유 방 암 아카이브 자료를 사용 하 여 다중 RNA 기반 식 분석 결과의 최적화
August 1st, 2018
핵 산 저하 보관 조직, 종양이, 그리고 신선한 냉동된 조직 표본의 부족 병 리 실험실 전세계에 암 진단 서비스를 저하 수 있습니다. 이 원고 멀티플렉스 마그네틱 비드 분석 결과 사용 하 여 유방암을 분류 하는 마커의 패널의 최적화를 설명 합니다.
이 방법은 유방암 환자를 알려진 치료군과 알려지지 않은 치료군으로 분류하는 데 성공적으로 최적화되었습니다. 이 분석의 높은 감도는 레이저 현미해부를 사용하여 추가로 연구할 수 있는 이질적인 샘플을 식별합니다. RNA 기반 멀티플렉스 분석의 주요 장점은 Hematoxylin 및 Eosin 염색 포르말린 고정 파라핀 내장 보관 재료를 사용하여 결과를 재현할 수 있어 고분해능 출력 및 바이오마커 검증이 가능하다는 것입니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 조직을 준비합니다. 해부를 시작하려면 슬라이드 한계를 설정하고 현미경의 스테이지 움직임을 보정합니다. 이제 4X 대물렌즈를 사용하여 염색된 멤브레인 슬라이드를 스캔합니다.
멤브레인 슬라이드에서 미세 해부 대상 영역을 선택하고 둘러쌉니다. 전체 면적을 추적합니다. 적절한 다운스트림 RNA 분석을 위해서는 최소 42제곱밀리미터가 필요합니다.
그런 다음 정의된 매개변수에서 레이저 절단을 시작합니다. 다음으로, 캡 리프트 메커니즘을 사용하여 절개된 부분을 검색하고 기계적 부속물에 부착된 라벨이 부착된 튜브의 디퓨저 캡에 섹션을 설정합니다. 절개된 단면이 캡으로 검색되지 않으면 대상 영역의 절개를 반복합니다.
현미해부의 정확성은 중요한 단계이며 캡에 있는 미세해부 영역이 표시되고 스캔된 이미지와 일치하는지 항상 확인해야 합니다. 각각 별도의 튜브에 원하는 만큼 조직 절편을 수집한 다음 조직 샘플을 용해합니다. 용해를 위해, 각 샘플에 조직 면적의 2.4 마이크로 리터의 균질화 용액을 평방 밀리미터 전에 적용한 다음 최대 속도로 10 초 동안 샘플을 와류로 만듭니다.
그런 다음 2, 500g에서 5초 동안 샘플을 회전시킵니다. 그런 다음 필요한 경우 샘플을 1.5ml 튜브로 옮기고 섭씨 65도의 진탕 가열 블록에 넣습니다. 600rpm으로 12-18시간 동안 흔듭니다.
다음 21, 실내 온도에 5 분 동안 000 g에 용해물을 원심 분리하십시오. 투명한 상등액을 라벨이 부착된 새 튜브에 조심스럽게 수집합니다. 조직 조각을 옮기지 마십시오.
상등액은 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있습니다. 혼성화 기반 분석을 위해 모든 시약을 준비한 후 25마이크로리터 조직 균질액이 있는 자기 분리 96웰 플레이트를 최대 90웰까지 로드합니다. 25마이크로리터의 대조군 샘플을 3개의 지정된 웰에 로드하고 25마이크로리터 균질화 용액을 3개의 웰에 블랭크로 로드합니다.
그런 다음 투명한 플라스틱 압력 씰을 사용하여 자기 분리 플레이트를 밀봉하고 플레이트를 섭씨 54도의 인큐베이터에 18-22시간 동안 흔들면서 놓습니다. 다음 날, 휴대용 마그네틱 플레이트 와셔에 플레이트를 장착하고 잠근 다음 압력 씰을 제거하고 마그네틱 비드가 가라앉을 때까지 1분 동안 기다립니다. 이제 세척을 수행합니다.
싱크대 위로 플레이트를 배수하고 티슈 페이퍼를 사용하여 부드럽게 닦아낸 다음 모든 웰에 100마이크로리터의 1X 세척 버퍼를 넣고 15초 동안 기다립니다. 이 과정을 세 번 반복하여 세척 단계를 완료합니다. 마지막 세척을 제거한 후 50마이크로리터의 프리앰프 시약으로 웰을 다시 로드한 다음 알루미늄 플레이트 실러로 플레이트를 밀봉하고 실온에서 1분 동안 800rpm으로 플레이트를 흔듭니다.
