시각화 및 간 엽 세포 계보 특정 표시와 함께 Adipogenic 차별화 가능성의 정량화
March 31st, 2018
Adipogenic 차별 평가의 전통적인 방법은 저렴 하 고 사용 하기 쉬운, 하지만 특정 유전자 발현에서 변화 하지 않습니다. 성숙한 adipocytes 계보 특정 마커를 사용 하 여에 중간 엽 세포 분화 척도를 분석 결과 개발 했습니다. 이 분석 결과 기초 연구 및 임상 의학에 걸쳐 다양 한 응용 프로그램 있다.
이 절차의 전반적인 목표는 계통 특이적 단백질 마커인 fatty acid binding protein four를 사용하여 기질 세포가 지방생성 계통으로 분화되는 것을 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 관심 기질 세포를 분리하고 확장함으로써 달성됩니다. 그런 다음 기질 세포를 수확하여 표준 체외 배양 플레이트에 도말합니다.
며칠 동안 배양한 후, 세포는 지방생성 분화 배지로 처리됩니다. 세포는 14일 동안 배양하며 정기적인 배지 교체를 수행합니다. 분화 후, 세포는 고정되고 지방산 결합 단백질 4에 대한 항체로 염색됩니다.
자동화된 High-Content 스크리닝 면역형광 현미경은 마이크로웰 플레이트에서 라벨링된 세포의 이미지를 캡처하는 데 사용됩니다. 그런 다음 특수 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 차별화를 정량화합니다. Oil Red O와 같은 염료를 사용하여 지방생성 분화를 측정하는 기존 방법과 달리, 이 비디오에 설명된 분석은 계통 특이적 단백질인 지방산 결합 단백질 4에 대한 항체를 사용하여 지방생성 분화를 확인합니다.
이를 통해 이 방법은 지방생성 분화에 해당하는 유전자 발현의 변화를 정량화합니다. 이 분석은 분화된 세포의 비율, 세포당 형광 신호의 강도, 세포 형태의 변화를 포함한 풍부한 정보를 제공할 수 있습니다. 여러 특성을 분석할 수 있는 기능을 통해 다양한 처리에 대한 반응으로 분화의 잠재적인 미묘한 변화를 식별할 수 있습니다.
이 분석은 또한 높은 스루 풀 기능을 가지고 있어 높은 스루 풀 약물 스크리닝 응용 분야에 이상적입니다. 10% 소 태아 혈청, GlutaMAX 및 항생제가 보충된 DMEM/F-12 기저 배지인 완전한 ASC 배지에서 세포를 재현탁합니다. 웰당 5000개 세포의 96웰 배양 플레이트에 피펫팅합니다.
각 기증자당 8개의 우물이 필요합니다. 4개의 웰은 제어 매체를 받고 나머지는 분화 매체를 받습니다. 각 처리의 4번째 웰마다 노드 1차 대조군에 서비스를 제공합니다.
37도에서 세포를 배양하고 4일 동안 5% 이산화탄소의 대기 조건으로 가습합니다. 이것은 세포가 각 웰에서 합류하도록 성장할 수 있도록 하기 위한 것입니다. 4일째가 되면 인큐베이터에서 플레이트를 꺼냅니다.
각 웰에서 미디어의 절반을 제거합니다. 인슐린, 이소부틸메틸크산틴, 덱사메타손 및 인도메타손이 보충된 완전한 ASC 배지 또는 지방생성 분화 배지를 동일한 부피로 추가합니다. 플레이트를 37도에서 배양하고 5% 이산화탄소의 대기 조건으로 가습합니다.
충분한 차별화에 필요한 기간은 14일입니다. 이 기간 동안 2-3일마다 미디어 교체를 수행하여 미디어를 보충합니다. 차별화 후 인큐베이터에서 플레이트를 꺼냅니다.
각 웰에서 모든 매체를 조심스럽게 피펫으로 빼냅니다. 얼음처럼 차가운 메탄올을 첨가하여 세포를 고정합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
메탄올을 제거한 다음 Tris-buffered saline으로 세척합니다. 카제인 차단제의 0.25%를 첨가하여 차단합니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다.
