대상 단백질에 대 한 내 생 포스트 번역 상 수정 프로필을 식별 하는 포괄적인 Immunoprecipitation 농축 시스템을 활용 하 여

이 실험 프로토콜의 전반적인 목표는 경험이 부족한 PTM 연구자가 하나의 포괄적인 시스템을 사용하여 하나 이상의 PTM에 의해 표적 단백질이 내인성으로 변형되었는지 효과적으로 결정할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 간소화된 단일 시스템을 사용하여 모든 표적 단백질에 대한 주요 PTM 및 잠재적 누화를 검출할 수 있도록 하여 번역 후 변형 분야에 대한 조사를 향상시킵니다. 이 기술의 주요 장점은 PTM이 아닌 전문가도 모델 시스템에서 하나 이상의 PTM에 의해 단백질이 내인성으로 변형되었는지 여부를 감지할 수 있다는 것입니다.

여러 세포 신호 경로에 대한 조절 메커니즘을 연구하는 동안 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸으며, 사용자 친화적인 키트 또는 시스템이 non-phospho PTM을 연구하는 데 실제로 사용할 수 없다는 것을 발견했습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 A431 세포를 준비하는 것으로 이 절차를 시작합니다. 또한 억제제가 있는 희석 완충액에서 블래스터 용해를 준비합니다.

배양 배지를 붓고 세포를 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 10ml의 1x 인산염 완충 식염수로 세포를 두 번 세척합니다. 세포 용해를 최대화하기 위해 블래스터 용해 완충액을 추가하기 전에 가능한 한 많은 PBS를 제거하십시오.

각 150mm 플레이트에 600마이크로리터의 블래스터 용해 버퍼를 추가합니다. 완충액의 양은 예상 단백질 수율을 기준으로 합니다. 다음으로, 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 용해합니다.

용해물은 핵 용해로 인해 점성이 생깁니다. 잘라낸 1mm 피펫 팁을 사용하여 미처리 용해물을 15ml 수집 튜브에 넣은 블래스터 필터로 옮깁니다. 제공된 필터 플런저를 사용하여 블래스터 필터를 완전히 압축하고 기포를 포함한 용해물 흐름을 15ml 튜브에 수집합니다.

간단하고 효율적인 블래스터 필터는 일반적으로 사용되는 다른 방법에서 볼 수 있는 것처럼 게놈 DNA를 전단하는 것이 아니라 제거합니다. 블래스터 희석 버퍼로 정화된 용해물을 각 150mm 플레이트에 대해 최종 부피 3ml로 희석합니다. 최종 부피는 예상 단백질 수율을 기반으로 합니다.

이 단계는 최종 완충액 조성이 아미노 침전 반응의 엄격성에 영향을 미치기 때문에 중요합니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질 정량 분석을 준비합니다. 600나노미터에서 용해물 샘플의 흡광도를 측정하고 단백질 농도를 계산합니다.

원료 시약 튜브를 여러 번 뒤집어 비드가 튜브에 완전히 재현탁되었는지 확인합니다. 각 IP 분석에 대해 비드 현탁액을 얼음 위의 별도의 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 분취합니다. 여기에서 20마이크로리터의 유비퀴틴 친화성 비드, 30마이크로리터의 포스포티로신 친화성 비드, 40마이크로리터의 SUMOylation 2/3 친화성 비드 또는 50마이크로리터의 아세틸화 친화성 비드를 개별 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다.

유비퀴틴화 IP 대조군 비드와 IGG 대조군 비드가 들어 있는 스톡 시약 튜브를 여러 번 뒤집어 비드가 튜브에 완전히 재현탁되도록 합니다. 다음으로, 비특이적 결합을 결정하기 위해 대조군 반응당 대조군 비드를 분취합니다. 여기에 유비퀴틴 대조군 비드 20마이크로리터, 포스포티로신 대조군 비드 30마이크로리터, SUMOylation 2/3 대조군 비드 40마이크로리터 또는 아세틸화 대조군 비드 50마이크로리터를 얼음 위의 개별 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다.

20마이크로리터의 용해물을 저장하여 웨스턴 블롯 입력 용해물 제어로 실행합니다. 5마이크로리터의 5x 샘플 버퍼를 예약된 용해물에 넣고 섭씨 95도에서 5분 동안 끓입니다. 다음으로, 각 IP 튜브에 용해물을 추가하고 IP 튜브를 제어합니다.

여기서, IP 및 대조 반응당 1mg의 용해물을 사용하여 총 8개의 IP 반응을 일으켰습니다. 끝단과 회전 플랫폼의 튜브를 섭씨 4도에서 2시간 동안 배양합니다. 외피 후에, 3개에서 5개에 분리기분리에 의하여 구슬을 모으십시오, 4 섭씨 온도에 1 분 동안 000 시간 G.

비드를 방해하지 않고 가능한 한 많은 상층액을 흡입한 다음 섭씨 4도 회전 플랫폼에서 1ml의 블래스터 세척 버퍼로 비드를 5분 동안 세척하고 이전과 같이 원심분리로 비드를 수집합니다. 원심분리 후 비드를 방해하지 않고 가능한 한 많은 상층액을 흡입하고 세척 단계를 두 번 더 반복합니다. 최종 세척 및 원심분리 후 완충액 상층액에서 대부분을 흡입한 다음 미세한 보어 단백질 로딩 팁을 사용하여 잔류 상층액을 제거합니다.

비드 펠릿의 최소한의 파괴가 허용됩니다. PTM 단백질의 회수를 극대화하기 위해 비트 펠릿의 중단을 최소화하면서 모든 세척 버퍼가 제거되었는지 확인하십시오. 다음으로, 30마이크로리터의 비드 용리 버퍼를 추가하고 튜브 측면을 부드럽게 두드리거나 튕겨 비드를 다시 현탁시킵니다.

이 s에서 피펫을 사용하지 마십시오.tage. 재현탁된 비드를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 전사 피펫 팁의 끝을 잘라내고 각 비드 현탁액을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 배치된 1.5ml 마이크로 원심분리기 스핀 컬럼으로 부드럽게 옮깁니다.

9와 10 사이, IP 표본을 모으기 위하여 실내 온도에 1 분에서 000 시간 G 사이에에 표본을 원심 분리하고, 그 후에 각 표본에 2-mercaptoethanol의 2개의 마이크로리터를 추가하고 잘 섞으십시오. 샘플을 섭씨 95도의 수조에 5분 동안 넣습니다. 외피 다음, 10, 실내 온도에 1 분 동안 000 번 G에 원심 분리에 의하여 표본을 모으십시오.

마지막으로 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 SDS PAGE, 전송 및 웨스턴 블롯 분석을 실행합니다. 미처리 및 EGF 처리된 A431 세포 용해물을 유비퀴틴, 포스포티로신, SUMO 2/3 및 아세틸 라이신 친화성 비드에 첨가했습니다. PD-L1 항체는 PD-L1 단백질이 EGF 자극에 대한 반응으로 이 4개의 PTM에 의해 변형되었는지 확인하기 위해 서부 면역블롯 분석에 활용되었습니다.

여기에 나타난 대표적인 결과는 이 방법이 PD-L1의 내인성 PTM 변형을 효과적으로 식별한다는 것을 나타낸다. 일단 숙달되면 이 기술은 적절하게 수행되면 4-4 1/2시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 이 포괄적인 PTM 검출 시스템을 사용하여 표적 단백질 또는 신호 경로에 대한 내종 PTM 또는 크로스토크를 검출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.