그런 다음 섭씨 50도에서 한 시간 동안 접시를 계속 흔듭니다. 이 작업이 완료되면 다른 세척 단계를 수행합니다. 다음으로, 50마이크로리터의 증폭기 시약으로 웰을 다시 로드하고 알루미늄 플레이트 씰로 플레이트를 밀봉한 다음 실온에서 1분의 진탕 배양을 반복한 다음 섭씨 50도에서 1시간의 진탕 배양을 반복한 다음 또 다른 세척 단계를 수행합니다.
이제 최대 속도로 10초 동안 라벨 프로브를 소용돌이친 다음 각 웰에 50마이크로리터의 라벨 프로브를 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 다시 밀봉하고 이전과 같이 진탕 배양을 반복한 다음 다른 세척 단계를 수행합니다. 그런 다음 갓 혼합된 Streptavidin phycoerythrin 50마이크로리터를 웰에 로드한 다음 실온에서 600rpm의 진탕 배양을 수행한 다음 Streptavidin 세척 버퍼를 사용하여 세척 단계를 수행합니다.
세척 단계를 완료한 후 각 웰에 100마이크로리터의 Streptavidin 세척 버퍼를 로드하고 알루미늄 플레이트 씰로 플레이트를 밀봉한 다음 실온에서 800rpm으로 3분 동안 플레이트를 흔듭니다. 마지막 배양 단계에서 마그네틱 비드 분석기를 시작하고 기기가 보정되고 검증 프로토콜이 수행되었는지 확인합니다. 소프트웨어의 Batches 탭에서 기존 프로토콜을 사용하여 Create Batch를 선택하여 새 분석을 추가합니다.
다음으로, 플레이트 레이아웃에서 웰을 알 수 없음 또는 공백으로 지정하고 Sample 패널에서 각각에 대한 레이블을 제공합니다. 이제 반응 플레이트에서 알루미늄 씰을 제거하고 플레이트 로더 트레이를 배출한 다음 플레이트를 분석기에 로드합니다. 그런 다음 Retract(취소)를 클릭한 다음 Run Batch(일괄 실행 실행)를 클릭하여 분석기를 시작합니다.
판독 후 플레이트를 꺼내고 제조업체에서 권장하는 대로 마그네틱 비드 분석기를 청소합니다. 분석을 위해 배치 결과 탭으로 이동합니다. 해당 분석 파일을 선택하고 옵션을 사용하여 csv 파일로 내보낸 다음 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 평균 및 원시 점수를 생성합니다.
컨트롤에 예상 신호가 표시되는지 확인합니다. 데이터 과학 플랫폼을 사용하거나 정의된 알고리즘을 사용하여 샘플 원시 데이터를 정규화하고 데이터 분포를 분석하여 주요 구성 요소 분석을 실행합니다. 멀티플렉스 비드 리더 및 분석의 성능은 매우 중요하며, 귀중한 환자 샘플에 앞서 주석이 잘 달린 대조군 샘플의 연속 희석을 실행하여 올바른 결과를 보장할 수 있습니다.
속성의 경우, 정규화된 유전자 데이터의 부분 집합과 유방암 하위 유형과 같은 명목 변수를 선택합니다. 훈련되고 검증된 분류 알고리즘을 적용하여 미지 샘플의 특성을 분석합니다. 설명된 방법은 H&E 염색, 미세 해부, 심하게 분해된 FFPE 물질에서 40개의 전사체를 동시에 측정하는 데 적용되었습니다.
이 방법을 사용하면 다양한 수용체 양성 및 음성 아형에서 종양과 일치하는 대조 조직을 비교할 때 수용체 상태의 정확한 특성화와 중간엽 마커 FN1의 차등 발현을 보여줄 수 있습니다. 종양 내 이질성은 이 방법을 사용하여 특성화할 수 있습니다. ER 양성 종양은 뚜렷한 종양 형태 및 유사분열 활성을 보이는 영역 내에서 FN1의 공간적 차등 발현을 나타냅니다.
이 동영상을 시청한 후에는 타겟 RNA에서 비드로의 하이브리드화, 신호 증폭 및 정량화 후 조직 용해물에서 직접 여러 유전자를 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 분석 감도를 통해 레이저 미세절부 물질을 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 각 분석 전에 장비를 보정하고 귀중한 환자 샘플을 실행하기 전에 품질 관리 자료를 사용하여 감도 범위를 결정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
분석 워크플로우는 임상 실험실에 쉽게 적용할 수 있습니다. 최대 90개 샘플의 RNA 프로파일링을 이틀에 걸쳐 12시간 내에 수행할 수 있습니다. 병리학 실험실에서 유방암 수용체 상태를 측정하는 것은 시간이 많이 걸리고 숙련된 병리학자가 필요합니다.
