Name: 빠른 실버 얼룩 프로토콜 사용 간단 하 고 효율적인 탐지의 SSR 마커는 비 변성 시키기 Polyacrylamide 젤을 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 배우세요 비변성 폴리아크릴아미드 겔에서 은 염색법을 이용한 SSR 마커의 신속하고 효율적인 검출 방법입니다. 이 프로토콜은 7분 내에 완료되며 유전 다양성 분석 및 분자 육종 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 광 동 자연 과학 재단의 중국 (2015A030313500), 지방 키 국제 협동 연구 플랫폼 및 주요 과학 연구 프로젝트의 광 동 등 교육 (2015KGJHZ015), 과학에 의해 투자 되었다 고 광 동 담배 독점 관리 (201403, 201705), 과학 학부 학생 (201711078001) 국가 혁신 교육 프로젝트 (2016B020201001), 중국의 광 동의 기술 계획의 기술 계획. 상호 또는이 간행물에서 상용 제품의 언급만을 목적으로 특정 정보를 제공 하 고 미국 농 무부에 의해 승인 또는 추천을 의미 하지는 않습니다. 미국 농 무부는 평등한 기회 제공 및 고용주입니다.

1. SSR 마커의 PCR 제품의 준비
<ol><li>서식 파일 DNA를 포함 하 여 PCR 반응을 위한 모든 화학 제품 및 시 약 준비 (30 ng / µ L), 2 × PCR 마스터 믹스 (0.4 m m 각 dNTP, MgCl2, Taq DNA 중 합 효소와 염료의 0.1 U / µ L의 3 m m의 2 × PCR 버퍼를 포함 하는), 각 10 µ M 앞으로 반전 뇌관 증 류 및 저온 (dH2O). 참고: 현재 연구에 사용 된 SSR 마커 했다 PT51333 (뇌관 순서 앞으로: 5 '-GCACCTTTGGTTATCCGACA-3' 및 역방향 뇌관 순서: 5 '-TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA-3') 및 PT50903 (뇌관 순서 앞으로: 5 '-AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG-3'와 뇌관 순서를 반대로: AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3-5' ') 담배, 및 CX-43 (뇌관 순서 앞으로: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' 반전 뇌관 순서: 5'-AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3')와 CX-157 (뇌관 순서 앞으로: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' 뇌관 순서를 반대로: 5 '-GGACAGCTTCACACATTTGC-3') 꽃 배 추에 대 한.</li>
	<li>템플릿 DNA, 2 × PCR 마스터 믹스, 각 앞으로 뇌관 및 역방향 뇌관의 0.2 µ L, dH2오의 2.6 µ L의 5 µ L의 2 µ L을 추가 하 여 10 µ L PCR 믹스의 확대를 위한 준비</li>
	<li>5 분 동안 94 ° C의 초기 단계로 thermocycler의 PCR 증폭 반응 수행, 45의 38 주기 여 변성, 45 94 ° C에서 s s 뇌관 어 닐 링 55 ° C에서 확장, 72 ° C에서 1 분 및 72 °에서 10 분의 최종 확장 단계 C; 그런 다음 나중에 사용할 4 ° C에서 PCR 제품 저장.</li>
</ol>2. 준비 솔루션의 Polyacrylamide 젤 캐스팅
<ol><li>기본 트리 및 dH2O 27.5 g 붕의 54 g 용 해, 0.5 M EDTA (pH 8.0) 20 mL를 추가 하 고 솔루션 1, dH2o. 000 mL의 최종 볼륨을 조정 하 여 5 × TBE 버퍼 1 리터를 준비 참고: TBE 버퍼 저장할 수 있습니다 실 온에서 몇 달 동안.</li>
	<li>DH2O 2 L의 최종 볼륨을 5 × TBE 버퍼의 200 mL를 추가 하 여 0.5 × TBE 버퍼의 2 리터를 준비 하 고 상 온에서 저장.</li>
	<li>29 g 분자 생물학 급료 아크릴의와 분자 생물학 급 N, N 1 g을 용 해 하 여 6% 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤 솔루션 준비 '-500 mL의 최종 볼륨을 0.5 × TBE 버퍼에 methylenebisacrylamide. 커버 알루미늄 호 일 및 나중에 사용할 4 ° C에서 저장소 솔루션 병. 주의: 아크릴 강력한 neurotoxin 간주 됩니다 하 고 신중 하 게 처리 되어야 한다. 분말 및 그것을 포함 하는 처리 솔루션 무게 때 항상 장갑을 착용 하십시오.</li>