카제인을 제거한 다음 Tris-buffered saline으로 세척하십시오. 항체 희석 완충액에서 anti-FABP4 항체를 200배 희석하여 1차 항체 혼합물을 준비합니다. 노드 1차 제어로 예약된 웰을 제외한 모든 웰에 혼합물을 추가합니다.
대신 이 웰에 항체 희석 완충액을 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 Tris-buffered saline으로 세포를 한 번 씻어냅니다.
제거하고 Tris-buffered fresh saline을 추가한 다음 로커에서 5분 동안 배양합니다. 이 과정을 두 번 반복합니다. 항체 희석 완충액에 Anti-Rabbit Alexa 488 second 재항체를 200배 희석하여 두 번째 재항체 혼합물을 준비합니다.
세포핵을 라벨링하는 DAPI를 1에서 2000의 최종 희석으로 추가합니다. 혼합물을 모든 웰에 넣고 광표백을 방지하기 위해 호일로 플레이트를 감쌉니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다.
배양 후 TBS로 세포를 세척하고 로커에서 15분 동안 두 번 세척합니다. 우물에서 모든 완충액을 제거하고 티메로살 밀리리터당 0.4mg이 보충된 저장 완충액을 추가하여 박테리아 성장을 방지합니다. 자동화된 스테이지, 초점 대물렌즈 및 필터를 갖춘 high-content screening 기계는 이 생물학적 분석을 이미지화하는 데 사용됩니다.
올바른 필터가 설치되어 있는지 확인하십시오. 최상의 품질을 위해 접시 바닥을 청소하십시오. 플레이트를 s에 적재tage A1이 왼쪽 상단 모서리에 위치합니다.
플레이트 획득 마법사를 사용하여 플레이트 번호, 배율, 날짜, 실험 조건 및 라벨링 세부 정보와 같은 실험에 대한 필수 정보를 기록합니다. 사용된 마이크로웰 플레이트의 유형을 선택합니다. 사용자는 유정과 취득할 부지 수를 선택할 수 있습니다.
그리드를 강조 표시하여 이미지화할 모든 웰을 선택합니다. 무대를 가장 밝은 우물로 이동합니다. 가장 밝은 웰을 선택하면 모든 이미지가 선형 범위에 있는 픽셀-회색 값으로 획득되므로 염색 강도에 정비례합니다.
이 단계를 수행하지 않으면 더 밝은 웰에서 촬영한 이미지가 과포화될 수 있습니다. 실험에 적합한 채널 조합, 노출 시간 및 Z-오프셋 파라미터를 선택합니다. FABP4 및 DAPI의 이미징에 사용되는 필터는 염색을 시각화하는 데 사용되는 특정 라벨에 해당합니다.
480나노미터에서 여기하고 560나노미터에서 방출하는 Alexa 488을 사용하여 FABP4를 시각화했습니다. 그리고 360나노미터에서 여기하고 460나노미터에서 방출하는 DAPI 염료를 사용하여 세포핵을 시각화했습니다. Oil Red O로 표시된 플레이트의 경우 지방 방울을 밝은 연료 투과광으로 시각화했습니다.
또한 Oil Red O 라벨은 575나노미터에서 여기하고 630나노미터에서 방출하기 때문에 형광으로 시각화되었습니다. 모든 설정이 완료되면 생물학적 분석을 획득할 준비가 된 것입니다. 이미지는 온라인 서버에 자동으로 저장되므로 이미지에 대한 원격 액세스가 용이합니다.
