Name: Germinosomes과 새 균의 subtilis 포자에 내부 막의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 배우세요 초해상도 구조 조명 현미경을 활용한 Bacillus subtilis 포자의 germinosome 및 내막 영역 시각화 방법을. 이 기술은 포자 생물학 연구에서 단백질 국소화를 정밀하게 분석할 수 있게 합니다.

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저자는 SIM 이미징 동안 그의 도움에 대 한 크리스 쳔 Zeelenberg 감사합니다. JW 박사 화목을 위한 중국 장학금 위원회를 인정 하 고 아이 린 Stellingwerf 이미징의 기본 단계 그녀의 도움에 대 한 감사 합니다.

1. B. subtillis 포자 형성 (타이밍: 현미경 관찰 하기 전에 7 일)
<ol><li>
주 1
	<ol>
<li>Luria Bertani 국물 (파운드) 한 천 격판덮개 (1 %tryptone, 0.5% 효 모 추출 물, 1 %NaCl, 1 %agar)13 에 세균성 문화를 행진 하 고 단일 식민지를 37 ° C에서 밤새 품 어. B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry 고양이, 게르트 gfp 칸) 긴장을 사용 하 여 그 부모 배경 스트레인 B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) 앞에서 설명한7. 참고: ΔcotEΔgerE 배경으로 포자를 사용 하 여 최소화 포자 외 투 레이어7의 autofluorescence germinosome 시각화에 필수적 이다.</li>
		<li>모든 미디어, 튜브, pipets 및 다른 문화 자료 적절 한 방법으로 사용할 수를 소독.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
주 2
	<ol>
<li>이른 아침에에서 단일 식민지 파운드 매체의 5 mL에 접종 하 고 OD600 0.3-0.4 (약 7 h)를 도달할 때까지 200 rpm/min와 37 ° C에서 스크류 캡 튜브에 지속적인 동요에서 문화를 품 어.</li>
		<li>MOPS 매체 (pH 7.5)의 500 mL를 만들기 포함 3 nM (NH4)6개월7O24·4H2O, 0.4 μ M H3보3, 30 nM CoCl2·6H2O, 10 nM CuSO4·5H2O, 10 nM ZnSO4·7H2O, 1.32 m K m2HPO4, 0.4 m m MgCl2·6H2O, 0.276 m K m2이렇게4, 0.01 m m FeSO4·7H2O, O20.14 m m CaCl2·2H 80 m m MOPS 변경, 4 m m Tricine, 0.1 m m MnCl2·2H2O 10 m m D-포도 당-토스, 그리고 10 mM NH4Cl</li>
		<li>스크류 캡 튜브 10-1-5 mL에 파운드 문화의 10-7 직렬 희석에에서 MOPS 매체를 준비 하 고 하룻밤 200 rpm/min와 37 ° C에서 연속 교 아래 문화를 품 어 참고: 여기 준비 직렬 희석 다음 날 아침에 일찍 지 수 단계에 희석을 목표로 합니다. 이 단계와 다음 단계는 MOPS 버퍼링 된 성장 매체에 맞게 셀 수 있도록 필요.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3 일
	<ol>
<li>0.3-0.4의 OD600 와 MOPS 희석 중 하나를 선택 합니다. 미리 데워 진 (37 ° c) MOPS 매체의 20 mL 원뿔 250 mL 플라스 크에 문화의 0.2 mL를 접종 하 고 OD600 0.3-0.4 (~ 7 h)를 도달할 때까지 지속적인 동요에서 품 어.</li>
		<li>1% (v/v) 사전 문화 단계의 1.3.1 MOPS 기반으로 포자 형성 매체 (250 mL)을 inoculate 하 고 지속적인 동요에서 원뿔 리터 플라스 크에서 37 ° C에서 3 일 동안 품 어. FM4-64 PS4150 포자의 얼룩, 2 µ g/mL FM4-64 프로브 ( 재료의 표참조) 포자 형성 매체 1 또는 2 h 피크의 식물 성장 (일반적으로 약 2) OD600 값에 도달 하면 추가 허용 하는 문화 이후 빛5에서 그것을 보호 하는 동안 sporulate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
제 7 일: 포자의 수확
	<ol>
<li>100 배 확대에 단계 대조 현미경 검사 법을 사용 하 여 구별 단계 어두운 세포에서 단계 밝은 포자와 포자 가능성이 비 성숙 하 포자 형성 수확량 (포자 vs 식물 세포)를 결정 합니다. 90% 단계 밝은 포자 수확량으로 예상 된다.</li>
		<li>둥근 바닥 원심 분리기 튜브에 4 ° C에서 15 분 동안에 4,270 x g 에서 포자 작은 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 ( 재료의 표참조)에 2-3 회 살 균 매우 순수한 타입 1 광된 물 40 mL와 포자 펠 릿을 세척. 스핀-다운 4,270 x g 15 분 (4 ° C)에서 각 세척에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
