Hepatocytes에서 마우스 간 사인 내 피 세포의 정화 관류

이 절차의 전반적인 목표는 성공적인 마우스 간 관류를 수행하여 관심 있는 특정 간 세포 집단의 정제를 촉진하는 것입니다. 이 방법은 in vitro 또는 in vivo assay 내에서 특정 간 세포 집단의 기능을 지원하는 방법에 대한 간학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 각 간에서 얻을 수 있는 정현파 내피 세포에 많은 양의 간세포가 있다는 것입니다.

세포 생존력을 보존하기 위해 최적으로 소화된 간의 색상과 모양을 보는 것이 필수적이기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 문맥 카테터를 삽입하려면 먼저 집게 뒷면을 사용하여 장을 마우스 복강 오른쪽으로 이동하여 문맥을 노출시키고 구부러진 집게를 사용하여 간과 상췌장 십이지장 정맥 사이의 문맥 아래에 20cm 길이의 폴리에스터 재봉실 조각을 밀어 넣습니다. 집게를 사용하여 실을 동물의 반대쪽으로 조심스럽게 당겨 문맥 아래 중앙에 오도

그리고 문맥 주위에 느슨한 머리 위 매듭을 묶습니다. 구부러진 집게를 정맥 아래에 놓고 모든 조직 물질을 꼬리 쪽으로 부드럽게 당겨 정맥을 곧게 펴십시오. 다음으로, 카테터 바늘의 경사를 위와 평행을 이루도록 집게 근처에 놓고 바늘로 정맥을 부드럽게 뚫습니다.

베벨이 정맥의 내강에 있을 때 스프링이 장착된 바늘을 집어넣고 베벨이 금성 분기 영역 근처에 올 때까지 정맥을 통해 팔머 카테터를 계속 밀어 넣습니다. 카테터 주위에 매듭을 고정한 후 즉시 연동 펌프를 분당 4mm로 설정하고 튜브의 수쪽 끝을 카테터의 암쪽 끝에 연결하면 간 가지가 보이기 시작해야 합니다. 배액을 위해 대동맥 복부를 자릅니다.

마스킹 테이프를 사용하여 튜브를 언더 패드에 고정합니다. 가위를 사용하여 복부 피부를 수직으로 잘라 혈액과 관류 액체를 배출 할 수 있도록합니다. 그런 다음 곧은 집게로 폐수 혈관을 몇 번 짜서 간을 팽창시켜 모든 혈액이 빠져나갔는지 확인하고 간 조직이 희어질 때까지 PBS로 간을 관류합니다.

간세포를 채취하려면 먼저 유출 튜브를 PBS 1리터 플라스크에서 콜라겐분해효소-4가 보충된 완충액 2가 포함된 125ml 플라스크로 변경합니다. 콜라겐분해효소가 간에 도달하면, 짧지만 단단히 삼출액 혈관을 짜서 압력을 높이고 소화 완충액이 간의 모든 엽을 채울 수 있도록 합니다. 완충액이 간을 둘러싼 결합 조직을 통해 터지기 전에 혈관을 방출합니다.

그리고 전체 부피가 조직을 통해 흐를 때까지 완충액이 간을 통해 관류되도록 합니다. 다음으로, 10 밀리리터의 완충액이 들어있는 결정화 접시를 마우스 옆에 놓고 곧은 집게와 가위를 사용하여 간을 접시로 옮깁니다. 접시를 멸균 조직 배양 후드로 옮기고 멸균 기술을 사용하여 간을 잡고 캡슐을 벗겨냅니다.

간 조직의 세포를 부드럽게 흔들고 생성된 세포 용액을 100미크론 필터를 통해 50ml 원추형 튜브에 붓습니다. 그런 다음 필터에서 간 잔여물을 더 많은 버퍼로 헹굽니다. 간에 세포가 없는 것 같으면 40미크론 필터를 통해 끌어당긴 여과액을 두 번째 50ml 튜브에 걸러내고 원심분리로 세포를 수집합니다.

