Name: Heparinized StarPEG Nanocoating와 췌 장 독도의 표면 공학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: 학습하세요 헤파린-PEG 나노코팅을 이용한 췌장 섬 표면 공학 기법으로 이식 생존율과 기능을 향상시키는 방법을 배우세요. 이 기술은 세포 기반 치료의 효능을 높이는 데 활용됩니다.

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우리는 국립 자연 과학 중국 펀드 (31770968)와 천진 연구 프로그램의 응용 프로그램 기초 및 고급 기술 (17JCZDJC33400)의 재정 지원에 대 한 감사.

1. 헤 파 린 통합 Starpeg Nanocoating의 제조
<ol><li>
헤 파 린 succinimidyl 호박 (헤 파 린-보 건국)의 합성
	<ol>
<li>얼음 처럼 차가운 이온된 수의 2.0 mL에 용 해 및 헤 파 린의 0.69 g 밖으로 무게.</li>
		<li>둥근 바닥 플라스 크에 얼음 처럼 차가운 이온된 수의 0.5 mL에 용 해 및 보 건국의 0.23 g으로 무게.</li>
		<li>0.5 ml 둥근 바닥 플라스 크에 얼음 처럼 차가운 이온된 수의 분해 및 EDC의 0.77 g을 무게.</li>
		<li>둥근 바닥 플라스 크에 NHS 및 EDC 솔루션을 믹스. 실 온에서 30 분 동안 실 온에서 벤치에 혼합된 솔루션을 떠나.</li>
		<li>10 분 초과 EDC와 보 건국 제거 5,031 x g 에 EDC NHS 혼합물 원심</li>
		<li>혼합 솔루션을 10 분 동안 5,031 x g 에서 원심 분리기의 냉 에탄올 30 mL를 추가 합니다.<ol>
<li>두 번 반복 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
StarPEG-헤 파 린 nanocoating의 준비
	<ol>
<li>둥근 바닥 플라스 크에 10% (w/v) starPEG-(NH2)8 의 1.0 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>같은 둥근 바닥 플라스 크에 10% (w/v) 헤 파 린-NHS의 0.67 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>점도와 명확한 솔루션을 얻기 위해 20 분에 25 ° C에서 인큐베이터에 starPEG-(NH2)8 및 헤 파 린-보 건국의 혼합된 솔루션을 배치 합니다. 참고: 실험 붙일 레이블된 덤플링을 (FAM-헤 파 린) 필요 했다, 제작 절차는 같은 스타-말뚝-(NH2)8 은 물속에에서 녹아 있는 이온 5(6)-보충 carboxyfluorescein N-succinimidyl 에스테 르 0.1% (어 금 니 비율) starPEG-(NH2)8. )</li>
	</ol>
</li>
	<li>
푸리에 변환 적외선 분광학 (IR FT)에 의해 헤 파 린 못 nanocoating의 특성
	<ol>
<li>시작 하기 전에, 아세톤 및 이온된 수 옥수 박격포와 유 봉 산 장치 (작은 디스크 직경 13 m m)를 씻어. 사용 하기 전에 오븐에서 유리를 건조.</li>
		<li>좋은 KBr 분말의 200-250 mg와 혼합 약 0.1-1% 덤플링을 못 샘플.</li>
		<li>옥수 박격포에는 헤 파 린-고 케이시 혼합물을 배치 하 고 2 µ m의 직경을 가진 작은 알 약으로 정밀 하 게 격파.</li>
		<li>Pelleting 장치에 혼합물을 전송 합니다. 투명 한 펠 릿을 형성 하기 위하여 1-2 분 동안 진공에서 높은 압축 힘 (8 T/c m2)를 적용 합니다.</li>
		<li>부드럽게 당겨 pelleting 장치에서 샘플 펠 릿. 균열 발생을 하지 너무 하드 하지를 주의 해야 합니다.</li>
		<li>매우 신중 하 게는 푸리에 변환 적외선 분 광 기 샘플 화학 구조를 결정 하는 샘플 펠 릿 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
스캔 한 전자 현미경 (SEM) 의해 덤플링을 못 nanocoating의 내부 다공성 구조 시험
	<ol>
<li>다음 절차에 대 한 표준 48-잘 셀 문화 접시와 펫을 준비 합니다.</li>
		<li>48-잘 문화 접시의 우물에 헤 파 린 못 코 폴리머 솔루션을 플라스틱.</li>
		<li>24 h-80 ° C에서 플레이트를 고정 합니다.</li>
		<li>Lypophilize 진공 환경에서-50 ° C에서 샘플 (0.1 Pa) 24 h에 대 한.</li>
		<li>샘플 한 알루미늄 스텁의 스티커 표면에 걸쳐 확산.</li>
		<li>골드 샘플 코트 그리고 스캔 한 전자 현미경 내부 다공성 구조를 관찰 하 라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
원자 힘 현미경 (AFM)에 의해 헤 파 린 못 nanocoating 표면 검사
	<ol>
<li>실리 카 유리 슬라이드 피 솔루션을 청소 (70% H2이렇게4, 30% H2O2) 40 분 동안 80 ° C에서.</li>
		<li>10 분 동안 메탄올 그리고 10 분 동안 톨루엔에 슬라이드 sonicate</li>
		<li>진공 건조 하 여 슬라이드를 건조.</li>
		<li>3-aminopropyl-triethoxysilane 솔루션 (톨루엔에 2%), 부드럽게 흔들어 많은 슬라이드를 씻어.</li>
		<li>메탄올 톨루엔 10 분에서 10 분 동안에 슬라이드 sonicate</li>
		<li>표준 피 펫을 사용 하 여 슬라이드의 표면에 걸쳐 3% 덤플링을 못 솔루션의 장소 100 µ L.</li>
		<li>헤 파 린-못 된 원자 힘 현미경의 표면 검사 (50-80 kHz의 공 진 주파수 강제 0.350 N m 21, 600의 팁 반경 일정 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 마우스 섬 표면 공학 덤플링을 못 Nanocoating
<ol><li>
헤 파 린 못 nanocoating와 마우스 섬 표면 코팅
	<ol>
<li>콜라 소화와 histopaque 그라데이션 정화 이전 정돈19에 보고에 의해 마우스 독도 추출 합니다.</li>
		<li>1.5 mL 튜브에 해 부 현미경 200 독도 따</li>
		<li>독도를 1 분 동안 503 x g 에서 원심 분리기 PBS의 500 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>상쾌한 떨어져가지고 가십시오 덤플링을 못 솔루션의 250 µ L을 추가 하 고 10 분 아래로 덤플링을 못 솔루션와 잘 섞어 독도 수 있도록 피 펫에 대 한 얼음에 혼합물을 유지.</li>
		<li>1 분 동안 503 x g 에서 원심 분리기.</li>
		<li>제거는 상쾌한 고 PBS의 500 µ L를 추가 합니다. 여기저기 잘 혼합 플라스틱.</li>
		<li>1 분 동안 503 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 하 고 추가 사용 하기 위해 독도 유지. 마우스 독도 덤플링을 말뚝 코팅의 시험, FAM-헤 파 린-못 섬 코팅 다음 단계에 사용 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마우스 독도 식구 들-헤 파 린-말뚝 nanocoating 코팅의 시험
	<ol>
<li>보충 코팅된 독도 10% 태아 둔감 한 혈 청 RPMI 1640의 1-2 mL을 추가 하 고 이러한 독도 청구 비 살 균 세균성 문화 접시에 전송.</li>
		<li>거꾸로 형광 현미경 nanocoating 코팅 독도 식구 들-헤 파 린-못의 형태 및 형광 신호를 관찰 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 헤 파 린-말뚝의 기능 코팅 비 코팅 독도에 비해 마우스 독도
