Name: Monospecific 및 소설 형 간염-2 엘리트/DFS70 녹아웃 기판으로 아나 심사 중 혼합된 DFS70 패턴의 동시 구별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-17T10:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 학습하세요 간접형광면역분석법을 사용하여 DFS70 녹아웃 HEp-2 기판으로 핵항체를 선별하고 단일 및 혼합 DFS70 패턴을 동시에 구별하는 방법을. 이 기법은 자가면역 질환 진단의 정확성을 높입니다.

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우리 감사 앤드류 젱 IIF 실험을 수행 하 고 이미지를 수집.

프로토콜은 삼위일체 생명 공학 기관 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.
1. 샘플 및 기판 준비
<ol><li>파우치 포함 하는 기판 슬라이드를 허용 (12 웰 스와 HEp2 또는 형 간염을 포함 하는 각 슬라이드에 슬라이드 유리-2 + HEp2 코 셀 혼합물) 최적의 성능을 위해 실내 온도에 equilibrate 이전에 슬라이드 표면에 수 분의 응축을 방지 하는 샘플의 추가입니다. 이것은 약 10-15 분 사이 소요 됩니다.</li>
	<li>실내 온도에 equilibrated, 신중 하 게 제거 하는 주머니의 측면을 건드리지 그들 없이 손가락을 사용 하 여 기판 슬라이드.</li>
	<li>슬라이드 레이블 하 고 (실 온)에서 보육 실에서 샘플 및 어원이 부 화 하는 동안 슬라이드의 건조를 방지 하기 위해 물에 적신 종이 타월로 줄지어 그들을 배치. 참고: 일반적인 얼룩이 드라이 웰 스;에서 발생할 수 있습니다. 젖은 종이 타월 인큐베이션 챔버 내부 습도 제공 하 고 잘 건조를 방지.</li>
</ol>2입니다. 추가 컨트롤 및 샘플
<ol><li>이 연구, 또는 개별 슬라이드 우물에 환자 혈 청 샘플에 설명 된 대로 부정/긍정적인 컨트롤, DFS70-아나 긍정적인 세라의 조합의 약 50 µ L을 분배.</li>
	<li>슬라이드에서 각 우물에 컨트롤 및 샘플을 분배.</li>
	<li>잘 교차 오염을 방지 하기 위해, 우물 overfilling 하지 마십시오. 웰 스 overfilling 하지, 하는 동안 잘 표면의 완전 한 범위를 확인 하 고 공기 방울을 피하기 위해. 참고: 권장된 볼륨은 50 µ L 단계 2.1에 의하여.</li>
	<li>보육 실에 뚜껑을 배치 하 고 실 온에서 30 분에 대 한 슬라이드를 품 어. 어떤 아나 환자의 혈 청에 있는 경우에, 그것은이 잠복기 동안에 각 잘 현재 셀에 바인딩합니다.</li>
	<li>일단 잠복기가 끝나면, 보육 실에서 슬라이드를 제거 합니다. 탭 끝에 슬라이드를 잡고 약 10 mL 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 워시 버퍼를 피 펫을 사용 하 여 키트에 제공 된로 부드럽게 씻어 또는 10-15 미에 대 한 PBS 가득한 비 커에 전송 슬라이드 바로 PBS 워시 버퍼와 세척 (Coplin jar로 담가) 10 분 반복 모든 나머지 슬라이드와 프로세스에 대 한. 참고: Coplin jar에서 여러 슬라이드를 배치 되었는지 확인 하면 다른 슬라이드, 슬라이드의 셀 쪽에 연결 하지 못한이 유리 슬라이드에 준수는 세포 손상 됩니다.</li>
</ol>3입니다. 형광 공액의 추가
<ol><li>Coplin jar에서 한 번에 하나의 슬라이드를 제거 합니다. 슬라이드에서 초과 PBS 워시 버퍼를 제거 하려면 부드럽게 탭 또는 종이 타월에 슬라이드를 되 리. 각 키트는 FITC 안티 인간 IgG 형광 공액 표시와 함께 제공 됩니다. 각 음에 부드럽게 1 방울 (약 50 µ L) 제공 된 공액 적용 됩니다.</li>
	<li>30 분 동안 닫힌된 얼룩 보육 실에서 슬라이드를 품 어. 참고: Fc 특정 IgG 켤레를 사용 하 여 것이 좋습니다. 어떤 아나 환자의 혈 청에 있는 경우에, 여 켤레를 우물에 셀의 특정 형광이 잠복기 동안에 각 잘 현재 셀에 바인딩합니다. 공액은 빛에 민감합니다. 닫힌된 인큐베이션 챔버 각 우물에 셀의 어원이 반응으로 빛의 간섭을 방지 하는 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>일단 잠복기가 끝나면, 보육 실에서 슬라이드를 제거 합니다. 탭 끝에 슬라이드를 보유 하 고 약 10 mL PBS 워시 버퍼를 피 펫을 사용 하 여 키트 또는 PBS로 채워진 비 커를 제공 부드럽게 씻어. 전송 슬라이드 바로 PBS 워시 버퍼와 세척 (소) Coplin jar로 나머지 모든 슬라이드 과정을 반복 하는 10 분에 대 한. 참고: Coplin jar에서 여러 슬라이드를 배치 되었는지 확인 하면 다른 슬라이드, 슬라이드의 셀 쪽에 연결 하지 못한이 유리 슬라이드에 준수는 세포 손상 됩니다.</li>
	<li>건조 종이 타월에 키트에 제공 되는 coverslips를 배치 합니다. 설치 미디어 키트와 함께 제공 됩니다. coverslip의 아래쪽 가장자리 라인에 설치 미디어의 3-4 방울 사이 적용 합니다.</li>
	<li>워시 버퍼를 포함 하는 Coplin jar에서 한 번에 한 슬라이드 밖으로 가져가 라. 초과 워시 버퍼를 제거 하려면 부드럽게 탭 또는 종이 타월에 슬라이드를 되 리.</li>
	<li>coverslip의 가장자리에 슬라이드의 아래쪽 가장자리를 배치 하 여는 coverslip에 부드럽게 슬라이드를 낮춥니다. 이 흐름에서 슬라이드의 위쪽 가장자리에 더 낮은 가장자리 coverslip에 장착 미디어 존재를 허용 하 고 슬라이드의 각 우물의 읽기를 방해할 수 있는 기포 형성을 최소화 한다. 참고: 최소 압력 커버 슬라이드는 슬라이드에 탑재 하는 사용 되어야 한다. 모든 초과 압력 덮개 미 끄 러 짐의 측면 이동을 발생할 수 있습니다. 이 왜곡 셀 및 결과의 단층 준비에 손상을 일으킬 수 있습니다.</li>
	<li>2-8 ° c.에 어둠 속에서 슬라이드 저장 최대한 빨리 그들은 탑재 또는 48 h 이내 슬라이드를 검사 합니다. 참고: 더 이상 저장 패턴 및 형광 신호 저하 될 수 있습니다.</li>
</ol>4입니다. 긍정적이 고 부정적인 결과의 식별
<ol><li>어두운 방에 있는 FITC 필터 세트를 사용 하 여 형광 현미경 슬라이드를 볼.</li>
	<li>200 X 또는 큰 양성에 대 한 최종 해석 하 고 패턴의 확대에 형광 현미경 특정 밝은 녹색 형광에 대 한 검사 합니다. 긍정적이 고 부정적인 컨트롤을 관찰 합니다. 참고: 긍정적인 컨트롤 (그림 2A, 동종) 핵에 밝은 녹색 형광을 표시 됩니다. 부정적인 통제 없음 특정 녹색 형광 형광 현미경 아래 표시 됩니다.</li>
	<li>각 잘에 대 한 긍정적/부정적 결과 기록 하 고 긍정적인 경우 아나 패턴을 포함 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>American College of Rheumatology. Position Statement. Methodology of testing for antinuclear antibodies. , Available from:
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</ol>