제 7 일: 포자 정화
	<ol>
<li>정화 포자: 포자 펠 릿 20% 비 밀도 그라데이션 매체의 750 µ L에서 일시 중지 ( 재료의 표참조) 소독된 microcentrifuge 튜브에 50% 비 밀도 그라데이션 매체의 800 µ L에 로드. 60 분 21500 x g에서 원심 분리기. 얻은 펠 릿 무료 포자를 포함 합니다. 20% 비 밀도 그라데이션 매체의 200 µ L에서 포자 펠 릿을 일시 중단 하 고 50% 비 밀도 그라데이션 매체는 microcentrifuge와 21500 x g에서 15 분 동안 원심 분리기의 1 mL에 로드 합니다.</li>
		<li>세척 최종 포자 준비 및 저장: 순화 된 휴면 포자 얻은 펠 릿에 포함 되어 있습니다. 워시 2-3 회 살 균 매우 순수한 타입 1의 1.5 mL와 포자 펠 릿 물 ( 재료의 표참조) 및 스핀-다운 사이 9560 x g 4 ° c.에 15 분에서 마지막으로, 대략 30의 최종 세600 살 균 매우 순수한 타입 1 물에 펠 릿을 일시 중단 합니다. 포자의 aliquots 8 주14-80 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. decoating
<ol><li>PS4150 포자를 치료와 0.1 m M NaCl/0.1 M NaOH/1% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) / 1 h. 70 ° C에서 0.1 M dithiothreitol (DTT) 세척 소독된 매우 순수한 타입 1 물15,16와 10 번 포자. 이렇게 함으로써, 어떤 FM4-64 프로브 포자의 외부 막에 흡착 하 고 외부 레이어를 제거 됩니다.</li>
</ol>3. Coverslip 및 슬라이드 준비11 (타이밍: 관찰 하기 전에 1 시간)
<ol><li>정리 전 높은 정밀도 coverslips ( 재료의 표참조) 부드럽게 흔들어 물 욕조에 30 분 동안 1 M HCl와. 매우 순수한 타입 1 물에 두 번 coverslips를 세척 하 고 100% (vol/vol) EtOH에에서 저장. 그들은 건조 하 고 사용 하기 전에 그들의 선명도 확인 하자. 70%의 유리 슬라이드를 미리 청소 EtOH. 그들은 건조 하 고 사용 하기 전에 그들의 선명도 확인 하자.</li>
</ol>4. 샘플링 형광 스피어 또는 포자 진 프레임에서 슬라이드10 (15 분 타이밍)
<ol><li>미리 두 70 %EtOH 청소 따뜻한 고 말린된 유리 슬라이드 ( 재료의 표참조) 70 ° C가 열 블록에 몇 초 동안, 한 유리 슬라이드 위에 70 ° C에서 개최 하는 멸 균된 2 %agarose 65 μ 드롭 공기와 agarose b 확산 위에 다른 유리 슬라이드를 배치 etween 슬라이드. Agarose 패치는 약 5 분에 건조 됩니다.</li>
	<li>유리 슬라이드 중 하나를 제거한 후 agarose 패치를 1 x 1 cm 섹션에 잘라, 형광 스피어 (~ 108/mL의 포자), 샘플의 0.4 μ를 추가 하 고 패치에 coverslip 배치 하 여 높은 정밀도 coverslip에 패치를 전송 및 떨어져 슬라이딩.</li>
	<li>에 coverslip 현미경 검사 법에 사용 하기 위해 슬라이드를 따라서 완료 프레임의 모든 모서리를 닫는 배치는 말린된 슬라이드에 유전자 프레임 (1.5 x 1.6 cm2, 65 µ L)를 수정 합니다.</li>
</ol>5. 영상11,17(타이밍: 1 시간)
<ol><li>빨간색의 혼합 뿐만 아니라 포자의 전송 및 형광 이미지를 캡처하고 구조화 조명 현미경에 카복실산 수정 형광 스피어 노란색-녹색 석유 객관적인 (x 100 장착 ( 자료의 표참조) 수 가늠 구멍 = 1.49), CCD 카메라 및 이미지 분석 소프트웨어 ( 재료의 표참조). 주변광의 방해 없이 실 온에서 모든 이미지를 생성 합니다. 항상 객관적이 고 슬라이드 이미징 하기 전에 75% 에탄올 x 100를 청소 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>100 nm (직경) 형광 스피어에 집중 하 고 대칭 psf 이미지의 최소화 얻을 때까지 100 x 목표의 수정 반지를 조정 하 여 점 퍼짐 기능 (psf)를 최적화. Psf는 임펄스 응답 또는 포인트 소스 또는 지점 개체에 대 한 이미징 시스템의 응답.</li>
	<li>약 10 라운드 형광 스피어와 보기의 필드를 선택 합니다. 격자를 적용 초점 모두 561에 대 한 조정 및 이미지 분석 소프트웨어에 대 한 가이드로 488 nm 여기 웨이브 길이.</li>
	<li>전송 빛 포자를 집중 하 고 각 이미지에 대 한 200 ms 노출으로 16 × 평균 모드에서 전송 빛 이미지를 캡처.</li>
