Immunocytochemistry 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 의해 경작된 한 세포에 단백질 표정 수준 결정

이 절차의 전반적인 목표는 트롬보플라스틴-혈장 세포 블록 포매 조직 덩어리의 면역세포화학적 및 조직학적 분석을 통해 관심 있는 증식 마커의 발현을 분석하는 것입니다. 이 방법은 조직에 의한 세포 차단의 임상 병리학에 대한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 파라핀 포매 세포 블록의 면역세포화학 분석을 위한 이 대체 방법의 주요 장점은 절차의 기술적 단순성입니다.

HeLa 세포 배양 접시 100mm가 포화 수준에 도달하면 상등액을 FBS가 없는 10mL의 HeLa 세포 배양 배지로 교체하고 접시를 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 48시간 후, PBS 2밀리리터로 세포를 세척한 다음 0.25% EDTA와 트립신 2밀리리터에서 섭씨 37도에서 2-3분 동안 배양하고 5% 이산화탄소를 배양합니다. 세포가 분리되면 5ml의 완전한 배지로 반응을 중지하고 세포 용액을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

원심분리를 통해 세포를 모은 후 세척당 2ml의 차가운 PBS로 2회 세척합니다. 두 번째 세척 후 상등액을 1ml의 95% 에탄올로 교체하고 볼텍싱으로 펠릿을 혼합합니다. 그런 다음 고정된 세포를 얼음 위에 놓습니다.

파라핀 세포 블록을 준비하기 위해 건강한 기증자의 혈액에서 EDTA 혈장을 채취한 후 샘플을 원심분리하고 200-400마이크로리터의 상농 혈장 부분 표본을 개별 마이크로분리 튜브로 옮깁니다. 다음으로 약 200마이크로리터의 혈장, 약 200마이크로리터의 트롬보플라스틴, 약 200마이크로리터의 025몰 염화칼슘을 고정된 HeLa 세포에 추가합니다. 혼합물이 실온에서 10분 동안 세포 응고를 형성하도록 한 다음 1ml의 PBS로 혈전을 두 번 세척하여 두 번째 세척 후 포르말린에 적신 여과지의 개별 조각에 혈전을 완전히 제거합니다.

혈전을 여과지로 감싸고 핀 세트를 사용하여 포르말린에 적신 다른 4 장의 종이 중앙에 있는 개별 조직 카세트에 천을 놓습니다. 그런 다음 조직 카세트를 50ml의 완충 포르말린이 들어 있는 유리병에 넣고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 포르말린을 고정합니다. 다음날 아침, 카세트를 조직 처리기에 넣어 밤새 수분을 제거하고 세포를 조절합니다.

처리 절차가 끝나기 최소 1시간 전에 가열된 임베딩 스테이션을 켜서 파라핀을 녹입니다. 포매 스테이션과 응고가 준비되면 금속 주형에 용융된 파라핀이 있는지 확인하고 형성된 세포 응고를 파라핀으로 옮깁니다. 뚜껑이 없는 새 조직 카세트를 금속 주형에 넣고 더 많은 용융 파라핀으로 카세트를 덮습니다.

파라핀을 냉각판에서 30-60초 동안 굳히십시오. 그런 다음 금속 주형에서 조직 카세트를 분리합니다. 면역세포화학 분석을 위한 절편을 준비하려면 하나의 파라핀 세포 블록에서 세포 응고를 찾고 마이크로톰을 사용하여 블록을 3-4마이크로미터 두께의 조각으로 자릅니다.

파라핀 절편을 식염수로 코팅된 유리 슬라이드에 놓고 슬라이드를 섭씨 37도의 오븐에 30분 동안 넣습니다. 섹션이 슬라이드에 부착되면 4분 동안 15ml의 자일렌으로 슬라이드를 파라핀화한 다음 순차적인 2분 하강 에탄올 배양으로 섹션을 탈수합니다. 80% 에탄올 배양 후 흐르는 물에 절편을 10분 동안 헹구고 40ml의 트리스-EDTA 회수 버퍼가 들어 있는 병에 슬라이드를 30분 동안 끓입니다.