온라인 서버에 저장된 전체 이미지 집합은 원격 데스크톱 프로그램을 사용하여 액세스할 수 있습니다. 그런 다음 MetaXpress 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석할 수 있습니다. 세포 스코어링 애플리케이션을 통해 사용자는 이 경우 DAPI와 같은 필드의 모든 핵을 검출하기 위한 파장을 선택할
수 있습니다.후속 파장을 사용하여 핵, 세포질 또는 두 세포 위치에서 positive marker를 검출할 수 있습니다. 지방산 결합 단백질 4 또는 FABP4는 지방 생성 계통의 마커입니다. FABP4의 발현은 분화된 지방세포의 핵과 세포질에 국한
되어 있습니다.이 생물학적 분석에서는 세포 스코어링 모듈을 사용하여 FABP4 발현을 분석합니다. 먼저, DAPI 채널을 사용하여 백그라운드 위의 크기 및 신호 강도에 대한 사용자 정의 매개변수를 사용하여 세포핵을 검출합니다. 피트 C 채널을 사용하여 FABP4 신호를 감지하고 배경 위의 크기 및 신호 강도에 대한 사용자 정의 매개변수를 사용합니다.
이 생물학적 분석에서 560나노미터 범위에서 꽃을 피우는 오일-레드-O 표지 지방 방울을 MetaXpress 캔 모듈인 Transflour로 분석했습니다. 이 분석 알고리즘은 사용자가 지정한 세포 크기 및 염색 강도 기준을 충족하는 DAPI 표지 핵을 사용하여 전체 세포를 검출합니다. 사용자는 또한 구덩이의 크기와 강도를 지정하며, 이 경우 세포핵에 가까운 지방 방울을 감지합니다.
지방 방울 크기, 염색 강도, 세포당 수에 관한 정보는 Transflour 분석에 의해 기록됩니다. 오일 레드 O 라벨이 일부 세포에서 누출되거나 용해되어 잠재적으로 발생하는 분화의 실제 양을 제한하고 혼란스럽게 할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. DAPI, 핵 염색제 및 FABP4로 표지된 초기 및 후기 계대, 대조군 및 분화된 세포의 대표적인 이미지가 병합 및 분할 이미지와 함께 표시됩니다.
분할 영상은 분화된 세포를 녹색 오버레이로 표시하고 미분화된 세포를 빨간색 오버레이로 표시합니다. FABP4를 발현하는 세포의 비율은 지방생성 분화 가능성의 척도로 사용되었습니다. FABP4 발현 세포의 현저한 증가는 초기 및 후기 계대 세포에서 지방 생성 분화와 함께 관찰되었습니다.
초기 계대 세포는 후기 계대 세포보다 분화가 유의하게 더 많이 증가한 것으로 나타났습니다. DAPI와 Oil Red O의 대표 이미지는 병합 및 분할 이미지와 함께 표시됩니다. 분할 이미지는 모든 핵을 녹색 오버레이로 나타내고, 오일-레드-O-염색된 지질 방울은 빨간색 오버레이를 나타냅니다.
세포당 Oil Red O 염색 면적은 지방생성 분화 가능성의 척도로 사용되었습니다. 오일 레드 O 염색 영역의 현저한 증가는 지방 생성 분화와 함께 관찰되었습니다. 초기 배양 세포는 후기 배양 세포에 비해 세포당 더 넓은 오일 레드 O 염색 영역을 보여주었습니다.
웨스턴 블롯은 분화된 초기 및 후기 계대 ASC의 FABP4 단백질 발현 수준을 분석하기 위해 수행되었습니다. 총 단백질 로딩 대조군의 비율로 나타낸 FABP4 밴드의 광학 밀도에 대한 반정량 분석은 FABP4 면역 표지가 초기 계대에서 유의하게 증가했으며, 후기 계대 분화 세포에서 더 적은 정도로 증가한 것으로 나타났습니다. 이 동영상을 시청하면 줄기세포를 지방형성 계통으로 분화하는 방법, 지방형성 유전자 특이적 마커인 지방산 결합 단백질 4를 사용하여 면역형광 염색을 수행하는 방법, 마지막으로 지방산 결합 단백질 4에 대해 면역 양성인 세포의 모든 관련 형태학적 특징을 이미지화하고 분석하는 방법을 이해할 수 있었을 것입니다.
이 비디오가 연구에 도움이 되기를 바랍니다.