	<li>DH2O 10 mL의 최종 볼륨을 APS의 2 세대를 용 해 하 여 20% 염화 persulfate (AP) 솔루션을 준비 합니다. 그것은 몇 달 동안-20 ° C에 저장할 수 있습니다. 참고: 편의 위해 20 %APS 솔루션의 10 mL 수 1.5 mL 또는-20 ° c.에 스토리지에 대 한 원심 분리기 튜브의 2 mL aliquoted 해 동 하 고 사용 하기 전에 잘 섞어.</li>
	<li>아세트산의 0.5%를 포함 하는 95% 에탄올 0.997 mL에 bind silane의 3 µ L를 용 해 하 여 희석된 바인딩-실 란 솔루션을 준비 합니다. 그것은 4 ° C에서 주 저장할 수 있습니다. 주의: 바인딩 silane 독성, 솔루션을 취급할 때 장갑을 착용 이며 룸 통풍 유지.</li>
</ol>3입니다. Polyacrylamide 젤 전기 이동 법에 대 한 준비
<ol><li>1 세트의 유리 접시와 스페이서 수돗물, dH2오 어 완전 한 rinsing 하 여 다음 세제로 세척 접시 건조 선반에에서 그들을 설정 하 여 판 건조.</li>
	<li>그리고 5 분 동안 건조 직사각형 유리 접시의 안쪽 표면에 bind silane 솔루션의 1 mL를 분산. 참고: 경우 bind silane 솔루션은 접시의 표면에 균일 하 게 확산 되지, 젤 수 있습니다 얼룩 동안 분리할 고 결과 불만족 얼룩 효과.</li>
	<li>면봉으로 금이 낸된 유리 접시의 안쪽 표면에 격퇴 silane의 1 mL에 분산, 초과 격퇴-silane 티슈 종이로 닦아 하 고 5 분 동안 건조 한 공기. 참고: 반발 silane 균일 하 게 유리 접시의 표면 코트 하지 않습니다, 그것은 손상 될 수 젤 부분적으로 벗 겨 서.</li>
	<li>위에, 노치 플레이트 스페이서가 유리 접시를 조립 하 고 클램프 클램프 주조와 어셈블리의 양쪽.</li>
	<li>1.5 m m의 33 cm 폭 × 10 cm 높이 두께의 플레이트 세트에 대 한 비 커에 6% 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤 솔루션의 적절 한 금액 (40 mL)을 부 어, tetramethylethylenediamine (TEMED)의 20 µ L와 200 µLfresh 20% 추가 AP 부드럽게 섞는다. 참고: 젤 솔루션의 적절 한 금액 (40 mL) 스페이서 (30 cm × 8.5 c m × 0.15 cm)의 간격을 가진 2 개의 격판덮개의 내부 볼륨에서 계산 했다. 젤의 중 합에 대 한 APS와 TEMED의 금액에 대해서는 참조17에 따라 APS와 TEMED 젤 솔루션의 표준 비율. 위에서 설명한 젤 솔루션 4 ° c.에 저장 됩니다. 젤 솔루션 TEMED의 20 µ L와 AP를 사용 해야 하는 20%의 100 µ L, 실내 온도에 저장 됩니다. 부드럽게 솔루션에 공기 방울을 피하기 위해 유리 막대기로 젤 솔루션의 혼합물을 저 어.</li>
	<li>즉시 솔루션을 부 어 하 고 신중 하 게 노치 플레이트의 가장자리를 따라 조립된 유리 접시로 가기로 거의 공간을 채우는 빗을 삽입. 빗에 젤 솔루션의 작은 볼륨을 추가 합니다. 참고: 유리 접시 젤 유출 하지 않도록 수평 유지. 필요한 경우 버블 걸이로 모든 거품을 제거 합니다.</li>
	<li>실 온에서 30 분 설정 하 젤을 허용 합니다. 참고: 중 합에 대 한 시간 젤 솔루션 및 환경 온도를 변경할 수 있습니다.</li>
	<li>젤 완전히 중 합 후, 캐스팅 클램프를 제거 하 고 접시 세트 전기 탱크 단위에 위 버퍼 저수지 쪽으로 직면 하는 노치 플레이트 놓고 큰 클램프를 사용 하 여 연결 플레이트 탱크 단위로 설정.</li>
	<li>상단의 각 0.5 × TBE 버퍼와 낮은 챔버의 1 L를 붓는 다. 빗을 제거 하 고 피 펫 또는 주사기를 사용 하 여 버퍼와 모든 우물을 철저 하 게 플러시. 참고: 젤 샌드위치 접시의 바닥에 어떤 거품 없이 버퍼에 완전히 젖 었 확인 합니다.</li>
</ol>4. 실행 젤
<ol><li>각 잘 polyacrylamide 젤에 PCR 제품의 대략 1 µ L를 로드 합니다. PCR 제품의 샘플 함께 젤의 양쪽에 DNA 크기 사다리를 로드 합니다. 위 버퍼 약 실에 안전 덮개를 해결.</li>
	<li>리드 레드 레드와 블랙 하는 색 일치 하는 전원 공급 장치에 연결 합니다. 염료 ~ 70 분 동안 일반적으로 정의 된 위치에 도달할 때까지 110 V의 정 전압에서 젤을 실행 합니다. 참고: 전압 및 실행 시간 PCR 제품의 크기에 따라 조정할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 실버 감지 SSR 마커를 비 Polyacrylamide 젤에 대 한 얼룩