	<li>14-비트, 그리고 175에서 EM 이득에서 조명 모드 "3D-SIM", 판독 모드 전자 멀티 (EM) 이득 10 MHz에 카메라 설정 포자의 3D 시뮬레이션 원시 형광 이미지를 캡처하십시오. 20% 레이저 전력, 561 nm 레이저 빛 PS4150 포자에서 FM4-64 프로브와 400 ms의 조명 시간을 자극 합니다.</li>
	<li>GerKB-mCherry 자극 및 KGB80에 게르트 GFP 포자와, 각각, 561 nm 레이저 광 레이저 30% 전력 1 s, 및 488 nm 레이저 빛 60 %3 미 Z 스택 설정은 위에서 바닥 모드, 0.2 µ m / 단계, 7 단계 및 germinosome에 대 한 20 단계에 대 한 레이저 출력 및 임 분석, 각각. 참고: 이러한 레이저 매개 변수는 약 4000의 히스토그램 윈도우의 최대 밝기 값을 보장 하기 위해 적용 되었다.</li>
</ol>6. 3D SIM FM4-64 PS4150 포자 스테인드의 Raw 이미지 재구성
<ol><li>FM4-64 스테인드 PS4150 포자 원시 데이터에 대 한 N-SIM 슬라이스 재구성을 수행 합니다. N-SIM 슬라이스 개조 창을 열려면 N SIM 패드 탭 시트에 재구성 조각 Param 단추 클릭 합니다.</li>
	<li>N-SIM 슬라이스 개조 창에서 재건 매개 변수를 설정 합니다. 완벽 한 복원된 이미지를 얻으려면 N SIM 지침의 제안에 따라 하 고 조명 변조 대비 (IMC) 설정 자동, 높은 N-SIM 슬라이스 재건 창에서 적절 한 컨트롤에 클릭 해상도 잡음 억제 (HRNS) 1.00을 시작 지점으로 0.05에 초점 흐림 억제 (OFBS)에서 .</li>
	<li>재구성 슬라이스 단추 이미지를 재구성 하 N SIM 슬라이스 개조 창에서 클릭 합니다. 고속 푸리에 변환 (FFT) 이미지 재건12후 표시 재건 점수에 의해 재구성 된 이미지의 품질을 평가 합니다.</li>
	<li>0.10에서 HRNS 조정 5.00 및 OFBS 0.01에서 0.50 최고의 매개 변수 설정을 얻을 수 있습니다 때까지 N-SIM 슬라이스 개조 창에서 해당 컨트롤을 클릭 하 여.</li>
	<li>변경 된 매개 변수를 적용 하려면 N SIM 슬라이스 Reconstuction 창에서 적용 단추를 클릭 합니다. 창을 닫으려면 닫기 단추를 클릭 합니다.</li>
	<li>FM4-64 PS4150 포자 raw 이미지를 활성 및 N-SIM 패드 탭 시트에 슬라이스 재구성 단추 클릭 스테인드 조각 개조를 실행을 확인 합니다. 복원된 이미지를 저장 합니다.</li>
</ol>7. 이미지 분석
<ol><li>
KGB80 germinosome의 의사 Widefield 이미지 변환
	<ol>
<li>ImageJ 플러그인 의사-Widefield12 SIMcheck 유틸리티 원시 데이터 시 왼쪽된 클릭으로 활성화 하 여 의사-Widefield 이미지에 3D SIM KGB80의 원시 이미지를 변환 합니다. 의사-Widefield 원시 SIM 데이터에서 이미지를 평균 하 고 비교를 위해, 기존의 widefield 조명12에 해당 이미지를 조립. ImageJ 자체에 대 한 https://imagej.net/Welcome를 참조 하십시오. 형광 의사 Widefield 이미지에 나중에 germinosome 분석에 대 한 각 거꾸로 전송 이미지에 25 포자를 임의로 선택 합니다.</li>
		<li>두 개의 슬라이드에서 14 시야에 총 약 350 (이 예에서 346) KGB80 포자에서 선택 합니다. 선택한 KGB80 포자에 게르트 GFP와 GerKB mCherry 형광 foci 숫자는 두 연구원에 의해 독립적으로 세어 져야 한다. 연구원은 포자에 별도 형광 germinosome foci의 존재의 의심에 때마다 3D SIM raw 이미지를 다시 참조할 수 있습니다.</li>
		<li>각 게르트 GFP와 GerKB mCherry 초점의 최대 농도 각 KGB80 포자의 3D 이미지 ImageJ의 통합된 강도 평가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
의사-Widefield KGB80 germinosome의 이미지 분석
	<ol>
<li>KGB80 포자의 통합된 신호 강도로 7 스택 의미 통합된 강도 값을 사용 합니다. 동일한 설정을 사용 하 여 배경 스트레인 PS4150 이미징 하 여 배경 농도 결정 합니다. 대해 형광 명소 개별 KGB80 포자에 germinosome foci로 그들은 배경에서 명확 하 게 구별 합니다.</li>
		<li>적용 소프트웨어 근원 9.0 중요성 결정에 대 한 단방향 ANOVA 테스트. P 값을 고려 하면 < 0.05 통계적으로 중요 한. Spearman의 순위 상관 계수18 를 사용 하 여 식도 GFP와 GerKB mCherry foci 번호의 상관 관계와 통합 된 신호 강도의 측정 평가.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+of+spores+of+Bacillus+species%3A+what+we+know+and+do+not+know%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언.

