Name: 시각화 및 간 엽 세포 계보 특정 표시와 함께 Adipogenic 차별화 가능성의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 26 s
Description: 배우세요 지방세포 분화 정량화 방법을 면역형광 기술과 FABP4 계열 특이 표지자를 사용하여. 이 고내용 스크리닝 기법은 약물 스크리닝을 위한 고효율 분석이 가능합니다.

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1. 준비 ASCs 차별화 분석
<ol><li>조직 배양 시 약을 준비 하 고 메 마른 조직 문화 후드에 라이브 셀 처리.</li>
	<li>A0 매체 준비: Dulbecco 수정이 글 매체와 햄의 F12 매체 (DMEM/F12), 1 x glutamax, 1 x 페니실린/스.</li>
	<li>완전 한 ASC 매체 준비: DMEM/F12, 1 x glutamax, 1 x 페니실린/스, 10% 태아 둔감 한 혈 청.</li>
	<li>사용 하 여 점착 ASCs, T75 문화 플라스 크에 확장 정화. ASCs 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)10을 사용 하 여의 순도 확인 합니다.</li>
	<li>T75 문화 플라스 크에서 모든 매체를 제거 하 고 세포 분리 효소의 2 개 mL를 추가 하 여 셀을 분리 합니다.</li>
	<li>5-10 분 (37 ° C, 습도, 5% CO2) 인큐베이터에서 문화 플라스 크를 둡니다. 인큐베이터에서 배양 플라스 크 하 고 플라스 크의 측면을 단단히 누릅니다. 세포는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 문화 플라스 크에서 분리가 확인 하십시오.</li>
	<li>T75 문화 플라스 크를 A0 매체의 13 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>15 mL 원심 분리기 튜브를 5 분에 대 한 400 x g에서 원심 분리기에 15 mL를 전송 합니다.</li>
	<li>상쾌한 삭제 하 고 다시 완전 한 ASC 매체의 1 mL에 셀 펠 릿을 중단.</li>
	<li>Hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 수행 합니다.</li>
	<li>완전 한 ASC 매체에 25000 셀 mL-1 의 농도에 세포 현 탁 액을 희석.</li>
	<li>96 잘 접시 (플랫 바닥)의 모든 주변 우물에 A0 매체의 200 µ L를 추가 합니다. 이 센터에 있는 셀을 포함 하는 우물의 증발 속도 줄일 수 있습니다.</li>
	<li>잘 당 5 x 103 셀 마지막 셀 밀도 달성 하기 위해 microwell 플레이트에 세포 현 탁 액의 200 µ L를 전송 합니다. 4 개의 우물 (triplicate 기술 반복 및 immunocytochemistry (ICC)에 대 한 1 차적인 항 체 제어 하지) 각 치료 그룹에 대 한 필요 합니다.</li>
	<li>남겨 주세요 인큐베이터 (37 ° C, 습도, 5% CO2)에서 microwell 플레이트 세포까지 도달 합류 (3-4 일).</li>
</ol>2. 유도 ASCs의 차별화
<ol><li>1 µ M dexamethasome, 10 µ M 인슐린 및 200 µ M indomethacin 완전 한 ASC 매체를 보완 하 여 adipogenic 차별화 매체를 준비 합니다. 완전 한 차별화 매체 1 분석 결과 대 한 필요에 따라 1 개월에 4 ° C, 그래서 유일한에서 안정적입니다. 저장소 4 ° C에서 필요한 경우는 약 수 물 목욕에서 37 ° C에 열.</li>
	<li>3-4 일 후 인큐베이터에서 microwell 접시 고 adipogenic 차별화 매체 문화 매체의 절반을 바꿉니다.</li>
	<li>2-3 일 마다 중간 변화를 수행 합니다. 참고: 최적의 adipogenic 차별화 차별화 매체에 문화의 14 일 필요합니다. 차별화 된 셀 기반으로 하는 전통적인 염색 얼룩과 유전자 특정 얼룩을 사용 하 여 분석 된다.</li>
</ol>3. 얼룩 차별화-전통 염료 기반 얼룩
<ol><li>준비 하 여 4% 포름알데히드 솔루션 PBS 가진 16% 포름알데히드를 diluting. 실험에 필요한 금액 및 원심 분리기 튜브에 단단히 밀봉 되 게 희석. 주의: 포름알데히드는 잠재적인 발암 물질 이며, 코, 목 구멍, 흡입 시 폐에 염증을 일으킬 수 있습니다. 증기 두건에서 포름알데히드와 관련 된 모든 절차를 수행 합니다.</li>
	<li>300 mg의 소 프로 파 놀 100 mL에 용 해 하 여 기름 빨간 O 재고 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 microwell 접시를 가져가 라. 다음 단계는 비 살 균 환경에서 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>우물에서 모든 매체를 제거 하 고 30 분 동안 4% 포름알데히드와 셀을 수정.</li>
	<li>인큐베이션 기간 동안, 기름 빨간 O 작업 솔루션을 준비 합니다. 작업 솔루션 6 부품 기름 빨간 O 주식 4 부분 증 류 물 (dH2O)로 구성 되어 있습니다. 잘 혼합 하 고 0.2 µ m 필터 단위를 사용 하 여 필터링 하기 전에 20 분 동안 실내 온도에 앉아 보자. 솔루션 작동만 2 시간에 대 한 안정적입니다.</li>
	<li>Pipetting으로 우물에서 모든 포름알데히드를 제거 합니다.</li>