배양이 끝나면 항원 회수 슬라이드를 흐르는 물에 씻은 다음 섭씨 4도에서 95% 에탄올로 10분 동안 배양합니다. 공기 건조 후 소수성 펜을 사용하여 각 슬라이드의 세포 염색 영역을 둘러쌉니다. TBS-T에서 슬라이드를 세척한 후 과산화수소 블록에서 실온에서 15분 동안 배양하여 잔류 과산화효소 활성을 제거합니다.

TBS-T에서 2분씩 슬라이드를 세 번 세척한 다음 관심 있는 면역세포화학 염색 키트의 1차 항체 혼합물 100마이크로리터로 섹션을 1시간 동안 세척한 다음 2분 동안 TBS-T를 5회 세척합니다. 마지막 세척 후, 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 키트의 1차 항체 강화제의 슬라이드를 배양합니다. 배양이 끝나면 TBS-T로 섹션을 4회 세척하고 실온에서 30분 배양을 위해 마지막 세척 후 양고추냉이 과산화효소로 표시된 약 200마이크로리터의 2차 항체를 추가합니다.

강화된 부분을 새 TBS-T로 5회 세척한 다음 섹션당 100마이크로리터의 디아미노벤지딘 용액을 3분 동안 추가합니다. TBS-T에서 슬라이드를 두 번 세척하고 1분 동안 100마이크로리터의 헤마톡실린 용액으로 섹션에 라벨을 붙입니다. 그런 다음 TBS-T에서 슬라이드를 한 번 더 세척하고 슬라이드를 95% 에탄올에서 2분 동안 배양한 다음 신선한 95% 에탄올에 한 번 담그고 100% 에탄올에 두 번 담그십시오.

유리병에 40ml의 자일렌이 함유된 에탄올 탈수 부분을 5분 동안 배양하고 슬라이드를 자연 건조시킵니다. 그런 다음 각 슬라이드에 커버 슬립을 장착하고 광학 현미경으로 샘플을 관찰합니다. 방금 시연된 바와 같이 파라핀 포매 조직의 헤마톡실린 및 에오신 염색은 대부분 촉각 핵과 세포질에서 밝혀지며, 이는 이 방법에 의한 세포 샘플의 우수한 형태학적 보존을 시사합니다.

그러나 제대로 준비되지 않은 세포 블록은 샘플이 적절하게 염색되더라도 형태가 불량하고 불규칙한 표지를 나타냅니다. 세포골격 관련 단백질 2는 일반적으로 응축된 염색질, 유사분열 방추체 및 세포질 내에서 관찰됩니다. 응축된 염색질에서 두 가지 염색된 세포골격 관련 단백질이 있는 세포만이 유사분열 세포인 반면, 혈청이 결핍된 HeLa 세포 배양 집단 내에서 세포골격 관련 단백질 두 개의 양성 세포는 거의 발견되지 않습니다.

대부분의 고도의 유사분열 HeLa 세포는 Ki-67 양성이며 세포핵에서 Ki-67 염색이 관찰됩니다. 혈청이 결핍된 HeLa 세포의 약 절반만이 이 증식 마커를 발현합니다. 이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행하면 6시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 좋은 응고를 만들기 위해 세포를 적절한 밀도로 희석하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 고정 세포의 유세포 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 동기화 중 세포 주기 단계에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 배양된 세포의 형태학적 정보를 보존하면서 세포주에서 발현 프로파일링을 탐구하기 위해 간 병리학 분야의 미래를 위한 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 면역세포화학을 수행하는 방법과 배양된 세포에서 혈장 트롬보플라스틴 블록을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 자일렌과 같은 위험한 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑과 실험복을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.