Streptomyces 발달 돌연변이의 영상 및 현미경 평가

다음 기술의 전반적인 목표는 대학 교육 실험실 및 고등학교 교실 환경에서 스트렙토마이세스 및 기타 관련 종을 연구할 수 있도록 초보 연구자를 교육하는 것입니다. 표현형 관찰은 스트렙토마이세스 연구 분야에 진입하는 많은 연구자들에게 중요합니다. 이 비디오는 박테리아 증식, 보관, 육안 및 현미경 검사 방법을 설명합니다.

여기에 설명된 phenotpying 방법은 Streptomyces coelicolor를 모델로 사용합니다. 그러나이 방법은 밀접하게 관련된 방선균뿐만 아니라 큰 속의 모든 구성원에 적용 할 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 고등학교 교실 또는 학부 교육 실험실의 초보 연구원과 숙련된 실험실 직원이 액세스할 수 있도록 설계되었다는 것입니다.

이 비디오를 시청하고 함께 제공되는 프로토콜을 읽은 후, 새로운 연구자들은 스트렙토마이세스 균주를 조작하고, 적절하게 저장하고, 시각적 특성화 실험을 시작할 수 있을 것입니다. 절차를 시연하는 사람은 Otterbein University의 제 연구실의 학부생인 Garret Kandell과 Sean Kirk입니다. 먼저 Saunders 2012에서 시연된 사분면 줄무늬 방법과 같은 표준 방법을 사용하여 스트렙토마이세스 균주를 MS 한천 플레이트에 줄무늬를 만들고 단일 콜로니로 배양합니다.

4일에서 6일마다 한 마리의 군체를 골라 새 접시에 다시 굽습니다. 군체가 나이가 들면서 무작위 돌연변이가 발생하기 쉽습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 돌연변이 유발을 수행한 후, 야생형 부모 균주와 비교하여 각 돌연변이에 대한 집락 형태를 기록해 두십시오.

새로운 스트렙토마이세스 종을 특성화할 때, 새로운 분리물을 기본 모양, 군체 표면, 불투명도, 고도 및 색소에 주목하는 잘 연구된 종의 분리물과 비교하십시오. MS 한천 플레이트에 라벨을 붙이고 야생형과 돌연변이 균주를 쐐기 패턴으로 줄무늬를 만듭니다. 교차 오염을 방지하기 위해 어떤 변형도 다른 변형에 닿지 않도록 주의하십시오.

균주가 접시에 줄무늬가 있는 날짜와 시간을 기록하십시오. 그런 다음 섭씨 30도에서 플레이트를 배양합니다. 스트렙토마이세스 검체를 오염으로부터 항상 보호하는 것이 매우 중요하다는 것을 기억하십시오.

모든 단계에 대해 최상의 멸균 기술을 사용하여 가능한 한 최소한의 시간 동안 플레이트와 튜브를 개봉하십시오. 자란 페트리 접시를 색종이나 흰 종이에 올려 놓고 배경을 균질화합니다. 종이에 균주 이름, 날짜, 배양 온도 및 첫 번째 플레이트 줄무늬 이후의 시간을 기록하십시오.

혼란을 최소화하기 위해 종이 배경에 스트레인 정보가 쓰여진 플레이트의 디지털 사진을 찍습니다. 핀셋을 70% 에탄올로 세척한 다음 분젠 버너 화염에 통과시켜 에탄올을 증발시켜 멸균합니다. 커버슬립을 70% 에탄올로 세척한 다음 멸균 페트리 접시에서 건조시켜 살균합니다.

다음으로, 박테리아 성장의 커버슬립 리프트를 준비하려면 멸균 핀셋을 사용하여 멸균 커버슬립을 집어 들고 박테리아 성장이 밀집된 MS 한천 플레이트에 커버슬립을 놓습니다. 핀셋을 사용하여 커버슬립 뒷면을 부드럽게 눌러 박테리아 포자와 공중 균사체가 충분히 전달되도록 합니다. 플레이트에서 커버슬립을 집어 들고 세포 재료가 50%글리세롤이 15마이크로리터 방울이 들어 있는 현미경 슬라이드 표면을 향하도록 45도 각도로 놓습니다.

커버슬립이 글리세롤에 떨어지도록 하면 기포가 줄어듭니다. 다양한 시간 간격으로 위상차 현미경 검사를 수행하려면 준비된 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 커버슬립 중앙에 침지 오일 한 방울을 떨어뜨립니다. 100x 위상 대물렌즈를 제자리에서 회전하고 콘덴서 터렛을 적절한 매칭 위상 설정으로 설정합니다.