<ol><li>
헤 파 린-나무 못 코팅 마우스 독도의 생존
	<ol>
<li>헤 파 린-나무 못 코팅 마우스 독도의 20를 따 고 그들 셀 96 잘 문화 접시의 한 잘 합니다.</li>
		<li>10 웰 스의 총 각 잘 20 헤 파 린-나무 못 코팅 마우스 독도 채우십시오.</li>
		<li>Noncoated 제어 독도의 20를 따 고 그들 같은 셀 96 잘 문화 접시의 한 잘 합니다.</li>
		<li>10 웰 스의 총 각 잘 20 noncoated 제어 독도 채우십시오.</li>
		<li>독도 포함 하는 96 잘 접시의 각 음에 10% 태아 둔감 한 혈 청으로 보충 RPMI 1640의 200 µ L를 넣어 고 14 일에 대 한 문화에서 유지 합니다.</li>
		<li>섬 문화 미디어 2 일 마다 교체 합니다.</li>
		<li>라이브/죽은 문화에서 14 일의 끝에 키트를 얼룩이 지 고 거꾸로 형광 현미경 관찰로 독도 취급 합니다.</li>
		<li>거꾸로 형광 현미경 각 섬 내의 PI+ (적색) 셀을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
헤 파 린-말뚝의 revascularization 코팅 마우스 독도 체 외
	<ol>
<li>전 문화 접시를 포함 하 여 모든 실험 플라스틱을 냉각 하 고 피 펫 팁 사용 하기 전에 적어도 12 h.</li>
		<li>냉각 패드에 24-잘 장소를 놓습니다. 추가 250 µ L 얼음의 차가운 증가율 감소 Matrigel 24 잘 셀 문화 접시의 각 음에. 적어도 30 분 동안 4 ° C에서 코팅된 24-잘 접시를 놓습니다.</li>
		<li>냉장고에서 매트릭스 솔루션을 설정 하는 동안 마우스 췌 장 섬 내 피 마일 스벤 1 (MS1) 세포 trypsinize.<ol>
<li>조직 배양 플라스 크에서 모든 문화 매체를 제거 합니다. PBS의 5 mL로 플라스 크를 씻어.</li>
			<li>PBS를 제거 하 고 트립 신-EDTA의 3 mL를 추가 합니다. 표준 인큐베이터에서 3 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
			<li>가볍게 셀을 분리 하 여 혈 청 보충 미디어의 5 mL을 추가 플라스 크의 아래쪽을 누릅니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>15 mL 원심 분리기 튜브를 5 분 동안 1000 x g 에서 원심 분리기로 세포를 수집 합니다.</li>
		<li>오프는 상쾌한 고 PBS의 5 mL을 추가. 여기저기 잘 혼합 플라스틱.</li>
		<li>5 분 동안 1000 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 이륙.</li>
		<li>튜브에 혈 청 보충 DMEM 미디어를 추가 하 고 행렬 솔루션 코팅 24-잘 접시의 각 음에 50000 셀 씨.</li>
		<li>각 우물에 5 헤 파 린-나무 못 코팅 독도 또는 noncoated 제어 독도 추가 합니다.</li>
		<li>잘 당 500 µ L의 총 각 잘에 혈 청 보충 DMEM 미디어를 추가 합니다.</li>
		<li>가벼운 현미경 4 h 및 24 시간 보육 후 관 형성을 관찰 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
헤 파 린-나무 못 코팅 독도의 포도 당 자극 인슐린 분 비 참고:을 nanocoating 마우스 독도의 기능에 영향을 미칠 것 이라고, 헤 파 린-코팅 고 noncoated 독도의 포도 당 자극 인슐린 분 비는 평가 됩니다.<ol>
<li>한 1.5 mL 튜브에 30 헤 파 린-나무 못 코팅 독도 또는 noncoated 제어 독도 따. 10 튜브 코팅된 독도 대 한 총 및 noncoated 독도 준비 합니다.</li>
		<li>생리 적 소금물 2 mmol/L 포도 당20 보충의 1 mL을 추가 하 고 2 시간 동안 37 ° C에서 품 어. 참고: 생리 적 소금물 제조 법에 대 한 참조 하십시오 표1. 느슨한 인큐베이터에서 부 화 하는 동안 튜브의 뚜껑을 유지.</li>
		<li>가능한 많은 솔루션을 제거 합니다.</li>
		<li>30 분 동안 37 ° C에서 20 mmol/L 포도 당으로 보충 하는 생리 적 소금물의 600 µ L을 추가 하 여 독도 자극.</li>
		<li>ELISA 정량화 상업 인슐린 ELISA를 사용 하 여 키트 인슐린에 대 한 각 관에서 상쾌한의 200 µ L를 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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이 문서에서 설명 하는 생활을 위한 "쉬운-을 채택" 접근 세포 표면 덤플링을 통합 starPEG nanocoating는 nanocoating의 N-hydroxysuccinimide 그룹 간의 의사 bioorthogonal 화학을 통해 엔지니어링 및 췌 장 섬 표면 막의 아민 그룹입니다. 실제로, 세포 막 내에서 아미노 그룹은 반응성이 매우 높은, 그리고 그 결과, 이전 연구 보고가 생리 조건14에서 활성화 된 N-hydroxysuccinimidyl (NHS) 에스테 르 주 아미노 그룹 사이 상호 작용 ,,1621. 또한, 광범위 한 연구는 섬 캡슐화 동안 덤플링을 매우 sulphated glycosaminoglycan, 세포 외 매트릭스의 중요 한 분 대의 설립 향상 된 후 이식 이어질 수 보고 revascularization 그리고 감소 IBMIR22,23. 말뚝의 생체 적합성 및 헤 파 린의 multivalent 속성을 고려 하면 우리는 nanocoating의 제조 동안 로드 최대한 덤플링을 8 무장 못 사용. 헤 파 린-보 건국, 작은 섬 세포 막에-NH2 그룹과 반응 이후에 수정 되었다. 헤 파 린 통합 말뚝에 의해 공유 결합 형성 (세포 막)의-NH2 -NHS 형 간염-못의 사이 독도 것 쉽게 "코팅"을 함으로써 따라서는 췌장암의 외부 표면에 나노 얇은 레이어 (nanocoating)를 형성 독도입니다.
현재 방식은 다른 섬 미소-보 건국 (nanocoating)의 작은 섬 세포의-NH2 사이 그 의사 bioorthogonal 화학에 대 한 주요 폴리머로 못 선택 이전에 게시 방법 막 사용 되었다. 섬/셀의 그 안정성을 고려 하면 코팅, 플라즈마, 같은 복잡 한 환경에서 특히 중요 포스트 이식 revascularization 이며 생존, 보 건국-와-NH2 사이 형성 될 것 이라고 더 안정적인에 비해 세포 막이 고24, 정전기 상호 작용9,15,,2425,26 또는 생물 학적 연동 biotin 사이의 소수 성 상호 작용 streptavidin14.
또한, 섬 달리 코팅 접근 또한 멀티 레이어 증 착14,,1625, 현재 기술에 대 한 확장된 섬 처리 기간으로 LBL 방식을 사용 하는 필요 최소한의 처리 하 고 매우 짧은 코팅의 고립 된 독도의 기간. 이러한 요소 둘 다 이기 때문에 독도 생존 종종 이미 손상 된 다음 섬 고립 때문에 손상 된 ECM 효소 소화 하는 동안 후 이식 섬 생존을 위해 필수적입니다. 그러나, 현재 접근에의 한 제한, LBL을 통해 외부 코팅의 두께 증가 또는 층 증 착의 수를 감소에 의해 제어 수 달리 형 간염 페그 nanocoating의 두께 수 없습니다 맞출 시간이 되 고 이다.
또한, 보 건국-와-NH2 장소, 현재 접근 사이 화학 반응은 살아있는 세포에 대 한 적용 온화한 조건 때문 표면 하지 엔지니어링 췌 장의 작은 섬, 하지만 대부분 세포 치료 제한. 또한, 헤 파 린에 대 한 다양 한 cytokines 및 생물 학적 활성 분자와 상호 작용 알려져 고려, 형 간염 페그 nanocoating도 선물 잠재력이 무제한 생물 중재자의 설립에 대 한 오픈 플랫폼 뿐만 아니라 더 복잡 한 세포 표면 공학에 대 한 인터페이스입니다.

