Heparinized StarPEG Nanocoating와 췌 장 독도의 표면 공학

이 방법은 면역 거부 반응, 이식 후 섬 혈관 재생술 및 생존과 같은 췌장 섬 이식의 주요 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 채택하기 쉬운 이 접근 방식이 췌장섬의 세포 지형을 재형성하여 살아있는 세포의 표면 엔지니어링을 가능하게 하고 이식 기능, 생존 및 궁극적으로 섬 이식의 치료 효능을 향상시킬 것이라는 것입니다. 이 기술의 의미는 세포 기반 치료로 확장되는데, 이는 세포 기반 치료의 치료 결과가 낮은 세포 보유율과 낮은 생존율로 인해 제한되기 때문입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Jingyi Yang입니다. 먼저 헤파린 6.9g의 무게를 싣고 Eppendorf 튜브에 얼음처럼 차가운 탈이온수 2ml에 녹입니다. NHS 0.23g을 Eppendorf 튜브에 얼음처럼 차가운 탈이온수 0.5ml에 녹입니다.

그런 다음 50ml 원뿔형 튜브에 0.5ml의 얼음처럼 차가운 탈이온수에 EDC 0.77g을 녹입니다. NHS 및 EDC 용액을 50ml 원뿔형 튜브에 혼합합니다. 혼합액을 실온에서 30분 동안 방치한 후, 12, 000 RPM에서 10분 동안 원심분리하여 과잉 EDC 및 NHS를 제거한다.

그런 다음 용액에 30ml의 차가운 에탄올을 넣고 12, 000RPM에서 10분 동안 원심분리합니다. 이제 10ml 원뿔형 튜브에 50%starPEG MI 보조제 1ml를 추가합니다. 그런 다음 동일한 50ml 원추형 튜브에 0.67ml의 10% Heparin NHS 용액을 추가합니다.

혼합된 용액을 섭씨 25도의 인큐베이터에 20분 동안 넣어 점성이 있는 투명한 용액을 얻습니다. 이전에 추출한 200개의 마우스 섬을 해부 현미경으로 직접 선택하고 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 섬에 PBS 500마이크로리터를 추가하고 섭씨 4도에서 1분 동안 1, 200RPM으로 원심분리합니다.

상층액을 제거하고 헤파린 PEG 용액 250마이크로리터를 첨가한 다음 혼합물을 얼음에 10분 동안 놓습니다. 섬이 Heparin PEG 용액과 잘 섞일 수 있도록 위아래로 피펫을 사용합니다. 그런 다음 혼합물을 1, 200 RPM에서 1 분 동안 원심 분리하십시오.

그런 다음 상등액을 제거하고 PBS 500마이크로리터를 첨가합니다. 피펫을 위아래로 잘 섞습니다. 1, 200 RPM에서 1분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하고 나중에 사용할 수 있도록 섬을 보관하십시오.

다음으로, 코팅된 섬에 10% FBS를 보충한 RPM I 1640 1-2밀리리터를 추가합니다. 그리고 이 섬을 전하가 되지 않은 멸균 박테리아 배양 접시로 옮깁니다. 마지막으로, 도립 형광 현미경으로 FAM-Heparin-PEG 코팅 섬의 형태와 형광 신호를 관찰합니다.

HYDROXAL 그룹에 해당하는 특징적인 헤파린 피크가 Heparin-PEG 나노코팅 FTIR 스펙트럼에서 관찰되었습니다. 이러한 피크의 진폭 감소는 star-PEG MI aid 아미드 그룹과 Heparin 탄소 그룹 사이의 결합을 나타냅니다. 아미드 탄소 스트레칭 진동에 해당하는 피크도 감소했는데, 이는 헤파린 카르복실레이트기와 수시니미드 수소네이트 및 스타-PEG MI 에이드 아민 사이의 충분한 반응을 나타냅니다.

전자 현미경 데이터를 스캔하면 Heparin-PEG 나노코팅의 고도로 상호 연결된 다공성 구조를 볼 수 있으며, 이는 in vivo 전달 중 세포 생존에 적합할 수 있음을 시사합니다. 녹색 형광으로 표시된 나노 코팅의 얇은 층은 코팅된 섬의 표면을 가로질러 균일하게 증착되었으며, 섬의 부피나 크기에 명백한 변화를 일으키지 않았습니다. 헤파린-PEG로 코팅된 마우스 섬은 배양에서 강력한 섬 생존력을 보여주었습니다.

헤파린-PEG로 코팅된 섬과 공동 배양된 섬 내피 세포에서 훨씬 더 발전된 혈관 형성이 분명했으며, 이는 길쭉한 미세 혈관 같은 구조와 네트워크와 같은 혈관 구조로 나타났습니다. 모든 치료 그룹에서 낮은 수준의 인슐린 분비가 관찰되었는데, 섬에 생리학적 염 용액을 관류하고 준자극 수준의 포도당을 보충했을 때였습니다. 섬에 초생리학적 수준의 포도당을 자극했을 때, 인슐린 분비의 증가가 관찰되었습니다.

일단 마스터하면 섬의 생존력을 보존하기 위해 적절하게 수행되면 코팅을 1분 안에 완료할 수 있습니다.