제시 하는 프로토콜 FM4-64 스테인드 B. subtilis 포자 포자 형성, 슬라이드 준비와 이미징 프로세스의 분석을 위한 표준 3D-SIM 절차를 포함 합니다. 또한, 프로토콜 설명 수정된 SIMcheck (ImageJ)-3D 이미징 B. subtilis 포자 germinosomes 형광 기자 표시의 SIM 현미경 검사 법에 대 한 프로세스를 지원. 후자의 절차를 사용 하 여 향상 된 콘트라스트와 함께 희미 한이 구조를 관찰할 수 있었습니다. 두 가지 이미징 절차, 커플링 하 여 발 아 과정의 기계 론 적인 이해에 대 한 우리의 기초 향상 같은 SIM 현미경 같은 포자에서 개별 하위 구조를 시각화 가능 하다. 절차 ~ 100의 측면 해상도에서 작동 하는 유의 nm와 ~ 200-250의 축 해상도 nm. 이것은 그리피스7에서 사용 하는 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 넓은 필드 현미경 접근 보다 낫다입니다. 시간이 해결 발 아의 시작 시 germino...

Bacillales 및 Clostridiales의 포자 metabolically 휴면 하 고 가혹한 오염 정권에 매우 저항력이 있지만 그들은 발 아 하지 않는 인간1해로운 효과 일으킬 수 없습니다. 새 균의 subtilis (B. subtilis) 포자의 영양소 germinant 트리거 발 아, 개시 이벤트는 germinant 수용 체 (GRs) 포자의 내부 막 (IM)에 위치한 germinant 바인딩입니다. 그 후,는 GRs transduce 메신저에 있는 또한 SpoVA 채널 단백질에 신호. 이 포자 코어 피리 딘-2, 6-dicarboxylic 산 (dipicolinic 산; 교류의 결과 DPA; 포자 코어 건조 중량의 20% 함유) SpoVA 채널을 통해 물에 대 한. 그 후, DPA 릴리스 트리거 피 peptidoglycan 가수분해의 활성화 고 추가 물 통풍 관2,,34. 이러한 이벤트 코트 레이어, 그것의 연속적인 파열, 파생물의 발병에 기계적 스트레스를 리드 하 고, 마지막으로, 식물 성장. 그러나, 발 아 과정의 정확한 분자 세부 정보는 여전히 멀리에서 해결 되었습니다.
포자 발 아에 대 한 주요 질문 임 발 아 단백질 IM SpoVA 채널 단백질 주변의 지질 생물 속성을 염려 한다. 이 크게 움직이지 IM 지질 bilayer 일부는 포자 코어 또는 식물 세포 세포질5,6에 그들의 활동을 발휘 하는 독성 화학 방부 제, 포함 하는 많은 작은 분자에 대 한 주요 침투성 방 벽 이다. 메신저5모바일 지질의 중요 한 일부분 이지만 메신저 지질 bilayer 젤 상태에서 가능성이 높습니다. 포자의 메신저는 또한 중요 한 확장5에 대 한 잠재력이 있다. 따라서, 메신저의 표면적 증가 하면 추가 막 합성 없이 발 아 시이 막의 특성 낮은 침투성 및 지질 부동5,6의 손실에 의해 동반입니다.
B. subtilis 포자의 작은 크기와 발 아 단백질의 상대적으로 낮은 풍부한 도전을 제기 발 아 단백질의 활성화 및 포자에 IM 지질 조직 분자 세부 연구를 위한 매력적인 주제는, 에 현미경 분석입니다. 그리피스 그 외 여러분 epifluorescence 현미경 증거 돋보이는, B. subtilis 포자에 비 계 단백질 식도 3 GR 소 단위 (A, B 및 C) 게 라, B 및 K GRs 구성 제안 형광 기자 발 아 단백질, 융합을 사용 하 여 클러스터7에서. 그들은 발 아 단백질의이 클러스터에 대 한 'germinosome' 라는 용어를 만들어낸 고 ~ 300 nm 큰 메신저 단백질 foci8구조 설명. 포자 발 아의 시작, 시와 형광 패턴, 분산 foci 궁극적으로 변화에 더 큰 형광 germinosome > 포자에이 패턴을 표시 하는 포자 인구의 75% L valine81 h에 대 한 출 아 했다. Note 사용 위에서 언급 한 종이 이미지 사진의 연속 형광, 통계 전원 낮은 형광 신호 이미징 동안 관찰의 장애물을 극복 하기를 수십에서 평균. 세균성 포자에 이러한 구조의이 시각화 했다 이란 기술적으로 가능한 클래식 미세한 도구와 단일 포자에서 foci의 금액의 두 평가의 가장자리에도 그들의 더 상세한 subcellular 지 방화 했다 이 방법으로 가능 합니다.
여기, 우리 상세한 시각화를 구조화 조명 현미경 (SIM)의 사용 및 B. subtilis, 뿐만 아니라 그들의 IM 지질 도메인9의 포자에서 germinosome(s)의 정량화를 보여 줍니다. 프로토콜은 또한 ImageJ10,,1112뿐만 아니라 포자 형성, 슬라이드 준비와 SIMcheck (v1.0, imageJ 플러그인) 이미지 분석에 대 한 지침을 포함합니다.

