빠른 실버 얼룩 프로토콜 사용 간단 하 고 효율적인 탐지의 SSR 마커는 비 변성 시키기 Polyacrylamide 젤을 사용 하 여

이 프로토콜의 전반적인 목표는 비변성 폴리아크릴아미드 겔에서 SSR 마커를 빠르고 쉽고 저렴하게 검출할 수 있도록 최적화된 은 염색 방법을 도입하는 것입니다. SSR 마커의 신속한 유전형 분석은 유전적 다양성 분석 및 분자 육종 프로그램에서 마커 지원 선택과 같은 유전 연구 및 응용 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 SSR 마커 검출을 위한 다른 프로토콜보다 수행하기 쉽고, 시간이 덜 걸리며, 화학 시약을 더 적게 사용한다는 것입니다.

이 방법은 기존 프로토콜에서 발견되는 고정, 중지 및 여러 세척 단계를 방지합니다. 그리고 함침과 발달의 두 가지 주요 단계 만 필요합니다. SSR 밴딩 패턴을 명확하게 감지하기 위해 배경 잡음이 없는 이 프로토콜을 사용하여 선명한 이미지를 생성할 수 있습니다.

이 기술을 사용하여 하루에 약 800개의 DNA 샘플을 스크리닝할 수 있으며 담배 및 배추 연구에 성공적으로 사용되었습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 PCR 제품 및 젤 용액을 준비한 후 수돗물에 세제를 사용하여 유리판과 스페이서 한 세트를 세척한 다음 증류수로 완전히 헹굽니다. 접시를 접시 건조대에 넣어 자연 건조하십시오.

바인드 실란 용액 1ml를 직사각형 유리판의 내부 표면에 분산시키고 5분 동안 건조시킵니다. 그런 다음 면봉으로 홈이 있는 유리판의 내부 표면에 Repel-silane 1ml를 펴고 티슈 페이퍼를 사용하여 여분의 용액을 닦아내고 플레이트를 5분 동안 자연 건조시킵니다. 노치가 있는 플레이트가 위에 오도록 스페이서로 유리판을 조립합니다.

그리고 주조 클램프를 사용하여 어셈블리의 양쪽을 클램핑합니다. 다음으로, 플레이트 세트의 비이커에 6%의 비변성 폴리아크릴아미드 겔 용액을 적당량 붓습니다. TEMED 20마이크로리터와 신선한 20%APS 200마이크로리터를 넣고 부드럽게 섞습니다.

노치가 있는 판의 가장자리를 따라 조립된 유리판에 용액을 즉시 조심스럽게 붓고 공간을 거의 맨 위까지 채웁니다. 그리고 빗을 삽입합니다. 그런 다음 빗 위에 소량의 젤 용액을 넣고 젤을 실온에서 30분 동안 굳힙니다.

겔이 완전히 중합되면 주조 클램프를 제거하고 노치가 있는 플레이트가 상부 버퍼 저장소를 향하도록 하여 전기영동 탱크 장치에 설정된 플레이트를 배치합니다. 큰 cl 사용amps 플레이트 세트를 탱크 장치에 부착합니다. 1리터의 0.5 X TBE 완충액을 상부 챔버와 하부 챔버 각

그런 다음 빗을 제거하고 완충액으로 채워진 피펫이나 주사기를 사용하여 모든 웰을 완전히 세척합니다. 폴리아크릴아미드 겔을 실행하려면 각 웰에 약 1마이크로리터의 PCR 산물을 로드합니다. 또한 양쪽 끝에 DNA 사다리를 로드합니다.

그런 다음 안전 덮개를 상부 버퍼 챔버에 고정합니다. 리드를 전원 공급 장치에 연결하고 빨간색에서 빨간색으로, 검은색에서 검은색으로 구분된 색상을 일치시킵니다. 염료가 정의된 위치에 도달할 때까지 110볼트의 일정한 전압에서 젤을 실행합니다.

일반적으로 약 70분 동안입니다. 전기영동 후 밸브를 열고 상부 챔버의 버퍼를 큰 비커로 배출합니다. 측면 cl을 분리하십시오.amps 및 장치에서 플레이트를 제거합니다.