<ol><li>전기 이동 법, 후 위 상공에서 버퍼는 큰 비 커를 통해 밸브에 배수 하십시오. 사이드 클램프를 분리, 제거 판 기구에서 신중 하 게, 주걱으로 한쪽을 따라 금이 낸된 유리 접시를 분리 하 고 다른 유리 접시에 부착 된 젤 남아 바인딩 silane로 입힌 다는 것을 확인.</li>
	<li>DH2O 900 mL에 NaOH의 10 g을 용 해 하 여 AgNO3 dH2O. 준비 1 L 신선한 개발 솔루션의 1 리터에서 1.5 g을 용 해 하 여 신선한 임신 솔루션의 1 리터, 37% 포름알데히드의 1 mL을 추가 dH2o.를 사용 하 여 1 L의 최종 볼륨을 조정 하 고 참고: 장갑을 착용 하 고 위의 화학 물질 및 주의 솔루션을 처리 합니다. 솔루션 및 해당 솔루션 단계 어둠 속에서 유지 하는 필요는 없습니다.</li>
	<li>신중 하 게 충분 한 dH2O 전기 이동 법 버퍼 제거 다음 접시 젤 플라스틱 쟁반에 향하도록 놓고 잠수함 침 솔루션의 1 리터에 젤 젤과 유리 접시를 헹 구 십시오. 통에 트레이 넣어.</li>
	<li>트레이 부드럽게 흔들어 분 60 r/3-4 분. 참고: 젤 두께 임신 솔루션에서 실버 질산염의 농도 따라 조정할 수 있습니다 시간을 떨고.</li>
	<li>임신 솔루션에서 격판덮개를 이동 하 고 다른 쟁반에 그것을 넣어. 접시와 두 번 3-5 s에 대 한 충분 한 dH2O를 사용 하 여 젤의 표면에서 떨어져 잔여 임신 솔루션 린스.</li>
	<li>다른 트레이에 향하도록 젤 접시를 놓고, 접시 개발 솔루션의 1 리터에 잠수함 그리고 50 r/분 ~ 3 분 DNA의 모양을 조각 하는 모니터에 대 한 트레이 부드럽게 흔들어 때 DNA의 신호의 높은 비율 조각 개발을 중지 배경 잡음을 관찰 (이 단계는 3 분 소요).</li>
	<li>두 번, 접시와 충분 한 dH2O 젤을 헹 구 고 건조 한 티슈 페이퍼와 젤 접시.</li>
	<li>적절 한 스캐너를 사용 하 여 젤 스캔. 300 dpi의 해상도 DNA 파편의 명확한 시각화를 제공합니다. 또한 카메라를 사용 하는 젤에 촬영 수 있습니다.</li>
	<li>SSR 마커 밴딩 패턴 기반 이미지에 DNA 파편에 득점 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJiang%2C+GL+%22Plant+breeding+from+laboratories+to+fields%22">Plant breeding from laboratories to fields</a>. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).</li>
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<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+and+effective+silver+staining+protocol+for+detection+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments.</a> Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).</li>
<li>Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. <a target="_blank" href="https://scholars.opb.msu.edu/en/publications/a-low-cost-high-throughput-polyacrylamide-gel-electrophoresis-sys-3">A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers.</a> Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).</li>
<li>Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microsatellite+markers+in+eastern+white+pine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Characterization of microsatellite markers in eastern white pine.</a> Genome. 39, PMID: 8983182 1102-1108 (1996).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

