Name: RNA 방해의 실용적인 사용: Liposome 캐리어 바퀴벌레에 대 한 이중 가닥 RNA의 구두 납품 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 배우세요 독일바퀴벌레 중장 유전자 발현을 억제하는 RNA 간섭 기술을 리포좀 캐리어를 이용한 경구 투여로 수행하는 방법입니다. 이 기술은 해충 관리를 위한 새로운 유전자 표적 전략 개발에 활용됩니다.

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이 연구는 대만 (사역의 과학 및 기술, 가장 100-2923-B-002-002-MY3 하 고 H.J.L.를 106-2313-B-002-011-MY3)에서 교부 금에 의해 지원 되었다 체코 공화국 (부여 기관 남쪽 보 헤 미아 대학 GAJU 부여 065/2017/P Y.H.L), 및 스페인 ( 스페인 경제와 경쟁력, CGL2012-36251 및 CGL2015-64727-P X.B., 그리고 카탈루냐어 정부에 부여 부여 2014 SGR 619 X.B.); 그것은 또한 경제 및 지역 개발 (X.B. 페더 자금)에 대 한 유럽 기금에서의 재정 지원을 받았다.

1. 합성 및 dsRNA의 준비
<ol><li>대상 유전자의 3' 되지 않은 지역에 dsRNA 대상 사이트를 식별 합니다. Α-tubulin (욕조) 유전자를 대상으로 사용 되는 dsTub (은행 승인 번호: KX228233), 그리고 dsEGFP의 순서에서 부정적인 dsRNA 제어 설계 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP; 은행 승인 번호: LC311024).</li>
	<li>T7 발기인 순서를 포함 하는 유전자 특정 뇌관으로 dsRNA 템플릿 합성 표준 PCR 증폭을 수행 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). 린 외PCR 증폭 조건 및 사용 되는 뇌관 정보 그 보고 있습니다. (2017) 12 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>DsRNA 준비 T7 전사를 사용 하 여 계속 키트 ( 재료의 표참조), 제조업체의 지침에 따라. 참고: 높은 수량 dsRNA를, (총 40 µ L)에서 1 개의 관에 2 개의 반응을 혼합 하 고 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	<li>2 µ L DNase의 추가 ( 재료의 표참조) 다이제스트 DNA 템플릿에 37 ° C에서 15 분 동안 dsRNA 샘플으로.</li>
	<li>추가 200 µ L 추출 시 약 ( 재료의 표참조) 40 µ L 클로 프롬, 그리고 소용돌이.</li>
	<li>4 ° C에서 13000 x g에서 10 분 동안 centrifuge 다음 새로운 microcentrifuge 튜브에 상쾌한 (150 µ L)를 수집 합니다.</li>
	<li>150 µ L 소 프로 파 놀을 추가 하 고 얼음에 15 분 동안 잠복기 여 dsRNA를 침전.</li>
	<li>4 ° C에서 13000 x g에서 15 분 동안 centrifuge 다음 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>DsRNA 펠 릿을 세척을 70% 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 13000 x g에서 10 분 원심 분리기</li>
	<li>에탄올을 제거 하 고 에탄올 세척 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>에탄올과 3 분 동안 원심 진공 집중 하 여 펠 렛 건조 dsRNA 다음 RNase 무료 물 dsRNA를 resuspend.</li>
	<li>마이크로 볼륨 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 순화 dsRNA의 수량을 결정 ( 재료의 표참조) 제조업체의 지침에 따라 고 원하는 농도 (예를 들면,의 준비를 위해 µ 0.25 µ g/L dsRNA lipoplexes)입니다.</li>
	<li>최대 3 개월 동안-20 ° C에서 dsRNA 샘플을 저장 합니다.</li>
</ol>2입니다. dsRNA Lipoplexes의 준비