	<li>셀 60% 소 프로 파 놀과 우물 진행 하기 전에 완전히 건조 하자 한 번 씻는 다.</li>
	<li>각 잘 하 기름 빨간 O 작업 솔루션의 50 µ L을 추가 하 고 10 분 동안 실내 온도에 품 어.</li>
	<li>기름 빨간 O 솔루션을 제거 하 고 즉시 dH2오 워시 가벼운 현미경에서 전에 dH2O 4 번을 추가 합니다.</li>
</ol>4. 차별화-유전자 특정 항 체 얼룩이 지기
<ol><li>NaCl, KCl의 2 세대와 트리 스 (pH 8) dH2O의 1 L 자료의 30 g의 80 g을 용 해 하 여 버퍼링 트리 스 염 분 (TBS)의 재고 솔루션을 준비 합니다. DH2O. 저장소를 사용 하 여 실 온에서 1시 10분을 diluting 하 여 작업 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>Immunobuffer (IB) 준비 (1% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) TBS에서). 날짜와 15 mL 원심 분리기 튜브 라벨 및 4 ° c.에 저장 IB는 만든 날짜에서 1 주 동안 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>카 제인의 및 0.195 g의 나트륨 아 지 드 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 200 mL에 0.5 g을 용 해 하 여 0.25% 카 제인 차단기를 준비 합니다. 완전히 하룻밤에 감동 하 여 재료를 분해. 15 mL 원심 분리기 튜브와-20 ° C 냉동 고에서 약 수. 해 동된 카 세 인 솔루션 1 개월 4 ° C에서 보관 될 수 있습니다.</li>
	<li>재고 DAPI 1: 200 tbs. 저장소에 4 ° C, 빛에서 보호에 diluting 하 여 DAPI 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>살 균 PBS에서 thimerosal을 용 해 하 여 재고 thimerosal 솔루션 (10 mL-1)를 준비 합니다. 4 ° C에서 저장 하 고 0.4 mg mL-1 사용 하기 위해 적절 한 금액을 희석.</li>
	<li>수정 하 고 차가운 메탄올 (96 잘 접시) tbs.의 200 µ L 한번 5 분 세척 세포와 세포를 permeabilize</li>
	<li>10 분 동안 실내 온도에 0.25% 카 제인의 50 µ L를 차단 하 고 tbs.로 한 번 씻어</li>
	<li>IB에서 희석 하는 주 항 체의 50 µ L 추가 (항 체 자세한 표 1 참조)와 1 시간 동안 폐쇄 뚜껑 품 어.</li>
	<li>200 µ L, TBS와 TBS와 부드러운 락으로 5 분 동안 다음 3 번 한 번 씻어.</li>
	<li>IB에 희석 이차 항 체의 50 µ L 추가 (항 체 정보는 표 2 참조) 1: 2000 DAPI 각, 뚜껑 사진 표백 방지 하기 위해 호 일 1 h. 커버 플레이트에 대 한 폐쇄 품 어.</li>
	<li>TBS, 함께 한 번 세척 그리고 TBS와 두 번 부드러운 락과 15 분 동안.</li>
	<li>모든 TBS를 제거 하 고 thimerosal 솔루션의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>4 ° C, 영상까지 빛에서 보호에서 접시를 저장.</li>
</ol>5. 영상 높은 처리량 현미경을 사용 하 여 세포
<ol><li>세포 유전자 특정 항 체와 fluorophore 스테인드 활용된 2 차 항 체 (면역 형광) 높은 콘텐츠 심사 현미경 제어 소프트웨어를 함께 사용 하 여 분석 합니다.</li>
	<li>현미경 단계를 microwell 접시를 로드 합니다. 플레이트 수집 컨트롤에서 중간 범위 확대 (10 X 렌즈)에서 이미지를 선택 합니다. 이미지의 각, 한 셀을 두 개의 인접 한 필드에 표시 되지 않습니다 보장 하기 위해 각 사이트 사이 50 µ m 간격을 가진 센터에서 가져온 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>웰 스의 이미지를 선택 합니다.</li>
	<li>적절 한 채널 조합, 노출 시간 및 z-오프셋 매개 변수를 선택 합니다. 각 필터 (보충 표 2)의 자세한 내용은 표 3 을 참조 하십시오.</li>
	<li>(이미지는 자동으로 데이터베이스 서버에 저장 된) 수집 마법사를 사용 하 여 분석 결과 획득 합니다.</li>
	<li>대체 채널 조합을 사용 하 여 오일 레드 오 (보충 표 3) 물 접시를 취득.</li>
</ol>6. 획득된 한 이미지 분석
참고: 원격 데이터베이스 서버 수 있습니다 신속 하 고 쉽게 평가 이미지 획득 및 이미지 분석 소프트웨어의 사용을 액세스.
<ol><li>오픈 셀 득점 모듈 분석 소프트웨어에서.</li>
	<li>세포 핵 크기에 대 한 사용자 정의 매개 변수 DAPI 채널 (핵 마커)와 관심의 세그먼트 핵 사용을 감지 하 고 신호 강도 배경 위에.</li>
	<li>FITC 채널을 사용 하 여 FABP4 신호를 감지 합니다. 각 이미지에 모든 FABP4 긍정적인 영역을 선택 하는 배경 위에 크기 및 신호 강도 대 한 사용자 정의 매개 변수를 가진 차별화 된 셀 세그먼트.</li>
	<li>오일 레드 오 물 접시를 분석 하기 위해 분석 소프트웨어에 Transfluor 모듈</li>
	<li>크기와 기름 빨간 O 스테인드 지역 '구 덩이'로 강도 지정 합니다.</li>
</ol>