세포 기반 요법의 치료 효능은 낮은 세포 보존 및 가난한 생존1,2에 의해 제한 됩니다. 세포 치료의 결과 개선, 효소 조작 통해 표면 공학, 주문 펩 티 드 활용, bioorthogonal 화학 및 생체 재료와 물리적 캡슐화 되었습니다 악용된3,4, 5,6,7,8,,910. 현재 프로토콜 표면 공학 ultrathin 덤플링을 통합 starPEG (헤 파 린-PEG) nanocoating 세포 표면에 적용 하 여 "쉬운-을 채택" 방법을 사용 하는 살아있는 세포의 달성을 목표로 한다. 췌 장 독도의 표면 공학 제시 했다 독도 Langerhans과 현재 임상 작은 섬 이식의 비방 결과의 질적 특성으로 인해 예를 들어 여기.
실제로, 임상 작은 섬 이식 현재 격리 된 독도의 간 문맥으로 직접 주입 하 여 수행 되며이 절차만에 사용할 수 선택적 환자 기증자 재료와 낮은 치료 효능의 부족 때문에 11. 통상, alginate 되었습니다 섬 캡슐화 및 표면 수정에 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 소재 alginate과 관련 된 염증 성 섬유 증12, 화학 불안정성 때문 이상적 미만 이더라도 13. 또한, 100 ~ 200 µ m 사이 배열 하는 독도의 자연 크기에 비해, alginate 섬 microcapsules는 400와 800 µ m 사이 배열 하는 더 큰 산소의 생리 적 확산 거리를 초과 하는 있는. 등각 섬 캡슐화, 즉., 독도 섬 볼륨의 중요 한 변경 없이 캡슐화, 다음 개발 되었다. 따라서, nanomembranes의 페그, tetrafluoroethylene, 실리콘 막의 구성 또는 다층된 nanocoating (일컬어 "레이어-의해-레이어" [LBL] 기술) 향상 된 생체 외에서 섬 생존14 결과 보고 되었습니다. ,,1516,,1718, 비록는 LBL 자주 접근 필요 합니다 광범위 한 독도 섬 생존을 손상 될 수 있는 여러 층의 증 착에 대 한 기간 전달 . 또한, biomembrane 레이어 또는 nanomembranes 및 섬 표면 사이의 소수 성 상호 작용 사이 정전기 또는 공유 상호 작용에 의존 하는 nanomembranes의 불안정성 또한 우려9,14 제기 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
Encumbers intraportal 섬 이식의 치료 결과 또 다른 제한 요소는 즉시 혈액 중재 염증 반응 (IBMIR) 이식된 독도 혈액, 혈소판, 결과와 직접 접촉에 의해 발생 응고 및 면역 부작용 또는 원치 않는 세포 활성화9. 이러한 문제를 해결 하기 위해 별 모양의 폴 리 에틸렌 글리콜 (starPEG)의 구성 하는 울트라 얇은 nanocoating 설립된 생체 적합성과 섬 소재 주택으로 다 준비 되었다. 헤 파 린, 매우 sulphated glycosaminoglycan, 또한 그것의 항 염증 제, 항 응고 제 속성과 vascularization 프로 신생 성장 인자22, 모집 하 여 촉진 수에 대 한 starPEG nanocoating에 통합 되었다 23.