Kishore Malyavantham 및 Lakshmanan Suresh 저자는 삼위일체 생명 공학, 미국의 직원이 있습니다.

신경 핵 및 세포질 항 원에 있습니다 높은 조직 자기 면역 질병. IIF 형 간염-2 조직 자기 면역 질병2,,34 에 대 한 매우 민감한이 고 비용 효율적인 심사 방법으로 널리 간주 아니 단일 분석 결과 제공 하지만 최상의 가능한 감도 특이성, . 50 그 해 동안 IIF 프로토콜의 보급에도 불구 하 고 IIF 분석 결과의 정확도 매우 기술자, 프로토콜의 각 단계와 잘 관리를 사용 하 여 결과의 정확한 해석의 주의 실행의 기술에 의존 형광으로 현미경 조직 자기 면역 질병의 진단 하지 형 간염-2 IIF 같은 단일 혈 청 학적인 시험의 결과에 따라 한다.
높은 품질을 사용 하 여 시 약의 재구성 (소 주/이온), 표준화 된 키트 구성 요소 (슬라이드 형 간염-2 셀 monolayers와 샘플 희석제, 긍정적이 고 부정적인 컨트롤, 미리 희석된 최적화 FITC-공액, 장착 매체)의 사용 결과에 긍정적인 영향을 미칠. 웰 스에 컨트롤 추가 예제를 건너뛰는 허위 부정적인 해석 격려 수 있습니다. 언제 든 지 슬라이드의 건조 후 샘플 또는 컨트롤의 추가 artifactual 거짓 긍정적인 반응 그리고/또한 부적당 한 패턴에 발생할 수 있습니다. 슬라이드에 너무 많은 워시 버퍼 왼쪽 또는 아티팩트가 발생할 수 있습니다 설치 매체의 분배 이전 슬라이드 우물의 건조. 매체를 장착 하거나 배치는 coverslip 이전 슬라이드 표면에 거품 생성의 부족 한 수량을 추가 하는 것은 흐리거나 초점 현미경 관찰 될 때 보이는 반응 귀 착될 수 있다. 탑재 된 슬라이드 2-8 ° C에 저장 하 고 false 네거티브 또는 artifactual 결과 최소화 하기 위해 시간 권장된 창 내에서 분석 해야 합니다.
적절 한 LED/Hg/크 세 논 빛 소스와 깨끗 한 광학 부품이 손상 되지 여기 및 방출 필터 등을 잘 피 형광 현미경을 사용 하 여 하는 것이 정확한 IIF 결과 얻기 위해 중요 합니다. 최종 사용자 차별 긍정/부정적 반응 농도 및 패턴의 해석에 대 한 훈련은 중요 합니다. 형 간염 2 IIF 분석 실험 절차, 현미경 구성 및 최종 사용자 교육 또는 기술 표준화의 부족으로 취약 하다. 합의 명명법과 대표 패턴 및 다양 한 제조 업체를 사용 하 여 인수 하는 이미지의 예 수에 의해 만들어집니다 ICAP (< www.ANApatterns.org>) 교육 목적4. 형 간염-2 셀 패턴 분류 트리 ICAP에 의해 제공 하는 다양 한 핵, 세포질, mitotic 패턴에 대 한 다양 한 패턴 연습을 쌓지 않은 눈4와 비슷한 보일 수 있습니다 사이의 미묘한 차이 배울 수 귀중 한 자원 이다. 면역 상태와 뚜렷한 협회 부족 DFS70 도전 패턴의 기본 예의 하나 이며 이전 섹션에서 설명한 대로이 패턴은 매우 건강 한 인구5에서 유행 이다.
연구에 따라 안티-DFS70 신경의 보급 달라 건강 한 동료 애 나 심사 인구, 그리고 아나 긍정적인 개인 조직의 자가 면역 질환9,16,20의 증거와 ,,3031. DFS70 신경 절연 뿐만 아니라 다른 질병 관련 된 아나 패턴 발생 보고 되었습니다. 절연 또는 monospecific DFS70 패턴 건강 한 컨트롤의 2-22%에서 하지만 자가 면역 류 마티스 질환32케이스의 1% 미만에서 보고 됩니다. 이러한 추세에 따라, DFS70 모노-긍정적인 패턴 ICAP 위원회3,,3132에 의해 면역 류 마티스 질환에서 제외 하는 조건으로 제안 했다. Autoantibody 테스트 명명법의 조화 및 애 나 보고 하는 동안 DFS70 양성을 보고 권장 형 간염 2 IIF 결과의 해석에 설립 ICAP 위원회 검사 결과4.
배제 DFS70 모노-양성 기반 조직 자기 면역 질병, 이전 현재 심사 및 확인 방법 (특히 DFS70에 대 한 그 특정)의 상태를 검토 생명 이다. DFS70 형 간염 2 IIF 및 단단한 단계의 확실 한 분석 즉 ELISA 양성, CLIA, 및 선 immunoassay/점 오 점 방법 사이 계약) 다양 한 연구13,,2225,33 사이 널리 다양 . 이 불일치에 기여 하는 매개 변수 왔다 IIF 해석 및 확실 한 분석 결과 이전5,13,34을 논의 했다. 안티-DFS70 항 체 확인에 대 한 최근 제안 된 immunoadsorption 접근 (DFS70)에 대 한 일부 현재 단단한 단계의 분석 실험의 결함을 해결 하지만 의심된 샘플에 IIF 절차에서 추가 단계를 수행 하는 연구소는 결과13보고 비용과 처리 시간을 증가 시킵니다. 형 간염-2 엘리트/DFS70 코 셀 루틴 아나 심사에 대 한 사용 하는 경우이 추가 단계가 필요 하지 않습니다. 이 전체 비용 고 또한 처리 시간에 영향을 주지 않습니다 DFS70 패턴은 초기 심사에서 분별27단계입니다. 기존의 형 간염 2 IIF 메서드를 사용 하 여 추가 단점은 공동 발생 다른 아나 패턴 심사 단계에서 DFS70 패턴을 구별할 수는 것입니다. 그러나,이 불리는 형 간염-2 엘리트/DFS70 코 셀27의 사용에 의해 극복 된다.
기존의 형 간염-2와 새로운 조작된 형 간염-2 (형 간염-2 엘리트/DFS70 코) 아나 긍정적인 컨트롤 사용 및 그들의 조합 모노-긍정적인 DFS70 제어와의 비교 평가 동시에 새로운 기판의 능력을의 유틸리티 설명 아나 스 화면 하 고 DFS70 패턴 (그림 1)를 확인 합니다. 새로운 기판에 대 한 IIF 프로토콜은 기존의 형 간염 2 IIF 메서드를 동일 합니다. 모든 질병에 관련 된 아나 패턴에 대 한 해석 체계는 DFS70 패턴 (표 1)를 제외 하 고 동일 합니다. 모노-긍정 및 혼합 DFS70 패턴의 해석 상대적으로 쉽게 새로운 메서드를 사용 하 여 고 추가 분석 (그림 1B)를 보증 하지 않습니다. 임상 실험실에서이 새로운 방법의 구현 DFS70 패턴의 해석 연관 도전을 간소화 하 고 질병 관련 추가 공개 애 나 패턴에 의해 은폐 이전 심사 아나의 전반적인 정확도 향상 DFS70 (혼합 패턴)입니다.