임신 후 젤의 세척은 중요 한 단계 이다. 부족 세척 시간 및 물 볼륨 접시와 젤의 표면에 침 솔루션의 불완전 한 제거 발생 하 고 어두운 배경에서 발생할 수 있습니다. 적절 한 개발에 또 다른 핵심 단계 이다,-개발 DNA 파편의 낮은 콘트라스트 이미지와 함께 어두운 갈색 배경에서 발생할 수 있습니다. 또한, 임신 단계 DNA 파편의 착 효율을 크게 영향을 줍니다. 임신 시간 5 분 이상 확장 또는 증가 임신 솔루션에서 AgNO3 금액 개선 하지 않으면 크게 얼룩 품질, 비록 3 분 또는 AgNO3 (양을 감소 시간는 임신을 감소 < 1 g) 회색 또는 얕은 검은 DNA 파편 귀 착될 수 있다.
효율적인 DNA 검출에 대 한 신속 하 고 쉽게 작업 방법 얼룩 실버 바람직합니다. 이 연구에서 개발 된 새로운 프로토콜 방지 해결, 중지 및 몇 가지 세척 단계 다른 프로토콜6,<su...

PCR 기반 마커의 개발 식물 유전학 및 번 식1의 과학을 혁명을 했다. 간단한 순서 반복 (SSR) 마커는 가장 일반적으로 사용 되 고 가장 다재 다능 한 DNA 마커 중입니다. 그들의 게놈을 광범위 한 범위, 풍부, 게놈 특이성 및 반복성 heterozygous genotypes2의 검출에 대 한 그들의 codominant 상속 뿐만 아니라 SSR 마커의 장점 중 일부입니다. 여러 연구 결과 유전적 다양성 조사, 가계를 추적, 유전 결합 지도, 구성 및 경제적으로 중요 한 특성3,4에 대 한 유전자 지도를 SSR 마커를 사용 했습니다.
SSR 마커의 PCR 제품 agarose 또는 polyacrylamide 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 및 다음 ethidium 평범한 사람으로 얼룩 후 또는 UV 빛은 얼룩과 시각에 일반적으로 구분 됩니다. Polyacrylamide 젤에서 DNA 파편의 얼룩은 다른 착 색 방법5,6 보다 더 민감한 이며 SSR 마커7같은 DNA 파편을 검출 하기 위하여 널리 이용 되는.
많은 생물학 실험실 기술 처럼 polyacrylamide 젤의 얼룩은 꾸준히 그것의 처음 보고 되 고 19798조각 시각화 기술로 개선 했다. 기술은 처음 Bassam 외. 여 DNA 파편의 탐지에 대 한 수정 6 1991 년에 1994 년에 Sanguinetti와 동료9 을 향상. 메서드는 더는 지난 몇 년간6,7,9,10,11,12,13,14 에서 최적화 되었습니다. , 그러나 15., 프로토콜의 업데이트 된 버전의 대부분 아직도 이러한 프로토콜7의 응용 프로그램을 제한 하는 등 기술 수요 및 긴 처리 시간이 고정을 위한 장착6, 몇 가지 단점이 있다 11. DNA 조각 검출의 높은 효율성과 낮은 비용을 결합 하는 최적의 프로토콜은 생물학 연구에서 얼룩의 일상적인 응용 프로그램 긴급 하 게 필요 합니다.
또한, polyacrylamide 젤 변성 및 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤으로 분할 될 수 있다 그리고 둘 다 SSR 마커 얼룩 방법 실버를 사용 하 여 검색에 사용할 수 있습니다. 효과 해상도는 크게 차이가 없습니다, 하지만 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤 프로세스를 쉽게 하 고 적은 시간16.
이전 연구15기준 현재 연구의 목표는 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤에 SSR 마커, 쉽고 빠르고 저렴 한 비용 검색 상세에서 프로토콜을 얼룩이 지는 최적화 된 실버를 설명 하기 위해입니다.