상층액을 함유한 비실질 세포와 죽은 간세포를 얼음 위의 새로운 50ml 튜브에 한 번의 동작으로 붓어 펠릿을 보존하고 다음 원심분리를 위해 40ml의 새 완충액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 정현파 내피 세포를 분리하려면 비실질 세포를 포함하는 상층액을 원심분리합니다. 셀 현탁액을 하나의 새로운 50ml 원뿔형 튜브로 당기고 총 부피를 최대 35ml까지 가져옵니다.

원심분리를 통해 끌어당긴 세포를 모으고, 25ml 피펫을 사용하여 상등액이 함유된 비실질 세포의 상단 25ml를 얼음 위의 새로운 50ml 원추형 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 튜브에 25ml의 새 배지를 추가하고 두 번째 원심분리 및 상등액 제거를 위해 펠릿을 다시 현탁합니다. 그런 다음 상층액을 원심분리하고 새 50ml 튜브에 15ml의 50%Percoll 용액을 추가합니다.

가장 낮은 배출 속도로 설정된 피펫터를 사용하여 20ml의 25%Percoll을 50%Percoll 용액에 오버레이하고 비실질 세포를 섭씨 4도 매체 10ml에 다시 현탁시킵니다. Percoll 용액에 세포를 조심스럽게 층을 이룹니다. 그리고 밀도 구배 원심 분리에 의해 세포를 분리합니다.

다음으로, 용액의 처음 30ml를 흡인하고 플라스틱 5ml 전사 피펫을 사용하여 25-50% 밀도 구배 용액에 위치한 정현파 내피 및 Kupffer 세포를 새로운 50ml 원뿔형 튜브에 계면으로 수집합니다. 50ml의 배지로 세포를 세척하고 펠릿을 다시 현탁시키면서 튜브 바닥의 측면을 12ml의 따뜻한 배지로 헹굽니다. Kupffer 세포에서 정현파 내피 세포를 분리하려면 세포 현탁액을 가습 조직 배양 인큐베이터의 폴리스티렌 페트리 접시에 8분 동안 옮깁니다.

배양이 끝나면 25ml 피펫을 사용하여 상층액을 흡인하고 상층액을 사용하여 가장 낮은 속도로 설정된 피펫으로 접시를 헹구어 나머지 사인파 내피 세포를 수집합니다. 그런 다음 정현파 내피 세포를 새로운 50ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 원심분리를 통해 세포를 재현탁시키고 콜라겐 코팅된 세포 배양 접시에 도금하여 세포를 수집합니다.

방금 시연된 것과 유사한 방식으로 PBS 불부착 관류 후 마우스 간의 주사 전자 현미경을 통해 간 미세 해부학적 구조와 간세포 사이의 미세 융모를 명확하게 볼 수 있습니다. 시술 초기에 저속 스핀 중에 수확된 간세포는 완충액을 함유한 소 혈청 알부민을 4회 세척한 후 높은 순도를 나타냅니다. 콜라겐으로 코팅된 폴리스티렌 페트리 접시에 선택적으로 접착하여 정현파 내피 세포를 분리하면 순도가 83-90%가 되며, 이는 콜라겐분해효소 분해의 전반적인 효과에 크게 좌

방금 시연된 바와 같이 대표적인 분리 절차에서 광학 현미경을 사용한 정량적 측정은 거의 100% 순수한 간세포 집단의 일반적인 분리 결과를 보여줍니다. 그리고 89%가 조금 넘는 순수 정현파 내피 세포 집단. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스 문맥에 카테틱을 삽입하는 방법과 마우스 간에서 간세포와 사인파 내피 세포를 모두 정제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차는 또한 다양한 밀도 구배와 원심분리 속도를 사용하여 간세포 분리 후 비실질 분획에서 위성 세포를 정제하는 데 사용할 수 있습니다.