그런 다음 주걱을 사용하여 한쪽을 따라 노치가 있는 유리판을 조심스럽게 분리하고 젤이 바인드 실란으로 코팅된 다른 유리판에 부착된 상태로 남아 있는지 확인합니다. 다음으로, 증류수 1리터에 질산은 1.5g을 용해시켜 1리터의 신선한 함침 용액을 준비합니다. 그런 다음 10g의 수산화나트륨을 900ml의 증류수에 용해시켜 1리터의 새로운 개발 용액을 준비합니다.

37% 포름알데히드 1ml를 넣고 증류수를 사용하여 최종 부피 1리터로 조정합니다. 충분한 증류수로 젤과 유리판을 조심스럽게 헹구어 전기영동 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 젤이 위를 향하도록 플레이트를 플라스틱 트레이에 놓고 젤을 1리터의 함침 용액에 담그십시오.

60RPM의 셰이커에서 트레이를 3-4분 동안 부드럽게 흔듭니다. 함침 용액의 플레이트를 다른 트레이로 옮깁니다. 그런 다음 충분한 증류수를 사용하여 플레이트와 젤 표면의 잔류 함침 용액을 각각 3-5초 동안 두 번 헹굽니다.

함침 후 젤 세척 단계는 매우 중요합니다. 불충분 한 세척으로 인해 함침 용액이 불완전하게 제거됩니다. 그리고 어두운 배경이 됩니다.

젤이 위를 향하도록 다른 트레이에 놓습니다. 플레이트를 1리터의 현상 용액에 담근 다음 트레이를 50RPM으로 약 3분 동안 부드럽게 흔듭니다. DNA 단편의 모양을 모니터링하고 배경 잡음에 대한 DNA 단편 신호의 가장 높은 비율이 관찰되면 발달을 중단합니다.

적절한 현상 시간은 또 다른 중요한 단계입니다. 과잉 발달은 DNA 단편의 낮은 대비가 있는 이미지와 함께 짙은 갈색 배경을 초래할 수 있습니다. 플레이트와 젤을 충분한 증류수로 두 번 헹구고 티슈 페이퍼를 사용하여 젤 플레이트를 건조시킵니다.

그런 다음 스캐너와 적절한 소프트웨어를 사용하여 300DPI로 겔을 스캔하고 밝기와 대비를 조정하여 DNA 밴드를 명확하게 시각화합니다. 마지막으로, 이미지의 DNA 단편 크기를 기반으로 SSR 마커의 밴딩 패턴에 점수를 매깁니다. 여기에 제시된 PCR 앰플리콘은 꽃이 피는 배추와 담배에서 해당 SSR 프라이머 쌍을 사용하여 생산되었습니다.

전기영동 후, 폴리아크릴아미드 겔은 이 비디오에서 시연된 은 염색 프로토콜을 사용하여 염색되었습니다. SSR 마커의 밴딩 패턴을 명확하게 감지했습니다. 다양한 은 염색 프로토콜의 검출 효율을 비교하기 위해 PAGE를 사용하여 SSR 마커의 PCR 산물을 분리하고 5개의 발표된 은 염색 프로토콜과 이 비디오에서 시연된 6번째 방법을 사용하여 시각화했습니다.

여기에서 시연된 프로토콜은 DNA 단편의 배경 잡음이 가장 낮고 대비가 가장 높아 가장 높은 화질 선명도를 생성했습니다. 테스트된 6가지 프로토콜 중 여기에서 입증된 방법은 시간이 가장 적게 걸리고 화학 시약 및 공정 단계가 가장 적습니다. 마지막으로, 이 그림은 비변성 폴리아크릴아미드 겔의 50 - 2000 bp DNA 마커를 1열의 밴드당 10 나노그램에서 11열의 DNA 밴드당 9.8 피코그램으로 연속 희석하여 측정한 프로토콜의 민감도를 보여줍니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 7분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 함침 및 개발 용액의 교차 오염을 방지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 연구자들이 SSR 마커를 신속하게 유전형화할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 은 염색을 사용하여 비변성 폴리아크릴아미드 겔에서 SSR 마커를 간단하고 효율적으로 검출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 화학 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑과 같은 예방 조치를 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.