개요
이 기사는 계통 특이적 마커인 지방산 결합 단백질 4를 사용하여 중간엽 세포가 성숙한 지방 세포로 분화되는 정량화를 위한 새로운 분석법을 소개합니다. 이 방법은 전통적인 기법에 비해 지방 분화 평가의 특이성을 향상시킵니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 세포 생물학
- 지방 분화
- 면역형광
배경
- 전통적인 지방 분화 평가 방법은 특이성이 부족합니다.
- 계통 특이적 마커는 보다 정확한 측정을 제공할 수 있습니다.
- 고내용 스크리닝 기술은 세포 분화의 상세한 분석을 가능하게 합니다.
- 지방 분화에 대한 이해는 다양한 생물의학 응용에 매우 중요합니다.
연구 목적
- 지방 분화를 측정하기 위한 보다 특이적인 분석법을 개발합니다.
- 계통 특이적 단백질 마커를 정량화를 위해 활용합니다.
- 약물 스크리닝에서 고처리량 응용을 가능하게 합니다.
사용된 방법
- 섬유아세포의 분리 및 확장.
- 지방 분화 배지에서 14일 동안 세포 배양.
- 지방산 결합 단백질 4에 대한 항체를 사용한 면역형광 염색.
- 영상 획득 및 분석을 위한 자동화된 고내용 스크리닝.
주요 결과
- 분화된 세포 및 형광 강도의 정량화.
- 분화 중 세포 형태의 변화 분석.
- 처리 반응에 대한 미묘한 분화 변화의 식별.
- 약물 스크리닝에 대한 고처리량 능력 입증.
결론
- 개발된 분석법은 지방 분화를 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 계통 특이적 마커의 활용은 분화 측정의 특이성을 향상시킵니다.
- 이 방법은 기초 연구 및 임상 응용에 중요한 의미를 가집니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of mesenchymal cell adipogenic differentiation using a lineage-specific marker (FABP4) addresses a critical need for predictive confidence in cell therapy and drug discovery pipelines. This high-content, gene-specific assay enables robust comparison of cell populations and manufacturing methods, supporting risk-adjusted decisions in preclinical and translational research. Its high-throughput format aligns with enterprise-scale screening and standardization requirements for cell-based product development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of adipogenic lineage commitment via gene-specific marker quantification.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing true differentiation from nonspecific lipid accumulation.
- Facilitates comparative analysis of donor variability and cell expansion protocols for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, quantitative outputs suitable for high-throughput compound screening in 96-well format.
- Improves assay reproducibility and cross-lab comparability through automated imaging and analysis.
- Enables reliable evaluation of differentiation-modulating agents in obesity and metabolic disease research.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro differentiation potential with translational biomarker (FABP4) relevant to clinical cell therapy products.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by quantifying functional cell attributes.
- Reduces biological risk by enabling batch-to-batch and donor-to-donor comparability in cell product development.
Pipeline & Workflow Integration
This FABP4-based assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies and translational cell product evaluation.
- Discovery Biology: Provides quantitative hypothesis testing for adipogenic differentiation and pathway interrogation.
- Screening: Offers assay readiness and reproducibility for scalable compound evaluation.
- Analytics: Generates multi-parametric readouts including differentiation percentage, fluorescence intensity, and morphology.
- Translational Research: Enables alignment of in vitro differentiation with clinical biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse cell sources and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell fate determination.
- Operational Value: Standardizes differentiation assessment and supports high-throughput scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by enabling robust cross-study comparisons.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cell sources and manufacturing protocols.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, high-content imaging, and quantitative image analysis.
- Needs access to automated imaging platforms and specialized analysis software.
- Demands cross-team standardization of assay setup, imaging parameters, and data interpretation.
- Adaptable to various mesenchymal cell sources and expansion methods with appropriate controls.
- Potential limitations include antibody specificity and imaging saturation, requiring careful optimization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
1:55
Inducing the differentiation of human adipose derived stromal cells
3:36
Staining for differentiation
5:53
Imaging cells using high content screening microscope
8:23
Image Analysis: Cell Scoring
9:43
Image Analysis: Transfluor
10:43
Representative results