대물 렌즈가 오일에 닿으면 미세 조정 손잡이만 사용하여 이미지의 초점을 맞춥니다. 돌연변이 균주와 야생형 간에 눈에 띄고 일관된 차이를 식별하기 위해 여러 시야를 조사합니다. 포자를 형성하는 능력, 포자 크기 및 모양, 포자의 전체 수와 같은.

멸균 핀셋을 사용하여 박테리아 성장이 분명한 곳과 같이 MS 한천 플레이트에서 커버슬립 리프트를 준비하고 핀셋으로 커버슬립 뒷면을 부드럽게 만져 박테리아 포자와 공중 필라멘트가 충분히 전달되도록 합니다. 플레이트에서 커버슬립을 집어 카드 스톡에 올려 놓아 셀 재질이 있는 면이 위를 향하도록 하여 커버슬립을 쉽게 조작할 수 있도록 합니다. 얼음처럼 차가운 메탄올을 사용하여 커버슬립을 범람시키고 5분 동안 그대로 두십시오.

PBS를 사용하여 용액을 부드럽게 분배하고 제거하여 커버슬립을 두 번 세척합니다. 밀리리터당 10마이크로그램 프로피듐 요오드화물 용액 15마이크로리터 또는 밀리리터당 10마이크로그램의 WGA-FITC 용액을 슬라이드에 추가합니다. 형광 얼룩 한 방울 위에 커버슬립을 뒤집어 놓습니다.

어둡거나 어두운 방에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 형광 염색 및 염색 샘플의 재고는 빛으로부터 보호되어야 합니다. 연구자들은 샘플을 준비하는 동안 저조도 조건을 사용하고 준비가 완료되면 샘플을 담을 수 있는 어두운 상자를 사용하는 것이 좋습니다.

프로피듐 요오드화물 및 FITC에 대한 epifluorescence excitation cubes가 장착된 위상차 또는 DIC 현미경을 사용하여 100x 대물 렌즈 아래에서 슬라이드를 관찰합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 이미지를 분석합니다. 여기에 표시된 것은 transposon mutagenesis로 인한 Streptomyces 돌연변이의 예입니다.

더 밝은 색의 공중 균사체는 포자 형성의 결함으로 인한 회색 색소의 수치가 낮다는 것을 나타낼 수 있습니다. 또는 흐릿한 모양이 없다는 것은 공중 균사체 형성의 블록을 나타냅니다. 위상차 현미경으로 볼 수 있듯이 야생형 S.coelicolor 군체는 일반적으로 약 2일 동안 성장할 때까지 공중 균사체를 생성합니다.

그리고 3 일 동안 자라는 포자의 긴 사슬. 백색 돌연변이는 포자 형성이 지연되거나, 생산되는 포자의 풍부함이 감소하거나, 모양 및/또는 크기 결함이 있는 포자를 생성하거나, 단순히 성숙한 회색 포자 색소의 낮은 수준을 생성할 수 있습니다. PI 염색과 함께 DIC 및 형광 현미경을 사용하여 여기에서 볼 수 있듯이, 야생형 샘플의 포자 사슬에 대한 규칙적인 간격의 염색은 염색체 분리 결함을 나타내는 두 개의 transposon 삽입 돌연변이에 대한 간헐적 염색 패턴과 비교됩니다.

WGA-FITC를 사용하여 세포벽을 염색하면 야생형 균주 S.venezuelae가 포자 사슬 사이에 부드러운 공중 필라멘트로 존재합니다. 그리고 포자 형성 중에 일반적으로 볼 수 있는 분열 격막의 측면과 같은 배열을 나타냅니다. 사상체 유기체로 작업하는 것은 잘 알려진 막대 모양의 박테리아와 함께 작업하는 것과는 매우 다릅니다.

여기에 있는 비디오 프로토콜은 스트렙토마이세스 연구 분야에 진입하는 새로운 연구자들에게 중요한 자원이 될 것입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 스트렙토마이세스 종 및 기타 관련 박테리아에 대한 연구를 시작하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이러한 초기 실험에 이어 연구실에서 다양한 기술을 사용하여 스트렙토마이세스 균주에 대해 자세히 알아볼 수 있습니다.

예를 들어, 고급 기술 중 일부는 단백질 태깅 또는 Real Time PCR 및 RNA 염기서열분석과 같은 유전자 발현 분석일 수 있습니다. 초기 표현형 분석 실험은 새로운 균주를 식별 및 특성화하고 특정 유전자의 일반적인 역할을 식별하는 데 사용됩니다. 이러한 방법은 이미 대학 교육 실험실에서 다양한 스트렙토마이세스 균주를 식별하고 특성화하는 데 사용되었습니다.