<table><tbody><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>AAJ207798</td><td></td></tr><tr><td>Streptozototin</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, Life Technologies 31800022</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>GIBCO, Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>GIBCO, Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>세포 분해 용액</td><td>GIBCO, Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, Life Technologies</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-포도당 용액</td><td>Sigma</td><td>G8644</td><td></td></tr><tr><td>488 팔로이딘</td><td>Sigma</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sigma</td><td>21888-25mg-F</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V/PI apoptosis kit</td><td>Dojindo</td><td>AD10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>클로스트리듐의 콜라겐분해효소, Type XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>NHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56480</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>시그마-알드리치</td><td>3449</td><td></td></tr><tr><td>8팔 PEG</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>1685176</td><td></td></tr><tr><td>FAM</td><td>시그마-알드리치</td><td>M041100</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-카르복시플루오레세인 N-숙시니미딜 에스테르</td><td>시그마-알드리치</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>KBr</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>32036</td><td></td></tr><tr><td>3-아미노프로필-트리에톡시실란&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>톨루엔</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>S-15497-20X</td><td></td></tr><tr><td>생염색 키트</td><td>Biovision, US</td><td>K501</td><td></td></tr><tr><td>BD MatrigelTM, 기저막 매트릭스, 성장 인자 감소</td><td>BD Bioscience</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨, 99.5%</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>105864</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨, 99%, 초순수</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>991468</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨, 99.7%, ACS 시약</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>988639</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물, 99%, ACS 시약</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>182158</td><td></td></tr><tr><td>인산이수소칼륨, 99%, 초순수</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>128839</td><td></td></tr><tr><td>황산 마그네슘 헵타하이드레이트, 99%, 분석용</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>119370</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 용액 부피, 1.0 M CaCl2</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>21114</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>V900933</td><td></td></tr><tr><td>쥐/마우스 인슐린 ELISA 키트</td><td>Millipore-linco</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr></tbody></table>