<ol><li>Transfection 시 약의 4 µ L를 희석 ( 재료의 표참조) 5% 포도 당 솔루션의 4 µ L을 추가 하 여. 5% 포도 당 솔루션의 4 µ L을 추가 하 여 (1 µ g) dsRNA의 4 µ L를 희석.</li>
	<li>추가 희석된 liposome 시 약 해결책 즉시 희석된 dsRNA 솔루션으로 한 번에. 짧게 그들을 혼합 하 25 ° c.에 15 분 동안 품 어 소용돌이 참고: 역순으로 솔루션을 혼합 하지 마십시오.</li>
	<li>DsRNA lipoplexes 사용 하기 위해 준비가 되었습니다. 준비, 1 시간 이내 사용 하 고 1 시간 후 삭제. 참고: 제조업체의 지침에 따라 lipoplexes는 가능한 빨리 사용 되어야 한다.</li>
</ol>3. Hemolymph Midgut 주스에서 세포 외 효소의 수집
<ol><li>
곤충 염 분 버퍼 (10 x 주식)
	<ol>
<li>두 배 증류수 109.3 g NaCl, KCl 15.7 g, 6.3 g CaCl2와 8.3 g MgCl2·6H2o. 900 mL를 혼합</li>
		<li>PH 6.8를 조정 하 고 최대 1000 mL를 채우기.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hemolymph 컬렉션
	<ol>
<li>그들은 3 분 동안 이동 하지 않습니다 때까지 얼음에 바퀴벌레를 anesthetize.</li>
		<li>바퀴벌레 (엄지와 검지 손가락), 두 손가락으로 누른 바퀴벌레의 복 부 측을 올려.</li>
		<li>해가 위를 사용 하 여 뒷 다리의 고관절의 끝을 잘라. 참고: 고관절 및 trochanter 사이의 연결된 교차로 잘라. 고관절의 다른 부분의 절단 hemolymph를 수집 하는 비효율적 이었다.</li>
		<li>부드럽게 가운데 손가락으로 복 부를 짜 내 고 10 µ L micropipette 절 개에서 출혈 하는 hemolymph를 수집 합니다.</li>
		<li>Microcentrifuge 튜브에 여러 바퀴벌레 (5 개인)에서 hemolymph를 풀. 참고: Microcentrifuge 튜브 melanization를 방지 하기 위해 얼음에 계속. 남성 바퀴벌레에서 얻은 hemolymph의 평균 볼륨 2-3 µ L 이다.</li>
		<li>10 대 벤치탑 분리기와 짧게는 hemolymph 아래로 회전 s.</li>
		<li>원하는 볼륨 (즉, 10 µ L), hemolymph의 전송 및 1 x 곤충 염 분 버퍼의 50 µ L을 혼합.</li>
		<li>Hemocytes 아래로 회전 하 4 ° C에서 1000 x g에서 10 분 원심 분리기. 깨끗 한 microcentrifuge 튜브는 상쾌한 전송.</li>
		<li>A28015를 측정 하 여 마이크로 볼륨 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 총 단백질 농도 계량.</li>
		<li>동일한 단백질 농도 (6 mg / µ L의 총 단백질)을 각 샘플을 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Midgut 주스 컬렉션
	<ol>
<li>얼음에 바퀴벌레 anesthetize 바퀴벌레 복 부 측을 수정 해 부 접시에 찬 1 x 곤충 염 분 버퍼 곤충 핀을 사용 하 여 합니다.</li>
		<li>고급 핀셋으로 복 부를 해 부. 전체 소화 관 (앞, 중간, 그리고 뒷 창 자 포함) 곤충 염 분 버퍼 x 1 신선한 요리를 제거 합니다.</li>
		<li>전면 및 뒷 창 자 제거 하 고 신속 하 게 100 µ L 곤충 염 분 버퍼를 포함 하는 microcentrifuge 튜브는 midgut 전송.</li>
		<li>수영장 6 바퀴벌레 같은 튜브 및 10에 대 한 소용돌이에서 midguts s.</li>
		<li>Hemocytes 및 창 자 조직 회전 하 4 ° C에서 1000 x g에서 10 분 원심 분리기. 깨끗 한 microcentrifuge 튜브는 상쾌한 전송.</li>
		<li>A28015를 측정 하 여 마이크로 볼륨 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 총 단백질 농도 계량.</li>