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저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

이 문서는 유틸리티와 정확 하 게 감지 하 고 계량 성숙한 adipocytes mesenchymal stromal 세포에서 파생 된 FABP4 immunolabelling의 장점을 보여 줍니다. FABP4 염료 고분자는 레이블이 변경13,14 사용 하는 계보 특정 단백질3,4,5 다른 일반적으로 반대로 성숙 adipocytes의 표현에 변화를 감지할 수 있다 기름 빨간 O15, 나 일 레드16 , 수단 블랙17등. FABP4 immunolabelling의 세포질 형태학 변화 분석과 시각화 수 있습니다. 이것은 양이 많은 반전 녹음 방송 모든 시각화5,18,19 없이 대 본 수준에서 변경 내용을 분석 하는 PCR (RT-정량)를 사용 하 여 앞에서 설명한 방법에 독특한 이점을 ,20또는 정지20일 또는 하 더럽혀 서 세포를 필요로 하는 cytometry 필요 단백질19,20을 lysed 세포. FABP4 immunolabelling 안정 된 고정 셀에서, 솔루션에서 밖으로 누출 되지 않습니다 이며 쉽게 시각화에 대 한 허용 하 고 자동화 된 분석에서 정확도 추가 핵 겹칠 것입니다 cytosolic 단백질 때 세포의 부착 단층에서 분류 되 고.
이 콘텐츠 심사 빨리, 정확 하 고, 재현 고 객관적 이기 때문에 유리 하다. 이미지 수집 및 분석 최소한의 수동 조작이 필요로 악기의 자동 처리에 의존 하 고 이후 그것은 시 약 및 연구원 시간, 비용 효율적인 사용을 위한 한 플랫폼을 제공 합니다. 이 콘텐츠 심사의 재현성 분석 실험31와 여러 가지 요인 정확성에 중요 한 발견 했다. 항 원 식의 정량화는 이미지 품질에 의존합니다. 성공적인 이미지 분석에 대 한 이미지 잘 당 각 채널에서 고 해야 합니다 초점에 회색 값에 대 한 최적의 동적 범위 내에서을 (자동 노출 설정을 이상적입니다). 초점 또는 잘못 된 결과를 포화 이미지 리드 아웃.
이 문서에서 설명 하는 방법의 몇 가지 잠재적인 한계는 다음과 같다. 전문된 이미징 장비 및 분석 소프트웨어에 대 한 요구 사항. 이 문서의 범위 밖에 다른 오픈 소스 소프트웨어 옵션 (예: ImageJ32,33, 피지34, CellProfiler32,35) 비슷한 이미지 세분화를 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다. 작업; 그러나 그들은 다운로드 하 고 온라인 사용할 수 매크로 맞게 하거나 매크로/명령 그들의 특정 분석 파이프라인에 대 한 작성 능력 필요지 않습니다. 모든 자동된 이미징 분석 파이프라인에 배경 잡음의 수준이 이다. 이 크게 파편, 표시 될 수 있습니다 주의 샘플 준비와 이미징 및 분석 플랫폼의 주의 설정에 대 한 필요성을 강조 하 고 불 쌍 한 이미지 품질 또는 분석 오류. 쥐에 FABP4 레이블 undifferentiated 창시자30; 감지 발견 되었습니다. (어떤 미 분화 세포의 구성) 본이 연구에서는 컨트롤 특정 FABP4 얼룩이 없는 동안. 이 아래 점수 FABP4 식 검사의 필요성 undifferentiated 분석 결과 고용은 각 생물 학적 맥락에서 창시자.
순서는 FABP4 라벨 및 얼룩, 기름 빨간 O 생물학으로 관련 될 필요가 이미지 분석에서 출력 측정 사이의 비교를 그립니다. 따라서, 측정, '% 긍정적인 세포' FABP4를 위해 사용 되었다 그리고 '셀 당 얼룩의 영역' 기름 빨간 o.를 위해 사용 되었다 그것은 측정 '% 긍정적인 세포' 기름 빨간 o 이라는 지방 방울을 정확 하 게 주어진된 핵; 특성 수 없었기 때문에 우리의 연구에 셀을 표시 사용 되지 않았습니다. 지방 방울 셀 몸 전체 크기, 수 및 배포에서 상당히 다양 하 고 거의 핵과 겹쳐. 기름 빨간 O 가변성 얼룩 다른 조직 소스;에서 파생 된 세포 사이 존재 반면 긍정적인 세포 법안은 현재 연구에 대 한 적절 한 %, 또 다른 그룹 사용 하고있다 성공적으로 adipocytes 인간의 동맥 줄기 세포22 에서 파생 된 척도를 스팬을 하나의 큰 뚱뚱한 작은 물방울으로 나타나 기름 빨간 O 얼룩은 세포질 및 핵 및 활성화 데이터 % 긍정적인 세포로 제시를 겹쳐.
대조적으로, FABP4 immunolabelling의 형태학은 다른 조직 소스23,,2425의 범위에서 파생 하는 adipocytes에 일치. 차별화의 문화 내의 셀의 비율을 정할 수는 응용 프로그램의 수 있습니다. 성인 중간 엽 기질 세포 치료 사용의 다양 한 범위에 대 한 중요 한 약속을 잡으십시오. 임상 번역 생겨났다는 중요 한 문제는 환자26사이, 절연27,28, 사이트 간에 그리고 격리12 방법 사이의 이러한 세포의 기능에 내재 된 변동성 및 치료 용 세포 숫자12 의 확장. 그것은 표시 되었습니다 이전 부착 stromal 세포의 문화는 자주 다른 유형의 일부 세포 분화 및 일부 12,17 우리의 FABP4로 분석 결과 ASC 문화에 대 한 방법을 보여 줍니다. 이 같은 분석 실험, 농축 기술로 결합, 이질적인 문화 계보 관련 차별화의 능력 안에서 하위 인구를 식별 하는 데 도움이 됩니다. 데이 FABP4 분석 결과 등 표준화, 정량 분석 결과 모든 변수, 그리고 시간과 사이 임상 치료 결과 평가 하는 잠재력 사이 비교에 대 한 간단한 방법을 제공 한다.
반자동 방식에서 FABP4의 정량화는 많은 경우에 기증자 및 샘플 객관성과 재현성 분석에서을 수 있습니다. 또한 라벨은 세포질, 그것은 잠재적으로 수 비만 연구에 상당한 중요성의 구별 증식 (증가 체형), 비 (체형 크기의 확대) 분석을 사용할 어디 비 뚱뚱한 개인21에 많은 장애에 강력 하 게 연관 됩니다. 비만 약물 제어 지질 저장의 식별에 대 한 관심의 상당한을 했다 있다. 이 FABP4 분석 결과 또한 지질 축적을 억제 하기 위해 그들의 능력에 대 한 화합물의 수천을 심사에 대 한 간단한 판독을 제공 한다.

세포 치료 (ISCT) 정의 multipotent mesenchymal stromal 세포를 국제 사회에 의해 설립 하는 주요 요구 사항 중 하나는 셀 adipogenic, osteogenic chondrogenic 혈통으로 차별 하는 능력 있어야 1. 화학 염료1를 사용 하 여 고분자 제품의 검색에 의존 하는이 3 개의 계보에 차별화를 측정의 전통적인 방법. (어떤 지질을 받은 세포에 있는 뚱뚱한 작은 물방울 얼룩) 기름 빨간 O 같은 염료는 저렴 하 고 사용 하기 쉬운; 그러나 그들은 각 각각 리니지2로 중간 엽 세포 분화 때 발생 하는 유전자 발현에서 특정 변경 내용을 검색 하지. 여기, 우리는 지방산 바인딩 단백질-4 (FABP4)3,,45adipogenic 계보 관련 마커 단백질 식을 단정 차별화 분석 결과 개발 했습니다. FABP4 murine 3T3-L1 adipocytes3 에서 처음 발견 하 고 인간의 피하 지방 조직6에 표현 될 나중에 발견 되었다. 그것은 세포에 의해 지방산 통풍 관을 안내 하는 보호자 역할을 하며 lipolysis4과정 참여 cytosolic 단백질.
전조 세포 감 별 법 분석 실험에 사용 했다 지방이 많은 파생된 mesenchymal stromal 세포 (ASCs)7,8. ASCs 골 수 유래 중간 엽 줄기 세포 (MSCs BM), 성인8,9주요 중간 엽 줄기 세포 인구와 많은 속성을 공유. ASCs 제공 임상 응용 프로그램에 여러 이점이 BM MSCs 셀의 큰 수확량 더 쉽게 액세스할 수 조직 소스8,9에서 고립 될 수 있다. 고립 된 세포 인구 ASCs로 정의할 수 특정 기준을 충족 해야 합니다. 첫째, 그들은 표준 문화 조건1플라스틱 조직 문화 배 준수를 제시 해야 합니다. 그들은 또한 특정 표면 항 원 식1을 제시 해야 합니다. 뱀과 ASCs 긍정적인 표면 항 원 표현 CD34, CD73, CD90, 낮은 표현의 CD105, CD45 그리고 HLA-DR10의 부정적인 표현 특징입니다. ASCs (점착 정화 ASCs) 28 일에 대 한 플라스틱에 경작에 의해 순화 CD73 CD90, CD105 긍정적인 표현과 CD34, CD45 그리고 HLA-DR10의 부정적인 표현을 표시 합니다. 마지막으로, 세포는 다양 한 계보1,,78로 분화 하는 능력을 유지 해야 합니다.
그래서 우리는 FABP4, 세포 내에서 단백질을 시각화 하기 위해 immunochemistry를 사용 하 고 다음 단일 셀 수준에 FABP4 식 계량 Adipogenic 차별화 프로토콜 다른 체형 혈통 유전자 사이 FABP4 식의 눈에 띄는 upregulation 유도 자동화 된 형광이 콘텐츠 심사 현미경을 사용 하 여. 이 메서드는 전통적인 염료에 유리한 체형 혈통 차별화의 매우 구체적인 확인 하면. 이러한 유전자 특정 계보 분석 심사 방법 또한 높은 콘텐츠와 결합 사용 특정 계보를 차별화 수 있는 다른 유형의 세포 준비 내의 셀의 비율의 정량화. 우리의 연구에서 우리는 세포 배양 후 갓 격리 ASCs의 adipogenic 감 별 법 잠재력의 손실을 확인 하 FABP4 분석 결과 사용.