아나 스 면역 중재 조직 결합 조직 질병1의 특징입니다. 여러 가지 방법은 심사와 아나 스의 확인에 대 한 고용 됩니다. IIF 기술 형 간염 2 기판 남아를 사용 하 여 가장 널리 사용 하 고 자주 아나 스1,2심사 방법 추천. 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA), 효소 immunoassay (EIA), 화학 immunoassay (CLIA), 구슬 기반 다중 분석 등 단단한 단계의 진단 분석 방법론의 발전에도 불구 하 고 형 간염-2 IIF는 가장 널리 상영 진단 유용성 및 비용 효율성1,2,3방법. 순화 된 네이티브의 제한 된 집합에 의존 하는 위에서 언급 한 분석 결과 기술 또는 재조합 autoantigens 형 간염-2 셀 단층 준비 유리 슬라이드 우물에 그들의 자연적인 형태로 autoantigens의 광범위 한 배열을 제공 하는 반면에 분산 핵과 세포질을 환자 세라 또는 결과 다양 한 다양 한 면역 상태와 관련 된 패턴에에서 긍정적인 컨트롤에서 신경으로 반응 합니다. 이러한 패턴은 세포에 항 원의 위치에 따라 핵, 세포질와 mitotic 패턴으로 분류 됩니다. 각 패턴 및 관련된 항 원/항 질병 상태는 잘 특징된4. IIF 방법에 환자 및 제어 세라 autoantigens 그들의 자연적인 구성에서의 군중을 유지 하기 위해 적절 한 고정 형 간염-2 세포의 단층 문화를 제공 하는 유리 슬라이드 우물에 알을 품는. 환자 혈 청 또는 긍정적인 컨트롤에 신경 외피 동안 형 간염-2 셀 기판 (유리 슬라이드 잘)에 제시한 autoantigens에 바인딩할 수 있습니다. 게시물 인큐베이션, 언바운드 항 체는 씻어 하 고 바운드 항 체 IgG 클래스의 fluorescein/fluorescein isothiocyanate (FITC) 활용 안티 인간 IgG 시 약 검색 됩니다. 언바운드 보고 공액 씻 고 유리 coverslips 반응을 유지 하 고 형광 현미경 관찰을 용이 하 게 장착 매체를 사용 하 여 슬라이드 위에 거치 된다. 반응을 사용 하는 기자에 의하여 구성 된 적절 한 자극 방출 필터 조합을 갖춘 형광 현미경 관찰 된다 (FITC 기자에 대 한 진단 현미경 일반적으로 사용 하 여 필터 467의 구동 범위 -498 nm 및 513-556 nm의 방출 범위). 애 나의 존재는 셀에 특정 구조의 밝은 녹색 형광에 의해 증명 됩니다. 자동된 분석 결과 플랫폼, 달리 IIF 방법론은 세라와는 중요 한 사용자 전문성5,6얼룩 패턴의 시각적 긍정적인 결정을 diluting 직렬의 힘 드는 과정에 의존 합니다. 이러한 제한에도 불구 하 고 IIF 형 간염-2로 가장 널리 사용 되 있고 패턴 (ICAP) 위원회, 아나에 국제 합의 의해 패턴 해석 및 명명법으로 표준화 노력으로 인해 아나 스의 심사 방법 권장 IIF 슬라이드 처리, 그리고 결과 해석3에 대 한 자동화 솔루션의 증가 가용성.
Psip1 유전자 제품 (LEDGF/p75/DFS70 라고도 함)을 대상으로 하는 자가 형 간염 2 IIF 메서드에서 검색 패턴의 무리 중, 최근 몇 년 동안 몇 가지 이유로4,5에에서 상당한 관심을 얻고 있다 ,6,,78,,910. DFS70 신경 건강 한 컨트롤, 높은 titers에 존재 하 고 지금까지 연구 DFS70 신경7,,89 의 존재에 대 한 뚜렷한 임상 협회를 설명 하기 위해 실패 10,11,,1213. 다양 한 질병 상태와 건강 한 동료 연구6,,89,10,14 사이 널리 다양 한 DFS70 신경에 대 한 긍정적인 결과 보고 속도 ,15,16,17,18,19,20,,2122,23 ,,2425,26,,2728. Monospecific DFS70 패턴 잘 혼합된 균질 얼룩 패턴의 해석 하지만 균질 또는 얼룩 덜 룩 한 패턴에서 차별화 된 그리고 다른 아나 스 공동 발생 방지-DFS70 항 체도 전문가 독자에 대 한 도전 이다. 심사 방법 및 DFS70 특정 단단한 단계의 분석 IIF의 현재 세대 monospecific DFS70 반응 혼합된 패턴 (그림 1A, 알고리즘의 노란색 음영된 지역)에서 분화 할 수 있다. 균질, 얼룩 덜 룩 한, DFS70 패턴 또는 혼합된 패턴, 또는 반대로, 오해는 환자 치료에 심각한 영향을 있을 수 있습니다. 현재 일반적으로 사용 되는 프로토콜은 다음과 같습니다: 아나 스 질병 관련에 대 한 단단한 단계의 확실 한 테스트의 수를 사용 하는 임상 실험실 / DFS70/LEDGF 때 고밀도 미세 얼룩 (AC-2) 패턴에 대 한 immunoadsorption 메서드 (그림 의심 되 1A)4,5.
이 프로토콜의 목표는 소설의 유틸리티 형 간염 2 IIF 기판 설계를 설명 하는 (형 간염-2 엘리트/DFS70 녹아웃 (KO), 것 이다 라고도 형 간염-2 엘리트)를 심사 하면서 동시에 아나 기존의 형 간염-2의 모든 장점을 유지 monospecific에 혼합된 아나 긍정적인 경우 (그림 1B, 알고리즘의 노란색 음영된 지역)5높은 자신감과 DFS70 패턴을 구별. 형 간염-2 엘리트 기판 수정 되지 않은 기존의 형 간염-2 셀과 1:9 비율5항 원 LEDGF/p75/DFS70 없는 조작된 셀의 대략적인 혼합물으로 구성 된다. 형 간염-2 엘리트의 IIF 절차는 기존의 형 간염 2 메서드를 동일 합니다. 형 간염-2 엘리트 기판의 독특한 구성 뿐만 아니라 기존의 HEp2의 모든 장점을 유지 하지만 초기 심사 또는 샘플 (그림 1B의 테스트에서 DFS70 패턴에서 균질, 얼룩 덜 룩 한, 그리고 혼합 반응 패턴을 분화 할 수 있다 )5. 환자 혈 청 형 간염 2 IIF 기판으로 슬라이드에 반응 하는 희석된 1:40 상영 희석 또는 개별 실험실 조건에 의하여 해야 한다. 1시 40분 또는 더 높은 titer에 특정 한 반응은 긍정적으로 간주 됩니다.
이 연구, 균질, 얼룩 덜 룩 한, centromere, nucleolar, 세포질 망상/의학 협회, 및 심사 (부정적인 제어 및 키트에서 제공 하는 긍정적인 아나 컨트롤)을 기준으로 중간 긍정적인 신호를 생성 하는 DFS70 패턴에 대 한 긍정적인 세라 1시 40분의 희석 형 간염 2 기판에 모노 및 혼합 패턴 시뮬레이션 선정 되었다 (기존의 고 형 간염-2 엘리트). 1:40 1시 40분으로 희석된 DFS70 긍정적인 세라 혼합 희석 개별 질병 관련 된 아나의 패턴 컨트롤 (균질, 얼룩 덜 룩 한, centromere, nucleolar, 또는 세포질 망상-AMA) 다양 한 비율 (제어: DFS70 100:0, 80:20, 50: 50, 과, 그리고 0:100) 전통적인 평가 형 간염-2 엘리트 기판 다음 아래에 설명 된 표준 IIF 절차.

