는 데 방해가 될 수 있는 기포 형성을 최소화할 수 있습니다. 암실에 있는 플루오레세인 이소티오시아네이트 필터 세트를 사용하여 형광 현미경으로 슬라이드를 봅니다. 200배 이상의 배율로 현미경으로 샘플의 특정 밝은 녹색 형광을 검사하여 양성 및 패턴에 대한 최종 해석을 내립니다.

양수 및 음수 대조군을 관찰합니다. 양성 대조군은 핵에 밝은 녹색 형광을 표시합니다. 네거티브 컨트롤은 형광 현미경에서 특정 녹색 형광을 표시하지 않습니다.

각 웰에 대한 양성 또는 음성 결과를 기록하고 양성 사례에 대한 ANA 패턴을 포함합니다. HEp-2 조밀하고 미세한 점점이 있는 70 녹아웃 기질은 모든 주요 핵 및 세포질 패턴을 보존합니다. 조밀하고 미세한 반점 패턴은 유사분열상(mitotic phase)에서 계면핵(interphase, nucleus)과 염색질(chromatin) 전체에 걸쳐 균일하게 분포된 반점 염색이 존재하는 것이 특징입니다.

조밀한 미세 점점이 있는 70 항원을 발현하는 기존의 HEp-2 세포와 항원이 없는 엔지니어링된 HEp-2 세포의 존재는 기존 HEp-2 기질의 모든 장점을 유지하면서 조밀한 미세 점점이 있는 70 패턴을 정확하게 구별할 수 있도록 합니다. 주요 질병 관련 ANA 패턴에 대한 혈청 양성을 조밀하고 미세한 반점이 있는 70 패턴 양성 혈청과 동일한 비율로 혼합하고 기존 HEp-2 및 HEp-2 조밀하고 미세한 반점이 있는 70 녹아웃 기질 모두에서 테스트했습니다. 여기서 빨간색 화살표는 유사분열 단계에 있는 세포를 나타냅니다.

노란색 화살표는 기존의 HEp-2 핵을 나타내고 파란색 화살표는 조작된 HEp-2 핵을 나타냅니다. 묘사된 모든 반응 조합에 대해 조밀하고 미세한 반점이 있는 70 녹아웃 기질은 동일한 시야에서 변형되지 않은 세포와 엔지니어링된 세포 간의 명확한 강도 차이를 보여줍니다. 이는 mono-specific적 및 혼합된 조밀한 fine speckled 70 반응을 구별하는 데 도움이 됩니다.

핵 및 세포질 항원에 대한 자가항체는 전신 자가면역 질환에서 매우 흔합니다. PSIP1 단백질이라고도 하는 DFS70에 대한 자가항체로 인한 조밀하고 미세한 반점 패턴은 건강한 인구 집단에서 매우 흔한 것으로 보고되었습니다. 또한 이러한 DFS70 자가항체는 다른 질병 관련 ANA와 마찬가지로 단독으로 발생합니다.

따라서 임상 실험실에서 이 패턴을 다른 질병 관련 패턴과 정확하게 구별하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 루푸스와 관련된 혼합된 균질한 반점 패턴에서는 여러 확인 분석이 필요한 DFS70 패턴으로 잘못 해석될 수 있습니다. HEp-2 기질을 사용하는 간접 면역형광 방법은 ANA에 대한 황금 표준 스크리닝 방법으로 간주됩니다.

그러나 정확도는 기술자의 기술, 개별 단계의 신중한 실행 및 결과 패턴의 정확한 해석에 크게 좌우됩니다. 반대로, 기존 HEp-2 및 DFS70 녹아웃 기판의 비교 평가는 ANA를 스크리닝하는 동시에 DFS70 패턴을 높은 신뢰도로 구별하는 데 있어 이 새로운 기판의 유용성을 보여줍니다. 단양성 및 혼합 DFS70 패턴에 대한 추가 해석은 이 개선된 HEp-2 기질을 사용하여 상대적으로 단순화되었습니다.

새로운 기질은 임상적으로 관련된 모든 ANA 패턴에 대해 표준, 간접 면역형광 프로토콜과 확립된 해석 기준을 사용합니다.