<table><tbody><tr><td>트리스 베이스</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td>트리스 완충 식염수</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>머크</td><td>1064041000</td><td>트리스 완충 식염수</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>머크</td><td>1049360500</td><td>트리스 완충 식염수</td></tr><tr><td>아지드화 나트륨</td><td>Scharlau</td><td>SO0091</td><td>카제인 차단제 용액</td></tr><tr><td>카제인</td><td>시그마</td><td>C7078-500G</td><td>카제인 차단 용액</td></tr><tr><td>PBS 정제</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>인산염 완충 식염수</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>10091-148</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (1X), 페놀 레드</td><td>없음 Gibco</td><td>12563-029</td><td>Cell dissociation enzyme</td></tr><tr><td>96 well plate (flat bottom)</td><td>Falcon</td><td>FAL353072</td><td>Cell culture equipment</td></tr><tr><td>T75 culture flask, with filter cap</td><td>Greiner</td><td>658175</td><td>Cell culture equipment</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>19278-5ML</td><td>지방형성 분화 매체</td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>시그마</td><td>D2915-100MG</td><td>지방형성 분화 매체</td></tr><tr><td>인도메타신</td><td>시그마</td><td>I7378-5G</td><td>지방형성 분화 매체</td></tr><tr><td>오일-레드 O</td><td>시그마</td><td>O-0625</td><td>지방 형성을 위한 클래식 염색</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>머크</td><td>1.09634</td><td>지방 형성을 위한 클래식 염색</td></tr><tr><td>16% 포름알데히드</td><td>피어싱</td><td>28908</td><td>세포 고정</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>머크</td><td>100983</td><td>세포 고정</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마</td><td>D9542</td><td>면역세포화학</td></tr><tr><td>안티 토끼 IgG 알렉사 488</td><td>분자 프로브</td><td>A11008</td><td>면역세포화학</td></tr><tr><td>티메로살</td><td>시그마</td><td>T5125-10G</td><td>면역세포화학</td></tr><tr><td>토끼 항-인간 지방산 결합 단백질 4 (FABP4) 항체</td><td>Cayman Chemicals</td><td>10004944</td><td>Marker of adipogenesis</td></tr><tr><td>원심분리기 튜브 (15mL)</td><td>Greiner</td><td>GR188271</td><td>General</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (50mL)</td><td>Greiner</td><td>GR227261-P</td><td>General</td></tr><tr><td>ImageXpress Micro XLS</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>high content screening machine</td></tr><tr><td>MetaXpress</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>High Content 스크리닝 소프트웨어, 버전 5.4.01</td></tr></tbody></table>

시각화 및 간 엽 세포 계보 특정 표시와 함께 adipogenic 차별화 가능성의 정량화

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

여러 가지 염료 검출 하는 adipocytes에 중간 엽 세포의 분화에서 사용 하기 위해 현재 사용할 수 있습니다. 염료, 기름 빨간 O, 등 있으며 저렴 한, 사용 하기 쉽고 널리 사용 중간 엽 세포의 adipogenic 잠재력을 분석 하는 실험실에 의해. 그러나, 그들은 유전자 녹음 방송에 있는 변화에 특정 되지 않습니다. 들어오면 중간 엽 세포는 그것의 운명 adipogenic 계보를 분석 하는 유전자 특정 차별화 분석 결과 개발 했습니다. 지방산 바인딩 단백질-4 (FABP4), adipogenic 차별화의 계보 특정 표식에 대 한 면역 라벨 시각화 및 차별화 된 셀의 정량화를 사용할 수 있습니다. Adipogenic 96 잘 microplate 형태로 중간 엽 세포의 감 별 법 잠재력을 계량 수 응용 프로그램의 수에 대 한 유망한 의미를 갖는다. 성인 중간 엽 기질 세포의 사용을 포함 하는 임상 시험의 수백 그리고 현재 시간과 같은 임상 시험의 사이 특히 치료 결과 연관 어렵다. 이 간단한 높은 처리량 FABP4 분석 결과 환자 파생 된 세포의 분화 가능성을 평가 대 한 양적 분석 결과 제공 하 고 다른 격리 및 확장 메서드를 비교 하기 위한 강력한 도구입니다. 이것은 특히 중요 한 엽 셀 제품에 환자에 게 투여 되 고 세포의이 성분의 증가 인식 주어진입니다. 분석 결과 또한 비만 사전 당뇨병 연구에서 특히 높은 처리량 마약 검사에서 잠재적인 유틸리티가 있다.