<table><tbody><tr><td>HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 웰 슬라이드는 파우치에 개별적으로 밀봉</td>됨 <td>Trinity Biotech</td><td>키트# 1108, 1108-120, 1108-240</td><td></td></tr><tr><td>ANA 양성 대조군</td><td>Trinity Biotech의 일부;</td><td>키트# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>DFS70 항체 양성 대조군</td><td>트리니티 바이오테크</td><td>키트# 1108, 1108-120, 1108-240</td><td></td></tr>의 <tr><td>부분 음성 대조군</td><td>트리니티 바이오텍</td><td>키트# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>안티-휴먼 IgG FITC 접합체 에반의 파란색 대조염색</td><td>트리니티 생명공학</td><td>키트# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103의 부분 키트# 1108</td><td></td></tr><tr><td>, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td>의 혈청 <td>Trinity Biotech</td> 부분용<td>버퍼 희석제</td></tr> (<tr><td>PBS)</td><td>Trinity Biotech</td><td>키트# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 매체</td><td>Trinity Biotech</td><td>키트# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립 부분;</td><td></td><td>키트# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>ImmuGlo ANA HEp-2 셀 12 웰 슬라이드 키트</td><td></td><td># 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>연구에 사용되었지만 키트에서 제공하지 않는 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diagnostic fluorescent microscope</td><td>Nikon Eclipse 50i</td><td></td><td>Spot dignostic camera 장착, 모델 2.2.1</td></tr><tr><td>인큐베이션 챔버</td><td>Trinity Biotech</td><td></td><td>가 고객을 위해 제공됨(카탈로그 # 없음)</td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>n/a</td><td></td><td>일반 실험용품</td></tr><tr><td>종이 타월</td><td>N/A</td><td></td><td>일반 실험실 공급</td></tr><tr><td>증류수/탈이온수</td><td>N/A</td><td></td><td>일반 실험실 공급</td></tr></tbody></table>