<table><tbody><tr><td>PCR 마스터 믹스 (Green Taq Mix)</td><td>Vazyme Biotech Co. Ltd, 중국</td><td>#P131-03</td><td></td></tr><tr><td>50-2000 bp DNA Ladder</td><td>Bio-Rad, 미국</td><td>#170-8200</td><td></td></tr><tr><td>DL500 DNA 마커</td><td>Takara Bio Inc., 일본</td><td>#3590A</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sangon Biotech Shanghai, China</td><td>#77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sangon Biotech Shanghai Shanghai, China</td><td>#10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na2</td><td>Guangzhou 화학 시약 공장, 중국</td><td>#6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드</td><td>Sangon Biotech 상하이, 중국</td><td>#79-06-1</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-메틸렌-비스-아크릴아미드</td><td>Sangon Biotech 상하이, 중국</td><td>#110-26-9</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민</td><td>Sangon Biotech 상하이, 중국</td><td>#110-18-9</td><td></td></tr><tr><td>과황산 암모늄</td><td>광저우 화학 시약 공장, 중국</td><td>#7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>바인드 실란</td><td>Solarbio 베이징, 중국</td><td>#B8150</td><td></td></tr><tr><td>AgNO3</td><td>Sinopharm 화학 시약 베이징 유한 공사, 중국</td><td>#7761-88-8</td><td></td></tr><tr><td>포름 알데히드</td><td>톈진 DaMao 화학 시약 공장, 중국</td><td>#50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>광저우 화학 시약 공장, 중국</td><td>#1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>광저우 화학 시약 공장, 중국</td><td>#64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Tianjin DaMao 화학 시약 공장, 중국</td><td>#497-19-8</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>광저우 화학 시약 공장, 중국</td><td>#64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>HNO3</td><td>Guangzhou 화학 시약 공장, 중국</td><td>#7697-37-2</td><td></td></tr><tr><td>Na2S2O3.5H2O</td><td>Sinopharm 화학 시약 Beijing Co., Ltd, 중국</td><td>#10102-17-7</td><td></td></tr><tr><td>에리오크롬 블랙 T(EBT)</td><td>톈진 DaMao 화학 시약 공장, 중국</td><td>#1787-61-7</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 트레이</td><td>Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd,</td> <td>China-TS-1</td><td></td></tr> <tr><td>Shaker</td><td>Qilinbeter JiangSu,</td> <td>China-BenQ</td><td></td></tr> <tr><td>M800 스캐너</td><td>BenQ, 중국</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DYY-6C 전원 공급 장치</td><td>Beijing Liuyi Instrument Factory,</td> <td>China-High</td><td></td></tr> <tr><td>throughout vertical gel systems, JY-SCZF</td><td>베이징 Tunyi 전기 영동 Co., 주식 회사, 중국</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

빠른 실버 얼룩 프로토콜 사용 간단 하 고 효율적인 탐지의 ssr 마커는 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤을 사용 하 여

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

간단한 순서 반복 (SSR) 식물과 동물 유전자 연구 및 분자 breeding 프로그램에서 사용 하는 가장 효과적인 마커 중 하나입니다. 실버 얼룩 polyacrylamide 젤에 SSR 마커 검출에 대 한 널리 사용 되는 방법입니다. 그러나, 실버 얼룩에 대 한 전통적인 프로토콜은 기술적으로 요구 하 고 시간이 많이 걸리는. 다른 많은 생물학 실험실 처럼 기법, 프로토콜을 얼룩이 지 실버는 검출 효율 향상을 위해 꾸준히 최적화 되었습니다. 여기, 우리 보고 단순화 된 실버 얼룩 메서드를 크게 시 약 비용 감지 해상도 사진 선명도 향상 시킵니다. 새로운 메서드는 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤에 대 한 두 가지 주요 단계 (임신 및 개발) 및 3 개의 시 약 (실버 질산염, 수산화 나트륨, 그리고 포름알데히드), 그리고 처리의 불과 7 분을 필요합니다. 이전에 보고 된 프로토콜에 비해,이 새로운 방법 쉽습니다, 빨리 그리고 SSR 탐지에 대 한 더 적은 화학 시 약을 사용 하 여. 따라서,이 간단 하 고, 낮은-비용, 고 효과적인 실버 프로토콜을 얼룩이 지는 유전 매핑 및 SSR 마커 데이터의 빠른 세대 번 식 마커 기반 도움이 됩니다.