이 연구는 adipogenic 차별화의 잠재력 ASCs 3 다른 방법으로 측정 되었다. 이 표시의 세포질을 지 방화 했다 FABP4의 immunofluorescent 라벨 세포, 분화 그리고 DAPI 이라는 핵 (그림 1A)와 겹쳐 있는 라벨. 자동된 이미지 분석 공개 늦은 통로 세포 (그림 1B)의 6.9 배 증가에 비해 초기 통로 세포에 차별화 된 그룹에서 FABP4 긍정적인 세포의 %에서 24.6 배 증가 했다. 뚱뚱한 작은 물방울의 차별화 된 셀, cytosol에 걸쳐 분산에 지역화는 기름 빨간 O 얼룩 그리고 DAPI 이라는 핵;와 거의 겹쳐는 라벨 그러나 시력 검사에서 초기 통로 세포 (그림 2A)에 비해 늦은 통로 세포에 있는 뚱뚱한 작은 물방울을 기름 빨간 O와 관련 된 적은 세포 핵이 있다. 자동된 이미지 분석 공개 기름 빨간 O 셀 초기 통로 세포에 및 늦게 통과 셀 (그림 2B)에 셀 당 지역 얼룩에 53.9 배 증가 당 얼룩의 영역에서 11.1 배 증가 했다. 두 얼룩의 이미징 수행한, 그리고 (그림 1의 보충, 보충 표 2-5) 소프트웨어에 셀 점수 (FABP4) 또는 Transfluor (기름 빨간 O) 모듈을 사용 하 여 계량. FABP4 식의 upregulation는 서쪽 오 점 분석 (그림 3, 보충 그림 5)에 의해 확인 됐다. 모든 3 분석 방법 초기 통로 ASCs 늦은 통로 세포 보다 잠재적인 더 높은 adipogenic 차별화는 밝혔다. Adipogenic 차별화는 잘 (보충 그림 2, 3) 당 총 세포 수에 영향을 미치지 않았다. 그러나, FABP4-긍정적인 분화 세포의 핵 크기는 늦게 통과 ASCs만에 대 한 제어 셀 보다 훨씬 작습니다 (보충 그림 3).
셀 문화, 확장 또는 passaged, adipogenic 분화 감소, 이전 게시 된 데이터11일치의 문화 내의 셀의 비율으로 증명 하는. 그것은 나이, 몸 대량 색인 또는 이전 병력12 같은 요인 수 하지 수이 연구에 대 한 제어 및 가능성이 다른 기증자 샘플 (보충 표 1) 사이 관찰 하는 다양성에 기여 해야 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57153/57153fig1.jpg"> 그림 1 : FABP4 immunolabelling 초기 통로 세포 나중 통로 셀 보다 큰 차별화 가능성을 있음을 보여준다. A) 대표 이미지 초기와 후반 통로, 제어 및 DAPI (핵 얼룩)와 FABP4 이라는 차별화 된 셀 병합 및 분할 이미지와 함께 표시 됩니다. 이미지 표시 세분화 녹색 오버레이 셀과 빨간색 오버레이 미 분화 세포 분화. 그러나 셀을 표현 FABP4 B)는 크게 증가 adipogenic 분화 초기와 후반 통로 세포에 관찰 했다, 초기 통로 셀 늦게 통과 셀 (맨 휘트니 보다 차별화에 상당히 큰 증가 설명 하는, 테스트 * P를 나타냅니다 &lt; 0.05와 * * * P를 나타냅니다 &lt; 0.001). 초기 통로 걸쳐 표시 되는 데이터는 평균 (p4; n = 8) 또는 늦은 통로 (p10, n = 4) 기증자 샘플, ± SEM. <a href="/files/ftp_upload/57153/57153fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57153/57153fig2.jpg"> 그림 2 : 초기 통로 세포 나중 통로 셀 보다 큰 차별화 가능성을 있음을 보여준다 기름 빨간 O 얼룩. A) DAPI (핵 얼룩) 및 기름 빨간 O (회색, 지질 작은 물방울 얼룩)의 대표 이미지 병합 및 분할 이미지와 함께 표시 됩니다. 분할 이미지 묘사 녹색 오버레이 모든 핵 및 기름 빨간 O 스테인드 빨간색 오버레이 지질 방울. B) 기름 빨간 O 얼룩 지역에서 크게 증가 adipogenic 차별화로 관찰 되었다. 초기 통로 셀 늦은 통로 세포에 비해 세포 당 기름 빨간 O 얼룩의 더 중대 한 지역으로 나타났다. 기름 빨간 O 셀 (μ m2) 당 얼룩의 지역 사용 adipogenic 감 별 법 잠재력의 측정으로 여기. 초기 통로 걸쳐 표시 되는 데이터는 평균 (p4; n = 8) 또는 늦은 통로 (p10; n = 4) 기증자 샘플, ± SEM (맨 휘트니 테스트 * P를 나타냅니다 = &lt; 0.05와 * * * P는 = &lt; 0.001). <a href="/files/ftp_upload/57153/57153fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57153/57153fig3.jpg"> 그림 3 : FABP4 단백질 식 수준 차별화 일찍 하 고 늦게 통과 ASCs의 서쪽 오 점 분석. 총 단백질 로딩 제어, 베타 걸 (ACTB), 이른 대목에서 고 분화 낮은 정도 늦게 통로에 FABP4 immunolabelling는 크게 증가 했다의 비율으로 FABP4 밴드의 광학 밀도의 반 정량 분석 셀입니다. 초기 통로 걸쳐 표시 되는 데이터는 평균 (p4; n = 8) 또는 늦은 통로 (p10; n = 4) 기증자 샘플, ± SEM (맨 휘트니 테스트 * P를 나타냅니다 = &lt; 0.05와 * * * P는 = &lt; 0.001). <a href="/files/ftp_upload/57153/57153fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>대상 항 원</td>
			<td>Isotype (복제)</td>
			<td>종</td>
			<td>희석</td>
		</tr>
<tr>
<td>FABP4</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>토끼</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 1 차적인 항 체
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>항 체를 대상으로</td>
			<td>Fluorophore 레이블</td>
			<td>종</td>
			<td>희석</td>
		</tr>
<tr>
<td>토끼 IgG</td>
			<td>알 렉 사 플 루 오로 488</td>
			<td>염소</td>
			<td>1: 200</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 이차 항 체
보충 그림 1: 이미지 분석 가상 환경의 개요. 얼룩진된 셀 편견의 모든 소스를 피하기 위해 자동화, 높은 처리량 형광 현미경을 사용 하 여 몇 군데 있었다. 이미지는 ImageXpress 마이크로 XLS를 사용 하 여 인수, MDCStore 데이터 관리자 데이터베이스에 직접 저장 및 사용자 최적화 하 고 그들의 특정 분석 매개 변수 테스트를 사용 하 여 가상 데스크톱 연결을 통해 볼 수 있도록 공개 했다. 이미지는 여러 다른 사용자가 자동 실행 큐에 '작업'을 보낼 수 있는 전용된 '자동 실행' 인스턴스를 함께 분석 했다. 사용자는 그들의 '작업이 완료 되 면 가상 인스턴스를 통해 데이터를 검색할 수 있습니다. <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_Figure_1.jpg" target="_blank">이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 2: 총의 비교 제어의 당 수를 세포 및 분화 초기와 후반 통로 ASCs, FABP4 접시 스테인드를 사용 하 여에 대 한 웰 스. 초기 통로 걸쳐 표시 되는 데이터는 평균 (p4; n = 8) 또는 늦은 통로 (p10, n = 4) 기증자 샘플, ± SEM. 제어 및 초기와 후반 통과 ASCs 위해 차별화 된 셀 사이 통계적으로 유의 한 차이가 없었다. 늦은 통로 세포에 비해 초기 통로 세포에 대 한 잘 당 더 많은 셀을 확인 하 고 있었다. <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_Figure_2.tif" target="_blank">이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 3: 총의 비교 제어의 당 수를 세포 및 분화 초기와 후반 통로 ASCs, 기름 빨간 O 묻은 접시를 사용 하 여에 대 한 웰 스. 초기 통로 걸쳐 표시 되는 데이터는 평균 (p4; n = 8) 또는 늦은 통로 (p10, n = 4) 기증자 샘플, ± SEM. 제어 및 초기와 후반 통과 ASCs 위해 차별화 된 셀 사이 통계적으로 유의 한 차이가 없었다. <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_Figure_3.tif" target="_blank">이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 4: 나중 구절에서 FABP4 긍정적인 했다 차별화 된 셀 컨트롤 스에서 세포 보다 훨씬 작은 핵 영역을 했다. 초기 통로에 제어 및 차별화 된 셀 사이의 핵 영역에서 통계적으로 유의 한 차이가 없었다. 초기 통로 걸쳐 표시 되는 데이터는 평균 (p4; n = 8) 또는 늦은 통로 (p10; n = 4) 기증자 샘플, ± SEM. (홀된 t 테스트 * * * P는 = &lt; 0.001). 평균 ± SEM 표시 됩니다.) <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_Figure_4.tif" target="_blank">이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 5: 이미지의 서쪽 오 점 젤. 빨강 채널 베타 걸 보여준다. 녹색 채널 묘사 FABP4 immunolabelling. <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_Figure_5.tiff" target="_blank">이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 1: 기증자의 Clinicopathological 정보 <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_table_1.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 2: 이미징 설정 (FABP4) <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_table_2.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 3: 이미징 설정 (기름 빨간 O) <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_table_3.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 4: 분석 매개 변수 사용 (FABP4)의 테이블. 셀 점수 모듈입니다. <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_table_4.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 5: 테이블 분석 매개 변수 사용 (기름 빨간 O). 트랜스 형 석 모듈입니다. <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_table_5.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Adipogenic 차별 평가의 전통적인 방법은 저렴 하 고 사용 하기 쉬운, 하지만 특정 유전자 발현에서 변화 하지 않습니다. 성숙한 adipocytes 계보 특정 마커를 사용 하 여에 중간 엽 세포 분화 척도를 분석 결과 개발 했습니다. 이 분석 결과 기초 연구 및 임상 의학에 걸쳐 다양 한 응용 프로그램 있다.