monospecific 및 소설 형 간염-2 엘리트/dfs70 녹아웃 기판으로 아나 심사 중 혼합된 dfs70 패턴의 동시 구별

Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

조직 자기 면역 결합 조직 무질서는 반핵 항 체 (애 나) 순환 특징. 아나 심사에 사용할 수 있는 여러 기술이 있다, 간접 면역 형광 검사 (IIF) 인간 상피 세포-2 (형 간염-2) 기판을 사용 하 여 우수한 감도 때문에 기본 및 권장 방법 남아 있다. 형 간염 2 기판 다양 한 핵과 세포의 세포질을 통해 배포 하는 다양 한 단백질 및 핵 산 autoantigens autoantibody 바인딩에서 발생 하는 패턴을 검색할 수 있습니다. Monospecific 형 간염 2 기판에 긍정적인 반응에서 또한 인 혼합된 패턴의 큰 다양성 해석 및 보고의 정확도 복잡 하 게. 최대한 주의 최근에 받은 한 특정 예제에서는 밀도 괜 찮 얼룩 덜 룩 한 70 (DFS70) 패턴입니다 렌즈 파생 하는 상피 성장 인자 (LEDGF) 이라고 불리는 단백질에 특히 묶는 신경에서 유래. 명확한 연관 특정 조직의 자가 면역 질환 및 건강 한 인구에 있는 높은 보급의 중요 한 DFS70 패턴의 정확한 해석을 만들었습니다. 기존의 형 간염-2 기판을 사용 하 여 질병 관련 된 패턴에서 DFS70 패턴의 정확한 구별은 도전 이다. 또한, 균질, 얼룩 덜 룩 한, 및 혼합 균질 얼룩 패턴 등 질병 관련 패턴 함께 DFS70 패턴의 빈번한 起 IIF 해석 복잡 하 게. 이 백서의 목적은 소설의 유틸리티 동시에 둘 다에 높은 신뢰와 DFS70 패턴을 구별 하는 기능을 제공 하면서 기존의 형 간염 2 기판의 모든 장점을 유지 하는 형 간염 2 IIF 기판 설계를 설명 하는 monospecific 그리고 혼합된 아나 긍정적인 예입니다. 새로운 기판 수 정체 질환 관련 아나 패턴 이전 DFS70 패턴에 의해 은폐 하 더 이다.