PCR amplicons 꽃 배 추와 담배에 해당 SSR 뇌관 쌍을 사용 하 여 생산 되었다. 전기 이동 법, 후 polyacrylamide 젤 SSR 마커 (그림 1)의 밴딩 패턴을 명확 하 게 감지 하는 프로토콜을 얼룩이 지는 위의 실버를 사용 하 여 얼룩이 있었다.
프로토콜을 얼룩이 지는 다른 실버의 검색 효율성 비교를 SSR 마커 담배와 꽃 배 추에서의 PCR 제품 polyacrylamide 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 분리 했다 고 5 출판은 얼룩을 사용 하 여 시각화 프로토콜9,11,12,,<...

여기, 우리는 간단 하 고 저가 실버 3 시 약 및 처리의 7 분 이며 유전자 분석에 높은-품질 SSR 데이터의 빠른 생성을 위한 적합 한 프로토콜을 얼룩이 지를 보고 합니다.

빠른 실버 얼룩 프로토콜 사용 간단 하 고 효율적인 탐지의 SSR 마커는 비 변성 시키기 Polyacrylamide 젤을 사용 하 여

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 비변성 폴리아크릴아미드 겔에서 SSR 마커를 빠르고 쉽고 저렴하게 검출할 수 있도록 최적화된 은 염색 방법을 도입하는 것입니다. SSR 마커의 신속한 유전형 분석은 유전적 다양성 분석 및 분자 육종 프로그램에서 마커 지원 선택과 같은 유전 연구 및 응용 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 SSR 마커 검출을 위한 다른 프로토콜보다 수행하기 쉽고, 시간이 덜 걸리며, 화학 시약을 더 적게 사용한다는 것입니다.이 방법은 기존 프로토콜에서 발견되는 고정, 중지 및 여러 세척 단계를 방지합니다. 그리고 함침과 발달의 두 가지 주요 단계 만 필요합니다. SSR 밴딩 패턴을 명확하게 감지하기 위해 배경 잡음이 없는 이 프로토콜을 사용하여 선명한 이미지를 생성할 수 있습니다.이 기술을 사용하여 하루에 약 800개의 DNA 샘플을 스크리닝할 수 있으며 담배 및 배추 연구에 성공적으로 사용되었습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 PCR 제품 및 젤 용액을 준비한 후 수돗물에 세제를 사용하여 유리판과 스페이서 한 세트를 세척한 다음 증류수로 완전히 헹굽니다. 접시를 접시 건조대에 넣어 자연 건조하십시오.바인드 실란 용액 1ml를 직사각형 유리판의 내부 표면에 분산시키고 5분 동안 건조시킵니다. 그런 다음 면봉으로 홈이 있는 유리판의 내부 표면에 Repel-silane 1ml를 펴고 티슈 페이퍼를 사용하여 여분의 용액을 닦아내고 플레이트를 5분 동안 자연 건조시킵니다. 노치가 있는 플레이트가 위에 오도록 스페이서로 유리판을 조립합니다.그리고 주조 클램프를 사용하여 어셈블리의 양쪽을 클램핑합니다. 다음으로, 플레이트 세트의 비이커에 6%의 비변성 폴리아크릴아미드 겔 용액을 적당량 붓습니다. TEMED 20마이크로리터와 신선한 20%APS 200마이크로리터를 넣고 부드럽게 섞습니다.노치가 있는 판의 가장자리를 따라 조립된 유리판에 용액을 즉시 조심스럽게 붓고 공간을 거의 맨 위까지 채웁니다. 그리고 빗을 삽입합니다. 그런 다음 빗 위에 소량의 젤 용액을 넣고 젤을 실온에서 30분 동안 굳힙니다.겔이 완전히 중합되면 주조 클램프를 제거하고 노치가 있는 플레이트가 상부 버퍼 저장소를 향하도록 하여 전기영동 탱크 장치에 설정된 플레이트를 배치합니다. 큰 cl 사용amps 플레이트 세트를 탱크 장치에 부착합니다. 1리터의 0.5 X TBE 완충액을 상부 챔버와 하부 챔버 각각에 붓습니다.그런 다음 빗을 제거하고 완충액으로 채워진 피펫이나 주사기를 사용하여 모든 웰을 완전히 세척합니다. 폴리아크릴아미드 겔을 실행하려면 각 웰에 약 1마이크로리터의 PCR 산물을 로드합니다. 또한 양쪽 끝에 DNA 사다리를 로드합니다.그런 다음 안전 덮개를 상부 버퍼 챔버에 고정합니다. 리드를 전원 공급 장치에 연결하고 빨간색에서 빨간색으로, 검은색에서 검은색으로 구분된 색상을 일치시킵니다. 염료가 정의된 위치에 도달할 때까지 110볼트의 일정한 전압에서 젤을 실행합니다.일반적으로 약 70분 동안입니다. 전기영동 후 밸브를 열고 상부 챔버의 버퍼를 큰 비커로 배출합니다. 