시각화 및 간 엽 세포 계보 특정 표시와 함께 Adipogenic 차별화 가능성의 정량화

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...

이 절차의 전반적인 목표는 계통 특이적 단백질 마커인 fatty acid binding protein four를 사용하여 기질 세포가 지방생성 계통으로 분화되는 것을 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 관심 기질 세포를 분리하고 확장함으로써 달성됩니다. 그런 다음 기질 세포를 수확하여 표준 체외 배양 플레이트에 도말합니다.며칠 동안 배양한 후, 세포는 지방생성 분화 배지로 처리됩니다. 세포는 14일 동안 배양하며 정기적인 배지 교체를 수행합니다. 분화 후, 세포는 고정되고 지방산 결합 단백질 4에 대한 항체로 염색됩니다.자동화된 High-Content 스크리닝 면역형광 현미경은 마이크로웰 플레이트에서 라벨링된 세포의 이미지를 캡처하는 데 사용됩니다. 그런 다음 특수 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 차별화를 정량화합니다. Oil Red O와 같은 염료를 사용하여 지방생성 분화를 측정하는 기존 방법과 달리, 이 비디오에 설명된 분석은 계통 특이적 단백질인 지방산 결합 단백질 4에 대한 항체를 사용하여 지방생성 분화를 확인합니다.이를 통해 이 방법은 지방생성 분화에 해당하는 유전자 발현의 변화를 정량화합니다. 이 분석은 분화된 세포의 비율, 세포당 형광 신호의 강도, 세포 형태의 변화를 포함한 풍부한 정보를 제공할 수 있습니다. 여러 특성을 분석할 수 있는 기능을 통해 다양한 처리에 대한 반응으로 분화의 잠재적인 미묘한 변화를 식별할 수 있습니다.이 분석은 또한 높은 스루 풀 기능을 가지고 있어 높은 스루 풀 약물 스크리닝 응용 분야에 이상적입니다. 10% 소 태아 혈청, GlutaMAX 및 항생제가 보충된 DMEM/F-12 기저 배지인 완전한 ASC 배지에서 세포를 재현탁합니다. 웰당 5000개 세포의 96웰 배양 플레이트에 피펫팅합니다.각 기증자당 8개의 우물이 필요합니다. 4개의 웰은 제어 매체를 받고 나머지는 분화 매체를 받습니다. 각 처리의 4번째 웰마다 노드 1차 대조군에 서비스를 제공합니다.37도에서 세포를 배양하고 4일 동안 5% 이산화탄소의 대기 조건으로 가습합니다. 이것은 세포가 각 웰에서 합류하도록 성장할 수 있도록 하기 위한 것입니다. 4일째가 되면 인큐베이터에서 플레이트를 꺼냅니다.각 웰에서 미디어의 절반을 제거합니다. 인슐린, 이소부틸메틸크산틴, 덱사메타손 및 인도메타손이 보충된 완전한 ASC 배지 또는 지방생성 분화 배지를 동일한 부피로 추가합니다. 플레이트를 37도에서 배양하고 5% 이산화탄소의 대기 조건으로 가습합니다.충분한 차별화에 필요한 기간은 14일입니다. 이 기간 동안 2-3일마다 미디어 교체를 수행하여 미디어를 보충합니다. 차별화 후 인큐베이터에서 플레이트를 꺼냅니다.각 웰에서 모든 매체를 조심스럽게 피펫으로 빼냅니다. 얼음처럼 차가운 메탄올을 첨가하여 세포를 고정합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.메탄올을 제거한 다음 Tris-buffered saline으로 세척합니다. 카제인 차단제의 0.25%를 첨가하여 차단합니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다.카제인을 제거한 다음 Tris-buffered saline으로 세척하십시오. 항체 희석 완충액에서 anti-FABP4 항체를 200배 희석하여 1차 항체 혼합물을 준비합니다. 노드 1차 제어로 예약된 웰을 제외한 모든 웰에 혼합물을 추가합니다.대신 이 웰에 항체 희석 완충액을 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 Tris-buffered saline으로 세포를 한 번 씻어냅니다.제거하고 Tris-buffered fresh saline을 추가한 다음 로커에서 5분 동안 배양합니다. 이 과정을 두 번 반복합니다. 항체 희석 완충액에 Anti-Rabbit Alexa 488 second 재항체를 200배 희석하여 두 번째 재항체 혼합물을 준비합니다.세포핵을 라벨링하는 DAPI를 1에서 2000의 최종 희석으로 추가합니다. 혼합물을 모든 웰에 넣고 광표백을 방지하기 위해 호일로 플레이트를 감쌉니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다.배양 후 TBS로 세포를 세척하고 로커에서 15분 동안 두 번 세척합니다. 우물에서 모든 완충액을 제거하고 티메로살 밀리리터당 0.4mg이 보충된 저장 완충액을 추가하여 박테리아 성장을 방지합니다. 자동화된 스테이지, 초점 대물렌즈 및 필터를 갖춘 high-content screening 기계는 이 생물학적 분석을 이미지화하는 데 사용됩니다.올바른 필터가 설치되어 있는지 확인하십시오. 최상의 품질을 위해 접시 바닥을 청소하십시오. 플레이트를 s에 적재tage A1이 왼쪽 상단 모서리에 위치합니다.플레이트 획득 마법사를 사용하여 플레이트 번호, 배율, 날짜, 실험 조건 및 라벨링 세부 정보와 같은 실험에 대한 필수 정보를 기록합니다. 사용된 마이크로웰 플레이트의 유형을 선택합니다. 사용자는 유정과 취득할 부지 수를 선택할 수 있습니다.