<table><tbody><tr><td>공기 건조 유리 슬라이드</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td>630-2870</td><td></td></tr><tr><td>APO TIRF N20R8 100&times; 오일 목표 (NA=1.49)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B. subtilis PS4150 (PS832 &Delta; gerE::spc, &델타; cotE::tet)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>삼각 플라스크 1 L</td><td>시그마-알드리치</td><td>Z567868</td><td></td></tr><tr><td>삼각 플라스크 250 mL</td><td>시그마-알드리치</td><td>Z723088</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres 카르복실레이트 변형 마이크로스피어</td><td>Invitrogen, 0.1 &mu; m</td><td>F8803</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F34653</td><td></td></tr><tr><td>Histodenz 비이온 밀도 구배 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXON3 DU-897 X-6515 CCD 카메라</td><td>Andor 기술</td><td></td><td>https://imagej.net/Welcome</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>마이크로검출기 튜브 1.5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3451PK</td><td></td></tr><tr><td>현미경 이미징 소프트웨어</td><td>Nikon, Japan</td><td>NIS-Element AR 4.51.01</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ 초순수 탈광수</td><td>Millipore</td><td>Milli-Q IQ 7003</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 나사 캡 병 180 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75003800</td><td></td></tr><tr><td>Precision Coverslips</td><td>Paul Marienfeld</td><td>117650</td><td></td></tr><tr><td>원형 바닥 튜브 15 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Nunc TM</td></tr><tr><td>스크류 캡 튜브 50 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Nunc TM</td></tr></tbody></table>