간염-2 엘리트/DFS70 코 기판 고전적인 아나 패턴을 유지 하 고 DFS70 패턴의 명확한 구별을 용이 하 게:
전통과 조작 셀 형 간염-2 엘리트/DFS70 고 기판에는 동일, LEDGF/p75 제외한 모든 autoantigens 보존 합니다. 키트에 의해 제공 하는 부정적인 제어 기준 형광 신호를 설정 합니다. 형 간염-2 엘리트에 균질, 얼룩 덜 룩 한, centromere, nucleolar, 그리고 미토 콘 드 리아 패턴에 대 한 긍정적인 컨트롤 기존의 형 간염 2 IIF 기판 (그림 2A)에 예상된 패턴을 동일한 패턴을 생성합니다. 이러한 참조 패턴 각 패턴의 항 원 및 질병 협회 함께 상세히에서 설명 되었습니다 이전4,29. 표 1에 그림 2A 에서 관찰 된 패턴에 대 한 간략 한 설명이 제공 됩니다.
형 간염-2 엘리트에 DFS70 패턴:
각 셀의 약 10% 잘 보여 고밀도 미세 얼룩 덜 룩 한 패턴 (ICAP 명명법을 할당: AC-2) 그 interphase 핵에 관찰 될 수 있다와 mitotic 핵 (그림 2B)에 본은 chromatin 관련 얼룩. 기존의 형 간염 2 기판에 모든 셀이이 패턴 DFS70 긍정적인 샘플 반응 때 할 것 이다. 형 간염-2 셀의 나머지 ~ 90% 기 절 LEDGF 항 원 인코딩 psip1 유전자 있고 따라서 신호 또는 패턴 monospecific DFS70 긍정적인 세럼 (그림 2B)와 반응 하는 때를 생성 하지 않습니다. 형 간염-2 세포의 10%에 DFS70 패턴 및 셀 현재 추가 패턴 (예를 들어, 잘 얼룩 덜 룩 한 또는 nucleolar)의 나머지 부분에 해당 하는 밝은 형광 있다면 혼합된 패턴의 존재를 나타냅니다. 이러한 패턴의 가까이 시험 DFS70 패턴 이외에 존재 하는 모든 autoantibody 특이성을 확인 필수적 이다. 형 간염-2 엘리트 기판, 샘플으로 만든 세라의 패널의 기능을 보여 주기 위해 DFS70와 아나의 다양 한 농도 세라를 제어 하 고 기존에 테스트 및 형 간염-2 엘리트 기판 표준 IIF를 사용 하 여 프로토콜 (그림 3 , 그림 4, 그림 5, 그림 6, 그림 7).
DFS70 Monospecific와 기존의 고 형 간염-2 엘리트 기판에 혼합된 반응의 해석:
각 특정 질병 관련 된 아나 패턴 (그림 3, 그림 4, 그림 5, 그림 6, 그림 7), monospecific 아나 왼쪽에 대부분 열 패턴 및 monospecific DFS70 맨 오른쪽에 패턴 관찰할 수 있습니다. 중간에 3 열 다양 한 질병 관련의 비율 및 DFS70 패턴 긍정적인 컨트롤을 나타냅니다. 결과 혼합된 패턴은 (그림 3, 그림 4, 그림 5, 그림 6, 그림 7, 맨 위 행) 기존 형 간염 2 기판에 분별을 도전. 그러나, 대부분의 예제를 소설 형 간염-2 엘리트 기판 셀 수정 되지 않은 및 설계 강도에 차이 별개 (때 밝은 덜 밝은 셀의 비율을 뿐만 아니라 DFS70 신경의 존재를 확인 1:9) 하지만 또한 보조 아나 패턴을 보여준다. 균질 DFS70 또는 얼룩-DFS70 혼합 반응, 자신 있게 다양 한 추가 분석 (그림 1A)를 실행 하는 실험실에 이르게 올바른 패턴을 예측할 수는. Centromere-DFS70 및 nucleolar DFS70 혼합 반응, DFS70 양성은 매우 도전적인 의심 (그림 5, 그림 6). Nucleolar 및 세포질 망상/의학 반응, DFS70 패턴은 지배적인 세라 비율 50%에 도달할 때까지. 모든 예에서 형 간염-2 엘리트 기판 DFS70 패턴을 제시할 수 있습니다 고 강도의 넓은 범위 기본 보조 패턴 레벨 따라서 더 정확한 아나 해석을 용이 하 게 한다.
에 밀접 하 게 혼합된 패턴, 아나 고 DFS70 긍정적인 컨트롤 했다 확대 (그림 8) 모두 기존의 고 형 간염-2 엘리트 기판의 다양 한 50: 50 조합에 대 한 결과 관찰 합니다. 그것은 interphase와 mitotic 얼룩 해석 및 보고 된 패턴의 정확도 향상을 형 간염 2 기판에 DFS70를 포함 하 여 모든 아나 패턴에 대 한 관찰을 권장 합니다. 그러나, 혼합 패턴, 세포 핵을 나누어 제시 차동 패턴 정확한 해석을 용이 하 게 하기에 충분 하지 않을 수 있습니다. 빨간색 화살표 (그림 8) 설계와 기존의 셀에 mitotic 핵을 나타냅니다. 그것은 혼합 반응 셀 분할에 준수 하지 않는 DFS70 질병 관련 된 해석에 대 한 규칙의 설립된 세트와 함께 애 나 패턴을 관찰할 수 있습니다. 노란색과 파란색 화살표 수정 되지 않은 (DFS70 KO) 형 간염-2 설계 된 세포 핵, 각각 나타냅니다. 모든 조합 (그림 8), 분명 강도 차이가 수정 되지 않은 세포 핵 얼룩 (~ 10%)와 조작된 세포 핵 (~ 90%) 패턴 같은 현미경 시야에서 관찰, 동시 상영을 가능 하 게 하 고 DFS70 패턴의 확인입니다.
<img alt="HEp-2, DFS70 IIF 방법을 사용한 ANA 스크리닝 알고리즘 다이어그램; 진단을 위한 ELISA, EIA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: 아나 기존의 형 간염-2 고 형 간염-2 엘리트/DFS70 코 IIF 메서드를 사용 하 여 알고리즘을 심사. (A) 회로도 unravels 심사 단계 (노란색 음영된 지역)에서 monospecific 및 혼합된 DFS70 긍정적인 패턴 식별에서 기존의 형 간염 2 IIF의 결핍 및 질병 관련 보조 아나 패턴을 배제 하지 못하는 수 있습니다 DFS70 패턴에 의해 감춰 될. 또한, 현재 세대의 DFS70 특정 단단한 단계의 확실 한 분석은 아나 스에 대 한 추가 확인 테스트에 이르게 monospecific DFS70 양성 확인 수 없습니다. (B) 회로도 아나 스, monospecific 및 혼합된 DFS70 반응의 동시 구별의 심사에 대 한 형 간염-2 엘리트의 기능을 보여 하 고 단단한 단계 DFS70에 대 한 필요성을 없애 확인 분석 실험. 크게 형 간염-2 엘리트를 사용 하 여 알고리즘 아나 심사 간소화 되 고 확인 분석 실험의 필요한 수를 감소 시킨다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="HEp-2 기판 ANA 패턴 분석; 현미경, 패턴 식별, DFS70 세포 비교." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: 클래식 애 나 및 DFS70 패턴 형 간염-2 엘리트/DFS70 고 기판에. (A) 형 간염-2 엘리트/DFS70 고 기판 고전적인 아나 패턴 유지. 고전적인 균질 반응 및 DFS70 긍정적인 반응 키트에서 제공 하는 긍정적인 컨트롤을 사용 하 여 생산 되었다. 다른 반응 얼룩 덜 룩 한, centromere, nucleolar, 그리고 세포질 망상/의학 반응5에 대 한 이전 설립된 긍정적인 제어 세라를 사용 하 여 제작 했다. (B) 형 간염-2 엘리트/DFS70 고 기판 설계와 기존의 셀, DFS70 패턴의 쉬운 구별을 용이 하 게 제공 합니다. 회로도 결과 DFS70 monospecific 반응 패턴 interphase에 얼룩이 기존의 고 설계 (DFS70-KO) 셀에 대 한 세포 핵을 나누어 보여 줍니다. 설계 형 간염-2 세포는 일반적으로 기존의 형 간염 2 기판에 DFS70 autoantibody 반응에 의해 은폐 보조 패턴의 동시 탐지를 가능 하 게 LEDGF/p75/DFS70 항 원 없는. 