그리드를 강조 표시하여 이미지화할 모든 웰을 선택합니다. 무대를 가장 밝은 우물로 이동합니다. 가장 밝은 웰을 선택하면 모든 이미지가 선형 범위에 있는 픽셀-회색 값으로 획득되므로 염색 강도에 정비례합니다.이 단계를 수행하지 않으면 더 밝은 웰에서 촬영한 이미지가 과포화될 수 있습니다. 실험에 적합한 채널 조합, 노출 시간 및 Z-오프셋 파라미터를 선택합니다. FABP4 및 DAPI의 이미징에 사용되는 필터는 염색을 시각화하는 데 사용되는 특정 라벨에 해당합니다.480나노미터에서 여기하고 560나노미터에서 방출하는 Alexa 488을 사용하여 FABP4를 시각화했습니다. 그리고 360나노미터에서 여기하고 460나노미터에서 방출하는 DAPI 염료를 사용하여 세포핵을 시각화했습니다. Oil Red O로 표시된 플레이트의 경우 지방 방울을 밝은 연료 투과광으로 시각화했습니다.또한 Oil Red O 라벨은 575나노미터에서 여기하고 630나노미터에서 방출하기 때문에 형광으로 시각화되었습니다. 모든 설정이 완료되면 생물학적 분석을 획득할 준비가 된 것입니다. 이미지는 온라인 서버에 자동으로 저장되므로 이미지에 대한 원격 액세스가 용이합니다.온라인 서버에 저장된 전체 이미지 집합은 원격 데스크톱 프로그램을 사용하여 액세스할 수 있습니다. 그런 다음 MetaXpress 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석할 수 있습니다. 세포 스코어링 애플리케이션을 통해 사용자는 이 경우 DAPI와 같은 필드의 모든 핵을 검출하기 위한 파장을 선택할 수 있습니다.후속 파장을 사용하여 핵, 세포질 또는 두 세포 위치에서 positive marker를 검출할 수 있습니다. 지방산 결합 단백질 4 또는 FABP4는 지방 생성 계통의 마커입니다. FABP4의 발현은 분화된 지방세포의 핵과 세포질에 국한되어 있습니다.이 생물학적 분석에서는 세포 스코어링 모듈을 사용하여 FABP4 발현을 분석합니다. 먼저, DAPI 채널을 사용하여 백그라운드 위의 크기 및 신호 강도에 대한 사용자 정의 매개변수를 사용하여 세포핵을 검출합니다. 피트 C 채널을 사용하여 FABP4 신호를 감지하고 배경 위의 크기 및 신호 강도에 대한 사용자 정의 매개변수를 사용합니다.이 생물학적 분석에서 560나노미터 범위에서 꽃을 피우는 오일-레드-O 표지 지방 방울을 MetaXpress 캔 모듈인 Transflour로 분석했습니다. 이 분석 알고리즘은 사용자가 지정한 세포 크기 및 염색 강도 기준을 충족하는 DAPI 표지 핵을 사용하여 전체 세포를 검출합니다. 사용자는 또한 구덩이의 크기와 강도를 지정하며, 이 경우 세포핵에 가까운 지방 방울을 감지합니다.지방 방울 크기, 염색 강도, 세포당 수에 관한 정보는 Transflour 분석에 의해 기록됩니다. 오일 레드 O 라벨이 일부 세포에서 누출되거나 용해되어 잠재적으로 발생하는 분화의 실제 양을 제한하고 혼란스럽게 할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. DAPI, 핵 염색제 및 FABP4로 표지된 초기 및 후기 계대, 대조군 및 분화된 세포의 대표적인 이미지가 병합 및 분할 이미지와 함께 표시됩니다.분할 영상은 분화된 세포를 녹색 오버레이로 표시하고 미분화된 세포를 빨간색 오버레이로 표시합니다. FABP4를 발현하는 세포의 비율은 지방생성 분화 가능성의 척도로 사용되었습니다. FABP4 발현 세포의 현저한 증가는 초기 및 후기 계대 세포에서 지방 생성 분화와 함께 관찰되었습니다.초기 계대 세포는 후기 계대 세포보다 분화가 유의하게 더 많이 증가한 것으로 나타났습니다. DAPI와 Oil Red O의 대표 이미지는 병합 및 분할 이미지와 함께 표시됩니다. 분할 이미지는 모든 핵을 녹색 오버레이로 나타내고, 오일-레드-O-염색된 지질 방울은 빨간색 오버레이를 나타냅니다.세포당 Oil Red O 염색 면적은 지방생성 분화 가능성의 척도로 사용되었습니다. 오일 레드 O 염색 영역의 현저한 증가는 지방 생성 분화와 함께 관찰되었습니다. 초기 배양 세포는 후기 배양 세포에 비해 세포당 더 넓은 오일 레드 O 염색 영역을 보여주었습니다.웨스턴 블롯은 분화된 초기 및 후기 계대 ASC의 FABP4 단백질 발현 수준을 분석하기 위해 수행되었습니다. 총 단백질 로딩 대조군의 비율로 나타낸 FABP4 밴드의 광학 밀도에 대한 반정량 분석은 FABP4 면역 표지가 초기 계대에서 유의하게 증가했으며, 후기 계대 분화 세포에서 더 적은 정도로 증가한 것으로 나타났습니다. 이 동영상을 시청하면 줄기세포를 지방형성 계통으로 분화하는 방법, 지방형성 유전자 특이적 마커인 지방산 결합 단백질 4를 사용하여 면역형광 염색을 수행하는 방법, 마지막으로 지방산 결합 단백질 4에 대해 면역 양성인 세포의 모든 관련 형태학적 특징을 이미지화하고 분석하는 방법을 이해할 수 있었을 것입니다.이 비디오가 연구에 도움이 되기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 다능성 검사를 통해 피하 지방 조직에서 돼지 지방 유래 줄기 세포(pADSC)를 분리하는 방법을 설명합니다. 다분성 pADSC는 지방 세포 분화 과정을 설명하고 재생 연구를 위해 중배엽 중간엽의 여러 세포 계통 또는 외배엽 및 내배엽의 추가 계통으로의 전분화를 연구하는 데 사용됩니다.