heparinized starpeg nanocoating와 췌 장 독도의 표면 공학

Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

세포 표면 공학 호스트 면역 공격에서 이식된 세포를 보호할 수 있습니다. 그것은 또한 이식 기능을 개선 하기 위해 셀룰러 가로 바꿀 수와 생존 후 이식. 이 프로토콜은 표면 공학 ultrathin 덤플링을 통합 starPEG (형 간염-PEG) nanocoating를 사용 하 여 췌 장 독도의 달성을 목표로 한다. 췌 장 섬 표면 공학에 대 한 형 간염 페그 nanocoating를 생성 하려면 덤플링을 succinimidyl 호박 (헤 파 린-보 건국) 처음 사용 하 여 N-(3-dimethylamino propyl)-그것의 카복실산 그룹의 수정에 의해 합성 되었다N'-에틸 carbodiimide 염 산 염 (EDC) 및 N-hydroxysuccinimide (NHS). 형 간염 페그 혼합물 다음 아미노 끝 기능성된 8-무장 한 starPEG (starPEG-(NH2)8) 및 헤 파 린-보 건국의 가교에 의해 형성 되었다. 섬 표면 코팅, 마우스 독도 콜라 소화 및 Histopaque를 사용 하 여 그라데이션 정화를 통해 격리 했다. 격리 된 독도 다음 NHS와 작은 섬 세포 막의 아민 그룹 사이의 공유 바인딩 수 있도록 10 분 동안 얼음 감기 형 간염 페그 솔루션으로 치료 했다. Nanocoating 형 간염 페그와 부딪히는 섬 크기에 최소한의 변경 하 고 볼륨 및 형 간염 페그와 독도의 heparinization 또한 섬 이식 하는 동안 인스턴트 혈액 중재 염증 반응을 줄일 수 있습니다. "쉬운-을 채택" 이렇게 세포 생존 능력을 타협 하지 않고 충분히 살아있는 세포의 표면 공학에 대 한 가벼운입니다. 형 간염 페그 nanocoating 또한 무제한 기능 생물학 중재자 및 생활에 대 한 다층된 표면 관 수 있도록 개방형 플랫폼 제공 고려 덤플링을 여러 cytokines에 바인딩 선호도 보이고 있다, 세포 표면 생명 공학입니다.