germinosomes과 새 균의 subtilis 포자에 내부 막의 시각화

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

포자의 작은 크기와 발 아 단백질의 상대적으로 낮은 풍부한 epifluorescence 현미경 검사 법을 사용 하 여 그들의 미세한 분석에 어려움이 발생할. 슈퍼 해상도 3 차원 구조화 조명 현미경 (3D-SIM)이이 장애물을 극복 하 고 새 균의 subtilis (B. subtilis) 포자의 발 아 과정의 분자 세부 정보를 공개 하는 유망한 도구입니다. 여기, 우리는 수정 된 SIMcheck (ImageJ)를 사용 하 여 설명-보조 3D 이미징 프로세스 및 형광 기자 단백질 B. subtilis 포자 germinosomes, 발 아 단백질의 클러스터의 시뮬레이션입니다. 우리는 또한 FM4-64 B. subtilis 포자 막의 얼룩에 대 한 (표준) 3D 시뮬레이션 이미징 절차를 제시. 이 절차를 사용 하 여 우리는 germinosome 지역화에 대 한 탁월한 해상도 얻을 하 고 표시 > B. subtilis KGB80 정의 된 최소 MOPS 매체에 포자 형성 후 얻은 휴면 포자의 80%는 하나 또는 두 개의 식도 GFP와 GerKB-mCherry 포커스입니다. 밝은 foci에서 관찰된 FM4-64 스테인드 포자 3D 시뮬레이션 이미지 내부 막 지질 도메인 가능성이 다른 유동성의 존재를 제안 했다. 공동 지역화를 평가 하 고 따라서 내부 포자 막에서 균 발 아 단백질의 조직에 대 한 최적의 개요를 얻을을 더블 라벨 막 염료와 germinosome 프로시저 기자 단백질을 사용 하는 연구는 더 가능.

현재 프로토콜 세균성 포자에 대 한 SIM 현미경 이미징 절차를 제공합니다. 포자 형성 및 슬라이드 준비 절차 이미징 하기 전에 그림 1 에 표시 된 대로 실행 되었다. 이미징 및 분석 절차 적용 후, 모두 (발 아 단백질을 분류 하는 형광 단백질)을 흐리게 하 고 밝은 (닥터지 프로브 IM 스테인드) 포자 샘플 다음 텍스트와 같이.
B. subtilis 포자에 germinosomes의 지역화
위 식도 역류와 GerKB는 보고 포자, 당 3500 ~와 ~ 700 분자 각각 풍부한 포자 형성 중간19에 포자에서 추출의...

'Germinosomes' 새 균의 subtilis 포자의 내부 막에서에 germinant 수용 체 단백질 클러스터. 우리는 슈퍼 해상도 현미경 및 형광 기자 단백질 germinosomes 시각화를 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 또한 우선적으로 막 염료 FM4-64와 스테인드 포자 내부 막 도메인을 식별 합니다.