이 디지털화된 멀티플렉스 비드 기반 분석을 사용하여 RNA 발현을 정확하게 정량화할 수 있습니다. 1차 진단에서 생검에서 분획 바이오마커를 분석하는 것은 종양의 표현입니다. 이 방법론을 더 넓은 바이오마커 패널과 함께 사용하고 전체 섹션을 활용하여 이질성 샘플을 식별합니다.
이 방법론을 사용한 분석 개발은 다용도로 사용할 수 있으며 시료 주입이 적게 필요합니다. 샘플에는 바이오마커 검증에 중요한 임상 주석이 달린 샘플과 환자 감시 및 조기 진단에 중요한 액체 생검이 포함됩니다.
개요
본 연구는 보관된 조직에서 핵산 분해 및 종양 이질성으로 인해 발생하는 암 진단 과정의 어려움을 해결합니다. 저자들은 유방암을 효과적으로 분류하기 위해 다중 자기 비드 분석법을 최적화했습니다.
주요 연구 구성요소
과학 분야
- 종양학
- 병리학
- 바이오마커 연구
배경
- 보관된 조직의 핵산 분해는 진단 정확도에 영향을 미칩니다.
- 종양 이질성은 유방암 분류를 복잡하게 만듭니다.
- 신선한 냉동 조직 시편은 종종 사용할 수 없습니다.
- 다중 분석법은 분류 및 민감도를 향상시킬 수 있습니다.
연구 목적
- 유방암 분류를 위한 바이오마커 패널을 최적화합니다.
- 보관된 조직을 사용한 분석법의 민감도를 향상시킵니다.
- 고해상도 출력을 통해 결과를 검증합니다.
사용된 방법
- 레이저 마이크로해체를 사용한 조직 시편 준비.
- 바이오마커 분석을 위한 다중 자기 비드 분석법.
- 마이크로해체된 시편으로부터 RNA 추출.
- 유전자 발현 데이터의 통계적 분석.
주요 결과
- 이 분석법은 유방암 환자를 치료 그룹으로 성공적으로 분류했습니다.
- 이질적인 시편에서 높은 민감도를 달성했습니다.
- 수용체 상태의 정확한 특성화가 입증되었습니다.
- 포르말린으로 고정된 파라핀 매장 물질을 사용한 결과 재현성이 입증되었습니다.
결론
- 최적화된 분석법은 유방암 분류를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 고도로 분해된 보관된 시편 분석을 가능하게 합니다.
- 이 방법은 종양 생물학에 대한 추가 연구를 용이하게 합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This multiplex RNA-based expression assay addresses a critical bottleneck in oncology biomarker validation by enabling accurate molecular subtyping of breast cancer from degraded archival FFPE tissue. By overcoming limitations of nucleic acid degradation and tumor heterogeneity, the method provides a robust, quantitative platform for retrospective biomarker validation and liquid biopsy applications. Its compatibility with clinical workflows and low input requirements support scalable implementation in pathology laboratories for improved patient stratification and disease monitoring.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantitative measurement of 40 transcripts in microdissected FFPE material.
- Operational Value: Supports functional target validation by characterizing receptor status and mesenchymal marker FN1 expression across breast cancer subtypes.
- Predictive Value: Facilitates biomarker validation in clinically annotated archival libraries, reducing mechanistic ambiguity in target selection.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible quantitative outputs from laser microdissected H&E-stained FFPE sections.
- Scalability: Enables multiplexed analysis of up to 90 samples over two days, supporting high-throughput biomarker screening.
- Platform Reuse: Adaptable to liquid biopsy applications and wider biomarker panels for continuous monitoring applications.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling analysis of heterogeneous tumors via laser microdissection.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative biomarker measurements in archival material to support retrospective validation of clinical outcome correlations.
- Disease Relevance: Accurately classifies breast cancer into molecular subtypes, informing target selection and portfolio triage decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The assay integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical biomarker validation, enabling quantitative analysis of archival and liquid biopsy samples for oncology applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via multiplexed transcript measurement in microdissected tissue.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, reproducible RNA quantification from degraded FFPE material.
- Analytics: Enables data normalization, distribution analysis, and principle component analysis for comparative condition assessment.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating biomarkers in clinically annotated archival libraries.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for biomarker validation across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence through accurate receptor status characterization and differential expression analysis in heterogeneous tumors.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility using H&E-stained FFPE material with low input requirements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling retrospective biomarker validation and reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative biomarker measurement in archival tissue for clinical outcome correlation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in laser microdissection and hybridization-based assay workflows.
- Dependent on magnetic bead analyzer instrumentation and calibrated validation protocols.
- Necessitates cross-team standardization for sample preparation, lysis, and hybridization steps.
- Requires adaptation considerations for varying degrees of tissue degradation and heterogeneity.
- Practical limitation: Sensitivity range must be determined using quality control material before running precious patient samples.