화살표 (노란색) mitotic 세포 핵의 예를 나타냅니다. 스케일 바 대표 20 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="형광 현미경, 세포 염색 비교, HEP-2 세포, DFS70 자가항체 검출." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3: DFS70와 조합에 균질 세라. DFS70 monospecific 세라 다양 한 비율 (100:0, 80:20, 50: 50과, 및 0:100)에 긍정적인 균질 패턴 제어와 결합 하 고 기존의 고 설계 (DFS70-KO) 형 간염-2 기판에서 테스트 했다. 스케일 바 대표 20 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Hep-2 세포 형광 현미경; 단백질 국소화; 실험 결과; 세포핵; 얼룩덜룩한 패턴." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 그림 4: DFS70 세라 조합에 얼룩 및. DFS70 monospecific 세라 다양 한 비율 (100:0, 80:20, 50: 50과, 및 0:100)에 긍정적인 얼룩 덜 룩 한 패턴 제어와 결합 하 고 전통과 설계 (DFS70-KO) 형 간염-2 기판에서 테스트 했다. 스케일 바 대표 20 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="면역형광 현미경, HEP-2 세포, 센트로미어 대 DFS70 항체 염색, 형광 강도." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 그림 5: 조합에서 DFS70 및 centromere 세라. DFS 70 monospecific 세라 다양 한 비율 (100:0, 80:20, 50: 50과, 및 0:100)에 긍정적인 centromere 패턴 제어와 결합 하 고 전통과 설계 (DFS70-KO) 형 간염-2 기판에서 테스트 했다. 스케일 바 대표 20 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="핵소체 DF570 염색을 통한 HEP-2 세포의 형광 현미경; 실험 및 분석 결과." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 그림 6: DFS70와 함께에서 nucleolar 세라. DFS 70 monospecific 세라 다양 한 비율 (100:0, 80:20, 50: 50과, 및 0:100)에 긍정적인 nucleolar 패턴 제어와 결합 하 고 기존의 고 설계 (DFS70-KO) 형 간염-2 기판에서 테스트 했다. 스케일 바 대표 20 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Hep-2 세포 면역형광, 세포질 망상 패턴, DFS70 항체, 현미경 결과." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig7.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> 그림 7: DFS70와 조합에 세포질 망상/의학 세라. DFS70 monospecific 세라 다양 한 비율 (100:0, 80:20, 50: 50과, 및 0:100)에 긍정적인 미토 콘 드 리아 패턴 제어와 결합 하 고 기존의 고 설계 (DFS70-KO) 형 간염-2 기판에서 테스트 했다. 스케일 바 대표 20 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="HEp-2 및 DFS70-KO 세포의 형광 현미경 비교, 핵 염색 패턴 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig8.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 8"> 그림 8: 혼합 패턴 (50: 50 비율) 기존에 생산 고 형 간염-2 엘리트 기판. 두 기판 사이의 차이 계시 했다. 빨간색 화살표는 두 기판 설계와 기존의 셀에 mitotic 핵을 나타냅니다. 이러한 조합에 대 한 기존의 형 간염-2 기질에 세포 핵을 나누어 제시 차동 패턴 혼합된 패턴의 정확한 해석에 대 한 충분 하지 않습니다. 세포 분열에 혼합된 DFS70 반응 수 교란 질병 관련 된 해석에 대 한 규칙의 설립된 세트 애 나 패턴을 관찰할 수 있습니다. 노란색과 파란색 화살표 수정 되지 않은 (DFS70 KO) 형 간염-2 설계 된 세포 핵, 각각 나타냅니다. 모든 조합에 대 한 얻은 결과 설계 기판에 테스트: 분명 강도 차이에 속하는 interphase 핵 패턴 수정 되지 않은 셀 (~ 10%)와 조작된 셀 (~ 90%)은 관찰, 활성화 동시 검색 및 DFS70 패턴의 확인 스케일 바 대표 20 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>아나 패턴</td>
			<td colspan="2">설명</td>
		</tr>
<tr>
<td>균질</td>
			<td colspan="2">전체 핵 fluoresces 확산 얼룩 패턴으로 균등 하 게.</td>
		</tr>
<tr>
<td>얼룩</td>
			<td colspan="2">이산, 얼룩의 벌금 굵고 핵에 걸쳐 형광.  미세 얼룩 덜 룩 한 하 고 거친 얼룩 덜 룩 한 패턴 설명 되었습니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nucleolar</td>
			<td colspan="2">nucleoli 핵 내의 여러 고체 또는 얼룩 덜 룩 한 시체로 얼룩. 하위 이전 설명 했습니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Centromere</td>
			<td colspan="2">한정 된 수의 큰 얼룩입니다. 반응 항 원 세포 유사 분열을 겪고 있는 압축 된 염색체와 분리.</td>
		</tr>
<tr>
<td>세포질 망상/의학</td>
			<td colspan="2">세포질은 미토 콘 드리 아의 긍정적인 얼룩과 세분화 된 나타납니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">DFS70</td>
			<td colspan="2">•Conventional 형 간염-2 셀: 고밀도 미세 얼룩 덜 룩 한 패턴 mitotic 핵에 볼 얼룩 interphase 핵 chromatin 관련에 관찰.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">•Engineered DFS70 코 셀: 안티-DFS70 항 체 생산 부정적인 얼룩이 지기</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">형 간염-2 엘리트 DFS70 코 / 약 1:9 비율에, 기존의 고 설계 (DFS70 KO) 세포. 기존의 셀 전형적인 DFS70 패턴을 생성 하 고 조작된 셀 DFS70 monospecific/절연의 긍정적인 반응으로 반작용 하는 때 부정적인 패턴을 생성.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 아나 패턴의 설명.