Germinosomes과 새 균의 subtilis 포자에 내부 막의 시각화

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

초분해능 구조화 조명 현미경 검사법인 3D-SIM은 포자 막에서 발아 수용체 클러스터의 형광 기자 단백질을 시각화하는 혁신적인 기술입니다. 이러한 절차를 사용하여 발거국화 및 포자 내부 막 지질 도메인의 타의 추종을 불허하는 해상도를 달성할 수 있습니다. 이 기술은 박사 과정 학생 후안 웬과 과학 학생 레이몬드 파스만의 우리의 실험실에 의해 입증될 것입니다.시술을 시작하기 전에, 부드럽게 흔들리는 수조에서 30 분 동안 1 개의 어금니 염산으로 고정밀 커버립을 청소하고 초순수 타입 1 물에 2 5 분 세척합니다. 두 번째 세척 후 커버립을 100% 에탄올에 약 3분간 놓고 커버립을 건조시키고 선명도를 확인합니다. 그런 다음, 깨끗한 유리 현미경은 슬라이드가 건조하고 선명도를 확인하기 전에 1 분 동안 70 %의 에탄올로 슬라이드.형광 마이크로스피어 및 포자 이미징의 경우, 70도 섭씨 가열 블록에 처음 두 개의 슬라이드를 한 후 몇 초 동안 미리 따뜻하게 두 개의 슬라이드를 한 후 70도 섭씨, 65 마이크로리터 액적인 멸균 2%의 아가게로 슬라이드 중 하나에 연결됩니다. 슬라이드 사이에 아가로즈를 퍼뜨리기 위해 다른 슬라이드를 위에 놓습니다. 5분 후 슬라이드 중 하나를 제거하고 말린 아가로즈를 1-1센티미터 섹션으로 자른다.멸균의 0.4 마이크로리터에 8번째 형광 마이크로스피어 또는 포자를 1회 10번 추가하고, 아가로즈에 초순수 타입 1물을 넣고, 커버슬립을 사용하여 패치에 고정밀 커버슬립을 배치하여 슬라이드의 패치를 커버슬립 표면으로 밀어넣습니다. 그런 다음 65 마이크로리터, 1.5-1.6센티미터 유전자 프레임을 말린 슬라이드에 고정하고 커버슬립을 프레임에 배치하여 프레임의 모서리를 모두 닫습니다. 시료의 이미징을 위해 슬라이드를 100X 오일 목표를 갖춘 구조화 된 조명 현미경에 배치하고 100 나노 미터 형광 현미경에 집중하십시오.이미지의 흐림을 최소화하기 위해 대칭 점 확산 함수가 얻어질 때까지 100x 목표에서 보정 링을 조정하고 약 10개의 둥근 형광 마이크로스피어를 사용하여 시야를 선택합니다. 지정된 여기 파장에 대한 격자 초점 조정을 적용, 이 경우, 561 및 488 나노미터, 전송 광과 포자에 초점을 맞추기 전에 이미지 분석 소프트웨어에 대한 가이드로. 각 이미지에 대해 20밀리초 노출되는 16x 평균 모드에서 전송 광 이미지를 캡처합니다.이어서, 3D-SIM 조명 모드로 포자의 3D 구조화 조명 현미경 원시 형광 영상을 캡처한다. 슬라이스 재구성의 경우 구조화된 조명 패드 탭 시트의 Param을 클릭하여 N-SIM 슬라이스 재구성 창을 엽니다. 제안된 지침을 따르고 적절한 컨트롤을 클릭하여 조명 변조 대비를 자동으로 설정하고 고해상도 노이즈 억제를 시작점으로 0.05로 초점 흐림 억제합니다.그런 다음 슬라이스 재구성을 클릭하여 이미지를 재구성하고 재구성 후 표시되는 빠른 Fourier 변환 이미지와 재구성 점수로 재구성된 이미지의 품질을 평가합니다. 고해상도 노이즈를 0.1에서 5로 조정하고 초점 블러 억제를 0.01에서 0.5로 조정하여 최상의 매개 변수 설정을 얻을 때까지 조정합니다. 그런 다음 적용을 클릭하여 변경 사항을 적용합니다.창을 닫기 위해 가까이 를 클릭합니다. FM4-64 스테인드 PS4150 포자 원시 이미지를 엽니다. 그런 다음 슬라이스 재구성을 클릭하여 슬라이스 재구성을 실행하고 재구성된 이미지를 저장합니다.KGB80 geminosome의 3D-SIM 원시 이미지를 의사 와이드 필드 이미지로 변환하려면 ImageJ SIMcheck 플러그인을 왼쪽 클릭하고 원시 데이터 SI 및 의사 와이드 필드를 선택합니다. 약 350개의 포자가 선택될 때까지 형광 의사 와이드필드 이미지에서 나중에 발아성 분석을 위해 각 반전 전송 이미지에서 약 25개의 포자를 임의로 선택한다. 그런 다음 ImageJ를 사용하여 각 포자 그룹과 각 3D 포자 이미지의 통합 강도에 의해 표현된 각 형광 신호에 대한 최대 강도를 평가합니다.KGB80 germinosome의 의사 와이드필드 이미지를 분석하려면 7개의 스택의 평균 통합 강도 값을 KGB80 포자의 통합 신호 강도로 사용합니다. 그런 다음 동일한 설정을 사용하여 PS4150 배경 변형을 이미징하여 배경 강도를 결정하고, 개별 KGB80 포자의 형광 반점을 배경과 명확하게 구별할 수 있을 때 발거성 포시로 간주합니다. 본 대표적인 실험에서, GerD-GFP 형광 포자의 2개의 포시가 컴포지티브 Z3 스택에서 관찰된 3개의 총 GerD-GFP 포시와 다른 스택에 나타났다.여기서, 포자에서 하나의 GerD-GFP 초점만을 가진 포자관찰되었다. 총, 포자의 약 40 ~50%는 각각 두 개 또는 하나의 GerD-GFP와 GerKB-mCherry 클러스터를 가지고 있었다. GerD-GFP 스캐폴드 단백질의 통합 강도는 다른 인구마다 달랐지만 GerKB-mCherry의 통합 강도는 다른 인구에서 거의 동일했습니다.포자가 여러 포시를 가졌을 때, GerD-GFP및 GerKB-mCherry 포시의 최대 형광 강도는 감소하는 경향이 있었고, 발거성 포시로 간주되는 모든 밝은 반점의 최대 형광은 PS4150 의 최대 자동 형광보다 높았다. 특히, 발거성 포시와 유사한 밝은 FM4-64 반점은 그대로 코팅된 PS4150 포자 모두에 나타나며, 이러한 밝은 FM4-64 반점은 내부 막에 있는 발거성 단백질의 클러스터링에 관여할 수 있음을 시사한다. 아가로즈에 포자를 추가하고 프레임에 아가로즈를 배치하려면 이러한 미니 재료에 대한 연속적이고 신중한 유체 움직임이 필요합니다.KGB80 의 3D-SIM 원시 이미지를 의사 와이드 필드 이미지로 변환하고 해석은 포자 생물학에 대한 전문가의 지식이 필요합니다. 우리의 구조화 된 조명 현미경 검사는 다른 박테리아 또는 다른 밴드 재료에서 낮은 풍부한 단백질 또는 희미한 형광 기자의 이미징에 적용 될 수있다. germinosome의 조직은 지금 바실러스 발아 단백질 및 특정 막 도메인의 공동 현지화를 평가하기 위하여 이중 라벨링 절차를 사용하여 공부될 수 있습니다.

