RNA 방해의 실용적인 사용: Liposome 캐리어 바퀴벌레에 대 한 이중 가닥 RNA의 구두 납품

이 프로토콜의 전반적인 목표는 리포좀 운반체에 캡슐화된 이중 가닥 RNA의 경구 섭취를 통해 RNA 간섭을 사용하여 바퀴벌레의 장에서 유전자 발현을 고갈시키는 것입니다. 이 방법은 새로운 해충 방제 방법 개발의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다., 예를 들어 열린 들판에서 필수 유전자를 쓰러뜨리면 해충을 죽일 수 있습니까? 이 기술의 주요 장점은 리포솜이 유전자 특이적 이중 가닥 RNA를 보호하여 표적 세포로의 전달을 보장한다는 것입니다.

절차를 시연하는 사람은 박사후 연구원인 Jia-Hsin Huang과 제 연구실의 기술자인 Yun Liu입니다. 먼저 바퀴벌레가 3분 동안 움직이지 않을 때까지 얼음 위에서 바퀴벌레를 마취시킨다. 그런 다음 엄지와 검지를 사용하여 곤충을 집어 배쪽에 접근합니다.

다음으로, 해부 가위를 사용하여 뒷다리의 콕사 끝을 콕사와 트로챈터 사이에서 잘라냅니다. 콕사의 다른 곳을 절단하는 것은 혈림프 수집에 덜 효율적입니다. 이제 절개 부위에 10마이크로리터의 마이크로피펫을 놓고 출혈하는 혈림프를 끌어올리면서 복부를 부드럽게 조입니다.

바퀴벌레 다섯 마리의 혈림프가 하나의 마이크로 원심분리기 튜브에 모일 때까지 이 과정을 반복합니다. 다음으로, 10초 동안 고인 혈림프를 잠시 회전시킵니다. 그런 다음 10마이크로리터의 혈림프와 50마이크로리터의 1x 곤충 식염수 완충액을 결합합니다.

이제 희석된 혈림프를 10분 동안 원심분리하여 용액에서 혈구를 빼냅니다. 그런 다음 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 마지막으로, 마이크로볼륨 UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 총 단백질 농도를 정량화하고 각 샘플의 농도를 마이크로리터당 단백질 6mg으로 조정합니다.

중장액을 모으려면 먼저 얼음 위에서 바퀴벌레를 마취한다. 그런 다음 차가운 1x 곤충 식염수 완충액이 들어 있는 해부 플레이트로 하나를 옮기고 곤충 핀을 사용하여 복부 면이 위로 향하도록 고정합니다. 이제 가는 핀셋을 사용하여 복부를 해부합니다.

그런 다음 장 전체를 제거하고 1x 곤충 식염수 완충액이 있는 신선한 접시에 옮깁니다. 다음으로, 작물과 말피기안 세뇨관 사이의 영역인 중장을 분리합니다. 이렇게 하려면 동물의 앞부분을 제거하고 뒷부분을 제거한다.

다음으로, 100마이크로리터의 곤충 식염수 완충액이 있는 미세 원심분리 튜브로 중장을 빠르게 옮깁니다. 바퀴벌레 여섯 마리의 중간 내장을 같은 튜브에 모으십시오. 그런 다음 10초 동안 튜브를 소용돌이칩니다.

다음으로, 혼합물을 10분 동안 원심분리하여 혈구와 장 조직을 분리합니다. 그런 다음 상층액을 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 농도를 마이크로리터당 단백질 6mg으로 조정합니다. 이중 가닥 RNA 리포플렉스는 준비 후 한 시간 이내에 사용해야 합니다.

준비하는 동안 모든 희석된 시약과 희석된 이중 가닥 RNA를 동시에 결합해야 합니다. 그런 다음 혼합물을 빠르게 와류로 배양하십시오. 준비가 되면 4마이크로리터의 이중 가닥 RNA 용액을 대조군으로 10마이크로리터의 곤충 식염수 완충액과 혼합하거나 혈림프 또는 중장액에서 추출한 10마이크로리터의 추출된 효소와 혼합합니다.