DFS70 자가 기존의 형 간염-2 기질을 사용 하는 경우 정확한 해석을 도전 만드는 일반적인 반핵 항 체 질병 관련 된 패턴을 모방. 프로토콜에서는 기존의 형 간염-2 검사 및 monospecific 및 혼합된 아나 긍정적인 경우에 높은 신뢰와 DFS70 패턴을 구별 아나 소설 조작된 형 간염 2 기판의 이점을 설명 합니다.

Monospecific 및 소설 형 간염-2 엘리트/DFS70 녹아웃 기판으로 아나 심사 중 혼합된 DFS70 패턴의 동시 구별

Systemic autoimmune connective tissue disorders are characterized by circulating antinuclear antibodies (ANA). Although there are several technologies ...

이 절차의 전반적인 목표는 Novel HEp-2, Dense fine speckled 70 knockout 기질을 사용하여 항핵 자가항체를 스크리닝하고 단일특이성 및 혼합 고밀도 미세 반점 70 패턴을 동시에 확인하는 개선된 간접 면역형광 분석을 입증하는 것입니다. Novel HEp-2 기질은 ANA라고도 하는 임상적으로 관련된 항핵 항체의 스크리닝을 위해 표준, 간접 면역형광 절차 및 해석 기준을 사용합니다. 주요 장점은 스크리닝 단계에서 조밀하고 미세한 반점이 있는 70 패턴을 질병 관련, 균질한 반점 패턴 또는 까다로운 혼합 패턴과 구별할 수 있다는 것입니다.절차를 시연하는 것은 품질 관리 실험실의 기술자인 Sofia Badanin이 맡습니다. 기판 슬라이드의 경우, 기존 HEp-2 셀 또는 기존 및 조밀한 미세 반점 70 knockout HEp-2 셀의 혼합물을 포함하는 각 슬라이드에 12개의 웰이 있는 유리 슬라이드를 사용합니다. 기질 슬라이드가 들어 있는 파우치가 최적의 성능을 위해 실온과 평형을 이루도록 하고 샘플을 추가하기 전에 슬라이드 표면의 수분이 응결되는 것을 방지합니다.이 작업은 10분에서 15분 정도 소요됩니다. 실온과 평형을 이루면 슬라이드와 파우치 측면 사이의 접촉을 피하고 손가락을 사용하여 기판 슬라이드를 조심스럽게 제거합니다. 슬라이드에 라벨을 붙이고 샘플과 접합체 배양 중 슬라이드가 건조되는 것을 방지하기 위해 축축한 종이 타월을 깐 배양 챔버에 넣습니다.약 50마이크로리터의 음성 대조군과 양성 대조군과 희석된 환자 혈청을 개별 슬라이드 웰에 분배한 후 슬라이드를 배양 챔버에 넣습니다. ANA 검사는 자가면역 질환을 선별하는 첫 번째 단계입니다. 위양성 또는 위음성 결과를 최소화하기 위해 슬라이드에서 환자 샘플의 교차 오염을 피하는 것이 중요합니다.웰 교차 오염을 방지하려면 웰을 과도하게 채우지 마십시오. 배양실에 뚜껑을 놓고 실온에서 30분 동안 슬라이드를 배양합니다. 환자의 혈청에 ANA가 존재하는 경우, 이 기간 동안 각 의지에 존재하는 세포에 결합합니다.배양 기간이 끝나면 배양 챔버에서 슬라이드를 제거합니다. 탭 끝에서 슬라이드를 잡고 약 10ml의 재구성된 인산염 완충 식염수 세척 버퍼로 10-15초 동안 부드럽게 헹굽니다. 슬라이드를 PBS 세척 버퍼가 있는 Coplin 용기에 즉시 옮기고 10분 동안 담가둡니다.나머지 모든 슬라이드에 대해 이 과정을 반복합니다. Coplin 용기에서 한 번에 하나의 슬라이드만 제거합니다. 슬라이드에서 여분의 PBS 세척 버퍼를 제거하려면 종이 타월로 슬라이드를 가볍게 두드리거나 닦아냅니다.각 웰에 항인간 IgG 형광 접합체라고 표시된 플루오레세인 이소티오시아네이트 한 방울을 부드럽게 바릅니다. 그런 다음 밀폐된 염색 배양실에서 슬라이드를 30분 동안 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 배양 챔버에서 슬라이드를 제거합니다.탭 끝에서 슬라이드를 잡고 이전과 같이 약 10ml의 PBS 세척 버퍼로 부드럽게 헹굽니다. 슬라이드를 PBS 세척 버퍼가 있는 Coplin 용기에 즉시 옮기고 10분 동안 담가둡니다. 키트에 제공된 커버 슬립을 마른 종이 타월 위에 놓습니다.커버 슬립의 하단 가장자리에 장착 매체를 일렬로 3-4방울 떨어뜨립니다. 다음으로, 세척 버퍼가 들어 있는 Coplin 용기에서 한 번에 하나의 슬라이드를 꺼냅니다. 여분의 세탁 버퍼를 제거하려면 종이 타월의 슬라이드를 가볍게 두드리거나 닦아내십시오.슬라이드에 과도한 양의 세탁 버퍼를 남겨두거나, 커버 슬립에 너무 많은 압력을 가하거나, 기포가 유입되지 않도록 하십시오. 이 모든 것은 세포 형태, 그에 따른 형광 패턴 및 반응 강도에 영향을 미칠 수 있습니다. 슬라이드의 아래쪽 가장자리를 커버 슬립의 가장자리에 놓아 슬라이드를 커버 슬립 위로 부드럽게 내립니다.이렇게 하면 커버 슬립에 있는 장착 매체가 슬라이드의 상단 가장자리로 흐르고 각 웰을 읽는 데 방해가 될 수 있는 기포 형성을 최소화할 수 있습니다. 암실에 있는 플루오레세인 이소티오시아네이트 필터 세트를 사용하여 형광 현미경으로 슬라이드를 봅니다. 200배 이상의 배율로 현미경으로 샘플의 특정 밝은 녹색 형광을 검사하여 양성 및 패턴에 대한 최종 해석을 내립니다.양수 및 음수 대조군을 관찰합니다. 양성 대조군은 핵에 밝은 녹색 형광을 표시합니다. 네거티브 컨트롤은 형광 현미경에서 특정 녹색 형광을 표시하지 않습니다.각 웰에 대한 양성 또는 음성 결과를 기록하고 양성 사례에 대한 ANA 패턴을 포함합니다. HEp-2 조밀하고 미세한 점점이 있는 70 녹아웃 기질은 모든 주요 핵 및 세포질 패턴을 보존합니다. 조밀하고 미세한 반점 패턴은 유사분열상(mitotic phase)에서 계면핵(interphase, nucleus)과 염색질(chromatin) 전체에 걸쳐 균일하게 분포된 반점 염색이 존재하는 것이 특징입니다.조밀한 미세 점점이 있는 70 항원을 발현하는 기존의 HEp-2 세포와 항원이 없는 엔지니어링된 HEp-2 세포의 존재는 기존 HEp-2 기질의 모든 장점을 유지하면서 조밀한 미세 점점이 있는 70 패턴을 정확하게 구별할 수 있도록 합니다. 주요 질병 관련 ANA 패턴에 대한 혈청 양성을 조밀하고 미세한 반점이 있는 70 패턴 양성 혈청과 동일한 비율로 혼합하고 기존 HEp-2 및 HEp-2 조밀하고 미세한 반점이 있는 70 녹아웃 기질 모두에서 테스트했습니다. 여기서 빨간색 화살표는 유사분열 단계에 있는 세포를 나타냅니다.노란색 화살표는 기존의 HEp-2 핵을 나타내고 파란색 화살표는 조작된 HEp-2 핵을 나타냅니다. 묘사된 모든 반응 조합에 대해 조밀하고 미세한 반점이 있는 70 녹아웃 기질은 동일한 시야에서 변형되지 않은 세포와 엔지니어링된 세포 간의 명확한 강도 차이를 보여줍니다. 이는 mono-specific적 및 혼합된 조밀한 fine speckled 70 반응을 구별하는 데 도움이 됩니다.핵 및 세포질 항원에 대한 자가항체는 전신 자가면역 질환에서 매우 흔합니다. PSIP1 단백질이라고도 하는 DFS70에 대한 자가항체로 인한 조밀하고 미세한 반점 패턴은 건강한 인구 집단에서 매우 흔한 것으로 보고되었습니다. 또한 이러한 DFS70 자가항체는 다른 질병 관련 ANA와 마찬가지로 단독으로 발생합니다.따라서 임상 실험실에서 이 패턴을 다른 질병 관련 패턴과 정확하게 구별하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 루푸스와 관련된 혼합된 균질한 반점 패턴에서는 여러 확인 분석이 필요한 DFS70 패턴으로 잘못 해석될 수 있습니다. HEp-2 기질을 사용하는 간접 면역형광 방법은 ANA에 대한 황금 표준 스크리닝 방법으로 간주됩니다.그러나 정확도는 기술자의 기술, 개별 단계의 신중한 실행 및 결과 패턴의 정확한 해석에 크게 좌우됩니다. 반대로, 기존 HEp-2 및 DFS70 녹아웃 기판의 비교 평가는 ANA를 스크리닝하는 동시에 DFS70 패턴을 높은 신뢰도로 구별하는 데 있어 이 새로운 기판의 유용성을 보여줍니다. 단양성 및 혼합 DFS70 패턴에 대한 추가 해석은 이 개선된 HEp-2 기질을 사용하여 상대적으로 단순화되었습니다.새로운 기질은 임상적으로 관련된 모든 ANA 패턴에 대해 표준, 간접 면역형광 프로토콜과 확립된 해석 기준을 사용합니다.

simultaneous-distinction-monospecific-mixed-dfs70-patterns-during-ana

Research

연구

JoVE Journal

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