헤 파 린 못 nanocoating starPEG-(NH2)8 , EDC와 보 건국 커플링 에이전트 (그림 1)으로 사용 하는 헤 파 린의 활용에 의해 합성 되었다. 헤 파 린 못 nanocoating의 화학 구조에 의해 FT-적외선 조사 되었다 그리고 그림 2에서 같이, 헤 파 린의 특성 피크 3300-3600 c m-1, 헤 파 린 (그림 2 의 수 산 기 그룹에 해당에서 관찰 될 수 있었다 빨간). (그림 2 블루) 3300-3600 c m-1 에서 피크의 진폭에 있는 감소는 starPEG-(NH2)8 아 미드 그룹 및 헤 파 린 생성 그룹 사이 활용을 나타냅니다. 아 미드에 해당 하는 피크 1650 c m-1 의 carbonyl 진동 스트레칭 또한 succinimidyl 호박으로 덤플링의 카복실산 그룹 및 starPEG-(NH2)의 아민 사이 충분 한 반응을 나타내는 감소 되었다 8. 헤 파 린 못 nanocoating의 표면 구조는 원자 힘 현미경 검사 법에 의해 시험 되었다 루 외에서 표시 하는는 nanocoating 약 30 nm 높이에 이르기까지 작은 다공성 기능 (검 버섯) 폭에서 2 µ m 100 ~ 200 사이 직경10nm. 스캔 한 전자 현미경 검사 법에서 얻은 데이터는 또한 vivo에서 전달 중 세포 생존에 적합 될 수 제안 덤플링을 페그 (그림 3)의 높은 상호 다공성 구조를 확인 합니다.
격리 된 마우스 독도의 표면 코팅 시험 되었다 고 그림 4에 제시 된으로 녹색 형광으로 표시 하는 nanocoating의 얇은 레이어 코팅된 독도의 표면에 걸쳐 섬 볼륨/크기에 분명 변화를 유발 하지 않고 예금은 균등 하 게. 코팅, 동안 그들의 생존을 유지 하기 위해 얼음에 독도 유지 하는 것이 좋습니다. 마찬가지로, 코팅 기간 10 분이 경우에 최적화 되었다 독도 생존 능력의 유지 관리를 허용 하도록. 그것은 그는 nanocoating의 더 나은 관측을 위해 이전에 보고 된9,16 코팅된 독도의 횡단면을 검사 전자 현미경 검사 법 더 적절할 것, 비록 데이터 생성 협조할 문화에서 생활 독도 대신 열 한 고정 및 임베디드 대에서
에 관한 생존 및 코팅된 독도, 섬 revascularization 및 기능의 기능 평가 체 외되었습니다. 헤 파 린의 유익한 속성을 고려 하면 섬 표면 덤플링을 기능화 수 문화에 따라서 생존 섬 revascularization 용이 하 게. 우리는 헤 파 린-나무 못 코팅 마우스 독도 전시 문화 (그림 5)에서 강력한 섬 생존을 관찰 했습니다. 훨씬 더 고급 혈관 형성은 헤 파 린-페그와 공동 경작 했다 섬 내 피 세포 (MS1)에서 또한 분명 코팅 독도, 길쭉한 microvessel 같은 구조와 같은 네트워크 혈관 구조 (그림 6에 표시 된 ).
Nanocoating 프로세스 덤플링을 말뚝 코팅 독도의 효과 포도 당 자극 인슐린 분 비 능력을 발생합니다. 인슐린 분 비의 낮은 수준 때 독도 생리 적 소금물 포도 (2 mmol/L;의 sub-stimulatory 수준으로 보충을 끼얹는다 했다 모든 치료 그룹에서 관찰 되었다 그림 7)입니다. 독도 포도 당 (20 mmol/L 포도 당)의 위에 생리 적 수준으로 자극 했다, 인슐린 분 비의 증가 모든 치료 그룹에서 관찰 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2.jpg"> 그림 1: 형 간염 페그 nanocoating 췌 장 섬 표면 공학의 화학 구조. 섬 코팅 덤플링을 NHS 및 세포 막 및 스타-말뚝-(NH2)8주 아민 사이 화학식 가교에 의해 달성 되었다. 각 헤 파 린 분자는 각 NHS 그룹을 수정 하는 여러 carboxyl 그룹을 소유한 다. NHS 활성화 carboxyl 그룹 폼 아 미드 결합를 통해 nanocoating 형 간염-고 독도의 안정화는 단백질의 1 차 아민과 반응 것 이다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2.jpg"> 그림 2 : 스타-말뚝-(NH2)8, 헤 파 린에 형 간염 페그 nanocoating의 적외선 스펙트럼의 건조 상태. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig3.jpg"> 그림 3: 형 간염-못 말린된 상태에서의 전자 현미경 이미지를 스캔. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig4.jpg"> 그림 4: 헤 파 린-말뚝의 대표 이미지 코팅 형광 현미경 독도. 헤 파 린 식구 들 (녹색에서 표시)와 함께 사전 이라는 했다. 이미지는 100 독도의 대표. 눈금 막대 = 100 µ m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig5.jpg"> 그림 5: 헤 파 린-나무 못 코팅 독도 전시 강력한 섬 생존. (A) 데이터의 의미, n mean± 표준 오류로 그룹당 50 독도 =. (B) 살아있는 세포는 빨강에서 녹색 및 죽은 세포에 표시 했다. 눈금 막대 = 100 µ m 이미지는 50 독도의 대표. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig6.jpg"> 그림 6: 헤 파 린 못 nanocoating 용이 내 섬 revascularisation. MS1 셀 헤 파 린-나무 못 코팅 독도와 noncoated 제어 독도 공동 경작의 Matrigel 튜브 형성. 이미지 4와 24 h. 규모 바에서 찍은 = 100 µ m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig7.jpg"> 그림 7: 헤 파 린 못 nanocoating 섬 인슐린 분 비 기능에 변화를 발생 시킵니다. 헤 파 린-나무 못 코팅된 독도 및 noncoated 제어 독도 (각 30) 2 mmol/L (흰색 막대)에 노출 됐다 또는 30 분 응답 20 mmol/L 포도 당으로 인슐린 분 비에 대 한 20 mmol/L (검은 막대) 포도 코팅 사이 비교 했다 고 독도 제어. 데이터의 의미, n 평균 ± 표준 오차 표시 됩니다 = 10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 프로토콜은 nanocoating의 N-hydroxysuccinimide 그룹 및 섬의 아민 그룹 사이의 의사 bioorthogonal 화학을 통해 헤 파 린 통합 starPEG nanocoating를 사용 하 여 췌 장 독도의 표면 공학 달성을 목표로합니다 세포 막입니다.