돼지 피하 지방이 조직에서 분리 및 지방이 유래 줄기 세포의 분화

여기에서는 MCS (Magnetic-activated Cell Sorting)를 사용하여 Perivascular Adipose Tissue (PVAT)에서 지방 세포 전구 세포 (Adipocyte Progenitor Cell, APC) 개체군을 분리하는 방법을보고합니다. 이 방법은 FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting)와 비교할 때 지방 조직 1g 당 APC의 증가 된 분리를 허용합니다.

자기 활성화 세포 정렬에 의해 분리 된 혈관 주위 지방 조직으로부터의 지방 전구 세포 전구 세포의 확장 및 지방 생성 유도

지방 조직 혈관 창시자에서 흰색과 베이지색 adipocytes의 차별화는 비만에 대사 개선 위한 잠재력을 맺는 다. 우리는 CD34 + CD31 + 인간의 지방에서 내 피 세포 격리 및 후속 시험관에 확장 및 차별화 흰색과 베이지색 adipocytes에 프로토콜을 설명합니다. 여러 다운스트림 응용 프로그램을 설명 합니다.

절연, 확장, 및 Adipogenic CD34 + CD31 + 인간의 Omental 및 피하 지방 조직에서 내 피 세포의 유도

이 프로토콜의 목적은 여러 셀 혈통으로 차별 하는 인간의 혈관 주위 지방 조직에서 파생 된 조상 세포의 능력을 테스트 하는. 체형, osteocyte, 및 chondrocyte 혈통으로 차별화 하는 데 알려져 있다 인간의 골 수에서 파생 된 중간 엽 줄기 세포 분화와 비교 되었다.

인간의 대동맥 혈관 주위 지방 조상 세포의 분화 능력

우리는 Wnt-1 Cre+/-의경피적 지방 조직으로부터 신경 문장 유래 지방 유래 줄기 세포(NCADSCs)의 분리, 배양 및 지방 흡입을 위한 프로토콜을 제시한다. Rosa26RFP/+ 마우스. NCADSCs는 시험관내 지질 발생 또는 지방 형성을 모델링하기 위한 ADSC의 쉽게 접근할 수 있는 공급원이 될 수 있다.

신경 문장 원래 지방 유래 줄기 세포의 격리, 문화 및 지방 유도는 periaortic 지방 조직에서

이 프로토콜은 쥐 골격 근에서 섬유-선화 선조 (FAP) 및 근생 선조 (의원)를 격리하는 방법을 설명합니다. 근육 상해 모형에 있는 쥐의 활용은 분석을 위한 위축근에서 증가한 조직 가용성및 자유로운 움직이는 동물에 있는 근육 강도 및 걸음걸이를 평가하기 위하여 검증된 방법의 더 큰 레퍼토리를 제공합니다.

쥐의 골격 근육에서 섬유 선화 (FAP) 및 근생 전구자 (의원)의 식별, 격리 및 특성화

이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 순수한 지방세포 집단의 생성을 허용합니다. 레티노산은 iPSC를 지방세포 생성에 사용되는 중간엽 줄기세포(MSC)로 분화시키는 데 사용됩니다. 그런 다음 나일 레드 염색을 기반으로 한 분류 접근법을 사용하여 순수한 지방 세포를 얻습니다.

지방 세포 관련 장애를 연구하기 위해 인간 iPSC를 순수한 지방 세포 집단으로 강력하게 분화

지방세포는 갓 태어난 마우스의 견갑골 간 갈색 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 분리하여 지질 방울을 축적하고 분자 마커를 발현하며 성숙한 갈색 지방세포의 미토콘드리아 형태를 보여주는 세포로 분화합니다. 이러한 세포는 면역 형광 및 투과 전자 현미경으로 추가로 분석됩니다.

Differentiation and Imaging of brown adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice(신생아 마우스의 견갑간 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 갈색 지방세포의 분화 및 이미징)

이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐에서 지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 분리하고 식별하는 방법론을 설명합니다.

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

본 프로토콜은 마우스에서 매우 균일한 골수 중간엽 줄기세포(BMSC)를 정제, 확장 및 특성화하는 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 증식 및 분화 가능성이 높은 BMSC를 대량으로 획득할 수 있도록 하여 마우스 모델을 지원하고 전임상 연구를 발전시킵니다.

Purification, Expansion, and Flow Cytometry-Based Phenotyping of Mouse Derived Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

배우세요 지방세포 분화 정량화 방법을 면역형광 기술과 FABP4 계열 특이 표지자를 사용하여. 이 고내용 스크리닝 기법은 약물 스크리닝을 위한 고효율 분석이 가능합니다.

시각화 및 간 엽 세포 계보 특정 표시와 함께 Adipogenic 차별화 가능성의 정량화

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