visualization-germinosomes-inner-membrane-bacillus-subtilis

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 프로토콜은 자동 형광 시간 경과 현미경을 사용하여 시간에 다른 박테리아의 단일 세포의 행동을 모니터하기위한 단계별 절차를 제공합니다. 또한, 우리는 어떻게 현미경 이미지를 분석하는 지침을 제공합니다.

라이브 셀 이미징 바실러스 subtilis과 연쇄상 구균 pneumoniae 자동 시간 저속 현미경을 사용하여

출처: Figueroa, DM, et al. 항균 펩타이드 국소화를 특성화하기 위한 박테리아 스페로플라스트 및 프로토플라스트의 생산 및 시각화. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 그람 양성 박테리아 Bacillus megaterium에서 원형질체를 생성하는 단계별 절차를 보여줍니다.

그람 양성 박테리아 Bacillus megaterium에서 원형질체 생성

출처: Wen, J., Pasman, et. al., Bacillus subtilis 포자의 제르미노솜 및 내막 시각화. J. Vis. Exp. (2019년)이 비디오는 박테리아 포자 내에서 발아 단백질의 조직을 밝히는 3차원 형광 이미지를 획득하기 위해 구조화된 조명 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다.

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이 프로토콜 추적에 의해 모니터링 활력 매개 변수 및 저압 플라즈마 처리 후 새 균의 subtilis 포자를 되살리는에서 DNA 복구 프로세스의 관련성을 평가 하는 데 필요한 중요 한 연속 단계를 보여 줍니다. 형광 표시 DNA 복구 시간 해결 confocal 현미경 검사 법 및 전자 현미경 검사를 통해 단백질.

해로운 효과의 낮은 압력 플라즈마 살 균 새 균의 subtilis 포자를 사용 하 여 라이브 셀 현미경의 생존에 조사

우리는 예를 들어 새 균의 subtilis 를 사용 하 여 개별 세균성 세포 계보의 미세 분석 하는 방법을 제시. 메서드를 긴밀 하 게 제어 하 고 균일 한 성장 조건 셀 세대의 수백의 관찰 함으로써 미생물학에 전통적인 분석 방법의 단점을 극복 했다.

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세균성 세포의 화상 진찰은 큰 거대 분자 기계의 기능을 지시하는 정적 및 동적 프로세스를 정의에 초점을 맞춘 신흥 시스템 생물학 접근입니다. 여기서, 정량적 라이브 세포 영상 및 극저온 단층 촬영의 통합은 레지오넬라 뉴모필라 형 IV 분비 시스템 아키텍처 및 기능을 연구하는 데 사용된다.

레지오넬라 폐렴 구균 도트/Icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 라이브 세포 이미징 및 극저온 단층 촬영 적용

microsporidian 기생충 Nematocida parisii에 의한 Caenorhabditis elegans의 감염은 웜이 동일한 병원균에 매우 저항력이있는 자손을 생산할 수있게합니다. 이것은 유전 된 면역의 예이며, 잘 이해되지 않는 후성 유전 적 현상입니다. 본 프로토콜은 유전적으로 견인성 웜 모델에서 유전된 면역의 연구를 기술한다.

Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection에서 유전 된 면역 연구

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Bacillus subtilis 포자 계수 및 유세포 분석의 표지 분석 개선

그대로 고립 Langendorff에 transmembrane 잠재력 (VM)과 일시적인 세포 내 칼슘 (CAT)의 광학 매핑하는 동안이 종이 자세히 해부 절차를, 수단 설치, 그리고 실험 조건 마우스 마음을 perfused.

마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

배우세요 초해상도 구조 조명 현미경을 활용한 Bacillus subtilis 포자의 germinosome 및 내막 영역 시각화 방법을. 이 기술은 포자 생물학 연구에서 단백질 국소화를 정밀하게 분석할 수 있게 합니다.

Germinosomes과 새 균의 subtilis 포자에 내부 막의 시각화

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