Heparinized StarPEG Nanocoating와 췌 장 독도의 표면 공학

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

이 방법은 면역 거부 반응, 이식 후 섬 혈관 재생술 및 생존과 같은 췌장 섬 이식의 주요 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 채택하기 쉬운 이 접근 방식이 췌장섬의 세포 지형을 재형성하여 살아있는 세포의 표면 엔지니어링을 가능하게 하고 이식 기능, 생존 및 궁극적으로 섬 이식의 치료 효능을 향상시킬 것이라는 것입니다. 이 기술의 의미는 세포 기반 치료로 확장되는데, 이는 세포 기반 치료의 치료 결과가 낮은 세포 보유율과 낮은 생존율로 인해 제한되기 때문입니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Jingyi Yang입니다. 먼저 헤파린 6.9g의 무게를 싣고 Eppendorf 튜브에 얼음처럼 차가운 탈이온수 2ml에 녹입니다. NHS 0.23g을 Eppendorf 튜브에 얼음처럼 차가운 탈이온수 0.5ml에 녹입니다.그런 다음 50ml 원뿔형 튜브에 0.5ml의 얼음처럼 차가운 탈이온수에 EDC 0.77g을 녹입니다. NHS 및 EDC 용액을 50ml 원뿔형 튜브에 혼합합니다. 혼합액을 실온에서 30분 동안 방치한 후, 12, 000 RPM에서 10분 동안 원심분리하여 과잉 EDC 및 NHS를 제거한다.그런 다음 용액에 30ml의 차가운 에탄올을 넣고 12, 000RPM에서 10분 동안 원심분리합니다. 이제 10ml 원뿔형 튜브에 50%starPEG MI 보조제 1ml를 추가합니다. 그런 다음 동일한 50ml 원추형 튜브에 0.67ml의 10% Heparin NHS 용액을 추가합니다.혼합된 용액을 섭씨 25도의 인큐베이터에 20분 동안 넣어 점성이 있는 투명한 용액을 얻습니다. 이전에 추출한 200개의 마우스 섬을 해부 현미경으로 직접 선택하고 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 섬에 PBS 500마이크로리터를 추가하고 섭씨 4도에서 1분 동안 1, 200RPM으로 원심분리합니다.상층액을 제거하고 헤파린 PEG 용액 250마이크로리터를 첨가한 다음 혼합물을 얼음에 10분 동안 놓습니다. 섬이 Heparin PEG 용액과 잘 섞일 수 있도록 위아래로 피펫을 사용합니다. 그런 다음 혼합물을 1, 200 RPM에서 1 분 동안 원심 분리하십시오.그런 다음 상등액을 제거하고 PBS 500마이크로리터를 첨가합니다. 피펫을 위아래로 잘 섞습니다. 1, 200 RPM에서 1분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하고 나중에 사용할 수 있도록 섬을 보관하십시오.다음으로, 코팅된 섬에 10% FBS를 보충한 RPM I 1640 1-2밀리리터를 추가합니다. 그리고 이 섬을 전하가 되지 않은 멸균 박테리아 배양 접시로 옮깁니다. 마지막으로, 도립 형광 현미경으로 FAM-Heparin-PEG 코팅 섬의 형태와 형광 신호를 관찰합니다.HYDROXAL 그룹에 해당하는 특징적인 헤파린 피크가 Heparin-PEG 나노코팅 FTIR 스펙트럼에서 관찰되었습니다. 이러한 피크의 진폭 감소는 star-PEG MI aid 아미드 그룹과 Heparin 탄소 그룹 사이의 결합을 나타냅니다. 아미드 탄소 스트레칭 진동에 해당하는 피크도 감소했는데, 이는 헤파린 카르복실레이트기와 수시니미드 수소네이트 및 스타-PEG MI 에이드 아민 사이의 충분한 반응을 나타냅니다.전자 현미경 데이터를 스캔하면 Heparin-PEG 나노코팅의 고도로 상호 연결된 다공성 구조를 볼 수 있으며, 이는 in vivo 전달 중 세포 생존에 적합할 수 있음을 시사합니다. 녹색 형광으로 표시된 나노 코팅의 얇은 층은 코팅된 섬의 표면을 가로질러 균일하게 증착되었으며, 섬의 부피나 크기에 명백한 변화를 일으키지 않았습니다. 헤파린-PEG로 코팅된 마우스 섬은 배양에서 강력한 섬 생존력을 보여주었습니다.헤파린-PEG로 코팅된 섬과 공동 배양된 섬 내피 세포에서 훨씬 더 발전된 혈관 형성이 분명했으며, 이는 길쭉한 미세 혈관 같은 구조와 네트워크와 같은 혈관 구조로 나타났습니다. 모든 치료 그룹에서 낮은 수준의 인슐린 분비가 관찰되었는데, 섬에 생리학적 염 용액을 관류하고 준자극 수준의 포도당을 보충했을 때였습니다. 섬에 초생리학적 수준의 포도당을 자극했을 때, 인슐린 분비의 증가가 관찰되었습니다.일단 마스터하면 섬의 생존력을 보존하기 위해 적절하게 수행되면 코팅을 1분 안에 완료할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

랑게르한스의 고립 된 마우스 독도를 이용하여 체외 β-세포 기능을 시금 당뇨병의 병태 생리 및 치료의 연구에 중요한 구성 요소입니다. 많은 다운 스트림 응용 프로그램을 사용할 수 있지만,이 프로토콜은 특히 β-세포의 기능을 결정하는 중요한 매개 변수로 세포 내 순환 아데노신 monophosphate (캠프)의 측정에 대해 설명합니다.