다음으로, 2마이크로리터의 EGTA를 첨가하여 효소 억제 방제를 만듭니다. 그렇지 않으면 RNase가 없는 물 2마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 25도에서 한 시간 이상 샘플을 배양합니다.

배양 후 200 마이크로 리터의 추출 시약과 40 마이크로 리터의 클로로포름을 첨가 한 다음 와류를 첨가하십시오. 다음으로, 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 다음으로, 각 상등액 150마이크로리터를 새 튜브로 옮기고 150마이크로리터의 이소프로판올을 첨가하고 샘플을 얼음에서 15분 동안 배양하여 각 샘플에서 이중 가닥 RNA를 침전시킵니다.

배양 후 샘플을 다시 원심분리하고 상등액을 폐기합니다. 그런 다음 각 펠릿에 200마이크로리터의 70% 에탄올을 추가하고 튜브를 원심분리하여 RNA 펠릿을 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후 이중 가닥 RNA 펠릿을 원심 진공 농축기를 사용하여 3분 동안 건조시킵니다.

그런 다음 펠릿을 RNase가 없는 물 10마이크로리터에 재현탁합니다. 마지막으로 1.5% 아가로스 겔을 사용하여 처리된 이중 가닥 RNA의 무결성을 확인합니다. 바퀴벌레에게 하루에 두 번, 불을 켠 후 1시간 후와 불이 꺼지기 1시간 전에 먹이를 줍니다.

8일 또는 16일 동안 쉬지 않고 이 작업을 수행하십시오. 이 기간 동안 바퀴벌레는 그렇지 않으면 물이 부족해야 합니다. 수유를 위해 갓 준비된 이중 가닥 RNA 리포플렉스와 네이키드 이중 가닥 RNA를 사용할 수 있습니다.

볼루스의 경우 4마이크로리터의 이중 가닥 RNA 리포플렉스 또는 250나노그램의 네이키드 이중 가닥 RNA와 함께 사용합니다. 바퀴벌레에게 먹이를 주려면 먼저 유연한 집게를 사용하여 날개를 잡습니다. 바퀴벌레의 신체 부위를 잡지 마십시오.

그런 다음 용액 방울을 입 부분 가까이에서 천천히 피펫으로 피펫하고 바퀴벌레가 방울을 섭취하는 것을 지켜보십시오. 마지막으로 먹이를 준 후에는 바퀴벌레에게 물병을 제공하십시오. 먹이를 주는 동안 매일 곤충을 평가하여 폐사율을 확인하고 실험에서 더 이상 움직이지 않는 바퀴벌레를 제거하십시오.

이중 가닥 욕조 리포플렉스를 지속적으로 경구 투여하면 중장 내 튜불린 발현을 9일째 40%에서 17일째 60%로 줄일 수 있었습니다. 이에 비해 벌거벗은 이중 가닥 RNA는 효과가 없었습니다. 이는 벌거벗은 이중 가닥 RNA를 중장 주스에 노출시키면 한 시간 이내에 분해되는 반면, 리포솜 접합 이중 가닥 RNA는 안정적으로 유지된다는 사실에 기인할 가능성이 가장 높습니다.

RNA 수치가 감소했을 뿐만 아니라 튜불린 이중 가닥 RNA 리포플렉스를 지속적으로 공급하는 것도 상당한 치사율을 초래했습니다. 이는 이중 가닥 RNA를 EGFP로 운반하는 리포플렉스가 치사율을 나타내지 않았기 때문에 벡터 때문일 가능성은 낮습니다. RNA 간섭의 이러한 구강 전달 시스템을 시도하는 동안 며칠 동안 이중 가닥 RNA를 지속적으로 공급하는 것이 중요합니다.

일단 숙달되면 먹이 단계는 적절하게 수행되면 곤충 한 마리당 2분 안에 완료할 수 있습니다. 필요한 경우 공급 절차와 RNAi 효율성을 개선하기 위해 리포좀 나노 입자의 다른 제형을 적용할 수 있습니다. 궁극적으로 이 기술은 병충해 관리 분야의 연구자들이 RNAi를 사용하여 새로운 방제 전략을 탐구하는 것을 가능하게 했습니다.