측면 cl을 분리하십시오.amps 및 장치에서 플레이트를 제거합니다.그런 다음 주걱을 사용하여 한쪽을 따라 노치가 있는 유리판을 조심스럽게 분리하고 젤이 바인드 실란으로 코팅된 다른 유리판에 부착된 상태로 남아 있는지 확인합니다. 다음으로, 증류수 1리터에 질산은 1.5g을 용해시켜 1리터의 신선한 함침 용액을 준비합니다. 그런 다음 10g의 수산화나트륨을 900ml의 증류수에 용해시켜 1리터의 새로운 개발 용액을 준비합니다.37% 포름알데히드 1ml를 넣고 증류수를 사용하여 최종 부피 1리터로 조정합니다. 충분한 증류수로 젤과 유리판을 조심스럽게 헹구어 전기영동 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 젤이 위를 향하도록 플레이트를 플라스틱 트레이에 놓고 젤을 1리터의 함침 용액에 담그십시오.60RPM의 셰이커에서 트레이를 3-4분 동안 부드럽게 흔듭니다. 함침 용액의 플레이트를 다른 트레이로 옮깁니다. 그런 다음 충분한 증류수를 사용하여 플레이트와 젤 표면의 잔류 함침 용액을 각각 3-5초 동안 두 번 헹굽니다.함침 후 젤 세척 단계는 매우 중요합니다. 불충분 한 세척으로 인해 함침 용액이 불완전하게 제거됩니다. 그리고 어두운 배경이 됩니다.젤이 위를 향하도록 다른 트레이에 놓습니다. 플레이트를 1리터의 현상 용액에 담근 다음 트레이를 50RPM으로 약 3분 동안 부드럽게 흔듭니다. DNA 단편의 모양을 모니터링하고 배경 잡음에 대한 DNA 단편 신호의 가장 높은 비율이 관찰되면 발달을 중단합니다.적절한 현상 시간은 또 다른 중요한 단계입니다. 과잉 발달은 DNA 단편의 낮은 대비가 있는 이미지와 함께 짙은 갈색 배경을 초래할 수 있습니다. 플레이트와 젤을 충분한 증류수로 두 번 헹구고 티슈 페이퍼를 사용하여 젤 플레이트를 건조시킵니다.그런 다음 스캐너와 적절한 소프트웨어를 사용하여 300DPI로 겔을 스캔하고 밝기와 대비를 조정하여 DNA 밴드를 명확하게 시각화합니다. 마지막으로, 이미지의 DNA 단편 크기를 기반으로 SSR 마커의 밴딩 패턴에 점수를 매깁니다. 여기에 제시된 PCR 앰플리콘은 꽃이 피는 배추와 담배에서 해당 SSR 프라이머 쌍을 사용하여 생산되었습니다.전기영동 후, 폴리아크릴아미드 겔은 이 비디오에서 시연된 은 염색 프로토콜을 사용하여 염색되었습니다. SSR 마커의 밴딩 패턴을 명확하게 감지했습니다. 다양한 은 염색 프로토콜의 검출 효율을 비교하기 위해 PAGE를 사용하여 SSR 마커의 PCR 산물을 분리하고 5개의 발표된 은 염색 프로토콜과 이 비디오에서 시연된 6번째 방법을 사용하여 시각화했습니다.여기에서 시연된 프로토콜은 DNA 단편의 배경 잡음이 가장 낮고 대비가 가장 높아 가장 높은 화질 선명도를 생성했습니다. 테스트된 6가지 프로토콜 중 여기에서 입증된 방법은 시간이 가장 적게 걸리고 화학 시약 및 공정 단계가 가장 적습니다. 마지막으로, 이 그림은 비변성 폴리아크릴아미드 겔의 50 - 2000 bp DNA 마커를 1열의 밴드당 10 나노그램에서 11열의 DNA 밴드당 9.8 피코그램으로 연속 희석하여 측정한 프로토콜의 민감도를 보여줍니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 7분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 함침 및 개발 용액의 교차 오염을 방지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 연구자들이 SSR 마커를 신속하게 유전형화할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 은 염색을 사용하여 비변성 폴리아크릴아미드 겔에서 SSR 마커를 간단하고 효율적으로 검출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 화학 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑과 같은 예방 조치를 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

전기 방법으로 분리에 따라, 젤의 단백질은 몇 얼룩 방법에 의해 감지하실 수 있습니다. 쿠매시 블루, 실버 스테 이닝, SYPRO 오렌지, SYPRO 루비와 단백질 얼룩이 비디오 시연하고 있습니다.