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

여기에서는 β세포 증식에 대한 후속 면역형광 분석을 통해 배양에서 온전한 마우스 섬에 관심 부하가 있는 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 미세구의 화합물을 생성하고 관리하는 방법론을 제시합니다. 이 방법은 후보 β세포 유사분열제의 효능을 측정하는 데 적합합니다.

본래 마우스 독도에 β 세포 분열 촉진 물질의 지속적인 관리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 생분해 성 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) 마이크로 스피어를 사용하여

이 프로토콜은 murine islet isolation과 decellularized scaffold상의 seeding을 증명합니다. Scaffold-supported 랑게질을 streptozotocin (STZ) 유도 당뇨병 생쥐의 부고환 지방 패드에 이식 하였다. 아일 레트는 이식 부위에서 생존하고 고혈당 상태를 역전시켰다.

당뇨병 쥐의 부고환 지방 세포에 이식 된 지지체 지지대 지지대

이 섬 격리 프로토콜은 외분비 조직을 소화하기 위해 콜라게나아제 주사의 새로운 경로를 설명하고 마우스로부터 섬을 정화하기 위한 단순화된 그라데이션 절차를 설명했다. 효소 소화, 그라데이션 분리/정제, 그리고 아일렛 수작업 피킹이 포함됩니다. 성공적인 절연은 마우스당 250~350개의 고품질 및 완전한 기능을 갖춘 아일렛을 생성할 수 있습니다.

마우스에서 췌장 췌도 격리를 위한 간단한 고효율 프로토콜

췌 장 섬 연구 비보 전 당뇨병 연구에 대 한 중요 하다. 기존 기술을 그들의 네이티브 3 차원 건축 교양된 독도 공부 시간이 소요, 비효율적이 고, 자주 사용 됩니다. 이 작품 전체 교양된 독도의 높은-품질 파라핀 섹션을 생성 하기 위한 새로운 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다.

췌 장 섬 파라핀 섹션에 대 한 포함

이 프로토콜은 1차 인간 아일렛 샘플로부터의 베타 세포에서 특히 미토파지 단백질 복합체 형성의 정량적 분석을 위한 방법을 간략하게 설명한다. 이 기술은 이렇게 귀중한 인간 췌장 베타 세포 견본에서 결정적인 한정된 생물학 물자에서 mitophagy의 분석을 허용합니다.

근접 결찰 분석분석서를 활용한 인간 췌장 베타 세포에서 내인성 미토파기 복합체의 시각화

세포외 세포외 매트릭스(dECM)는 엔지니어링된 구조에서 표적 조직의 고유 기능을 재량화하기 위한 적절한 미세 환경 단서를 제공할 수 있습니다. 이 기사는 췌장 조직의 탈세포화, 췌장 조직 유래 dECM 바이오 잉크의 평가 및 생체 인쇄 기술을 사용하여 3D 췌장 조직 구성의 생성을위한 프로토콜을 설명합니다.

인쇄 3D 세포 -라덴 췌장 조직 구성을 인쇄를위한 췌장 조직 유래 세포 외 매트릭스 바이오 잉크

이 지방으로 덮인 췌도 이식 방법은 복강 내 이식 된 섬의 검출에 적합합니다. 특히, 생체 결합제의 사용 또는 봉합이 필요하지 않습니다.

부고환 백색 지방 조직을 이용한 지방으로 덮인 췌도 이식

이 프로토콜은 루이스 쥐 췌장 섬의 외과적 채취, 효소 소화 및 밀도-구배 정제를 표준화하는 방법을 설명하여, 이식 또는 시험관 내 연구에 직접 사용할 수 있는 고수율, 고순도 제제를 가능하게 합니다.

효소 소화 및 밀도-구배 분리를 이용한 루이스 쥐로부터의 췌장 섬 분리 및 정제

우리는 decellularized의 폐를 세포외 기질 및 기능 폐 조직을 생성하는 데 사용할 수있는 소설 biomimetic 생물 반응기를 개발했습니다. 생물 반응기에서 매트릭스와 culturing에 세포를 시딩함으로써, 우리는 시간의 짧은 기간에 대한 생체내에 이식하면 효과 가스 교환을 보여주는 조직을 생성합니다.

룽 공학을위한 절차

학습하세요 헤파린-PEG 나노코팅을 이용한 췌장 섬 표면 공학 기법으로 이식 생존율과 기능을 향상시키는 방법을 배우세요. 이 기술은 세포 기반 치료의 효능을 높이는 데 활용됩니다.

Heparinized StarPEG Nanocoating와 췌 장 독도의 표면 공학

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