젤의 단백질 염색법

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형광 DNAzymes을 사용하여 박테리아의 탐지

이 비디오에서는 형광 프로브를 사용하여 총 단백질을 시각화하기 위한 폴리아크릴아미드 겔의 은 염색 방법을 보여줍니다.

형광 은 염색: 폴리아크릴아미드 겔에서 총 단백질을 시각화하는 기술

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은 염색 황화 글리코사미노글리칸의 염색: 폴리아크릴아미드 겔에서 황화 글리코사미노글리칸의 시각화를 위한 염색 방법

이 비디오는 단백질에 대한 변성 폴리아크릴아미드 기반 분리 기술을 보여줍니다. 이 기술은 분자량에 따라 단백질을 예비 식별하는 데 도움이 됩니다.

단백질 분석을 위한 Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel 전기영동: 분자량에 따라 단백질을 분리하고 시각화하는 기술

우리는 여기서 중요한 생물학적 문제를 해결하기 위해 사례 연구와 같은 적외선 형광 염료 표지 DNA 프로브와 함께 정제 된 SOX-2 단백질을 사용하여 형광 전기 영동 이동성 이동 분석 (fEMSA)의 최적화 된 프로토콜을 설명합니다.

적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

Macroinvertebrates의 가장 일반적인 직감 콘텐츠 분석은 시각. 먹이 생물의 형태학 상 다양성에 대 한 강렬한 지식을 요구, 그들은 부드러운 바디 먹이 놓치지 고, 때문에 먹이의 강한 분쇄, amphipods를 포함 한 어떤 유기 체에 대 한 거의 불가능 하다. 우리는 macroinvertebrate에 대 한 자세한, 소설 유전 접근 먹이 amphipods의 식단에 식별을 제공 합니다.

Macroinvertebrates 사용 하 여 그룹별 수생 rDNA 뇌관의 유전 직감 콘텐츠 분석을 위한 실험실 프로토콜

이 방법을 사용 하면 선택적 얼룩이 지 고 젤에서 DNA의 정량화 SYBR 녹색에서 젤을 몸을 담글 하 여 난 / 니트로 블루 Tetrazolium 솔루션 및 다음 햇빛 또는 파란색 광원을 노출. 이 보이는 침전 생성 하 고 필드 사용에 대 한 이상적 거의 장비가 필요 합니다.

DNA 방법 Formazan 강 수 푸른 빛의 노출에 의해 유도에 따라 얼룩

여기, 우리는 새로운 형광 얼룩 polyacrylamide 젤에서 총 단백질 검출에 대 한 기술 개요는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 활용 Ag+를 감지 하는 실버 이온 전용 형광 턴 온 프로브-단백질 복합물, 전통적인 발은 얼룩의 특정 한계를 제거 하 고.

Polyacrylamide 젤에 단백질의 형광은 얼룩

이 보고서는 생물학적 샘플에서 황지방 글리코아미노글리칸(GAGs)을 분리하고 정화하는 기술과 크기를 대략적으로 분류하기 위한 폴리아크릴아미드 젤 전기포아제 접근법을 설명합니다. GAGs는 조직 구조에 기여하고 단백질과의 정전기 상호 작용을 통해 신호 공정에 영향을 미칩니다. GAG 폴리머 길이는 코그네이트 리간드에 대한 결합 친화성에 기여합니다.

폴리아크릴아미드 젤 전기포및 은 염색에 의한 글리코아미노글리칸 검출

배우세요 비변성 폴리아크릴아미드 겔에서 은 염색법을 이용한 SSR 마커의 신속하고 효율적인 검출 방법입니다. 이 프로토콜은 7분 내에 완료되며 유전 다양성 분석 및 분자 육종 연구에 활용됩니다.

빠른 실버 얼룩 프로토콜 사용 간단 하 고 효율적인 탐지의 SSR 마커는 비 변성 시키기 Polyacrylamide 젤을 사용 하 여

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