		<li>동일한 단백질 농도 (6 mg / µ L의 총 단백질)을 각 샘플을 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. dsRNA 저하 분석 결과
<ol><li>갓 벗은 dsRNA의 dsRNA lipoplexes (1 µ g) 4 µ L를 준비 합니다.</li>
	<li>믹스 hemolymph, 또는 midgut dsRNA 솔루션 곤충 염 분 버퍼 (제어)의 10 µ L 추출 효소 주스.</li>
	<li>EGTA (20mm) 또는 RNase 무료 물 효소 활동의 저해에 대 한 컨트롤 샘플을 2 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>1 시간 또는 더 많은 (6, 12, 또는 24 시간) 25 ° c.에 품 어</li>
	<li>200 µ L 추출 시 약 및 40 µ L 클로 프롬, 소용돌이 다음을 추가 합니다.</li>
	<li>4 ° C에서 13000 x g에서 10 분 동안 centrifuge 다음 새로운 microcentrifuge 튜브에 상쾌한 (150 µ L)를 수집 합니다.</li>
	<li>150 µ L 소 프로 파 놀을 추가 하 고 얼음에 15 분 동안 잠복기 여 dsRNA를 침전.</li>
	<li>4 ° C에서 13000 x g에서 15 분 동안 centrifuge 다음 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>DsRNA 펠 릿을 세척을 70% 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 13000 x g에서 10 분 원심 분리기</li>
	<li>에탄올을 제거 하 고 에탄올 세척 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>에탄올과 10 µ L RNase 무료 물으로 3 분 Resuspend dsRNA에 대 한 원심 진공 집중 하 여 펠 렛 건조 dsRNA 제거 합니다.</li>
	<li>1.5 %agarose 젤에 젤 전기 이동 법을 통해 치료 dsRNA의 무결성을 확인 하십시오.</li>
</ol>5. 구강 관리 dsRNA의
<ol><li>건조 식품 (차 개)의 광고 libitum 다이어트 바퀴벌레를 유지 합니다. 바퀴벌레에서 물 공급을 하루 dsRNA 섭취 실험 전에 박탈.</li>
	<li>유연한 집게 (그림 1, 5 단계)와 함께 그것의 날개를 잡아 하 여 바퀴벌레를 잡아. 참고: 바퀴벌레의 신체 부위를 잡아 하지 마십시오.</li>
	<li>준비는 dsRNA lipoplexes, 뿐만 아니라 벌 거 벗은 dsRNA, 먹이, 단원 2에서에서 설명한 대로. 참고: DsRNA lipoplexes 먹이 기 전에 갓 준비 되어야 한다.</li>
	<li>DsRNA lipoplexes 또는 벌 거 벗은 dsRNA의 4 µ L를 피드 (250 ng)는 micropipette와.</li>
	<li>천천히 피펫으로 dsRNA 솔루션의 방울, 바퀴벌레의 mouthparts에 가까운 고 바퀴벌레는 물방울을 완전히 섭취.</li>
	<li>8 일 또는 16 일 지속적으로 섭취 실험을 하루에 두 번 (1 시간 후에 빛 고을 조명 하기 전에 1 시간)을 수행 합니다. 참고: 모든 바퀴벌레는 물만 섭취 실험 동안 dsRNA 해결책 또는 제어 시 약 (예를 들어, nuclease 무료 물, 포도 당 솔루션 및 liposome 시 약)와 수동 먹이 통해 인수.</li>
	<li>DsRNA 실험의 섭취의 16 일 후 바퀴벌레에 물병을 제공 합니다.</li>
</ol>6. 최저 평가
<ol><li>선택한 시간에 포인트 (2, 9, 17 일 dsRNA 섭취 분석 결과 후), dsEGFP 및 dsTub 처리 곤충을 수집 하 고 (예를 들어, midgut) 선택한 조직 해 부.</li>
	<li>실시간 양이 많은 PCR (qRT-PCR)을 수행 합니다. QRT-PCR 증폭 조건 및 뇌관 정보 린 외에서 보고. (2017) 12.</li>
	<li>평가 dsRNA 치료 곤충 매일 사망률을 확인 하 고는 더 이상 바퀴벌레를 제거 하 고 제어 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜은 독일 바퀴벌레의 midgut 주스에서 ribonuclease 소화에 대 한 보호를 포함 하는 dsRNA lipoplexes의 구두 배달을 통해 효과적인 RNAi에는 메서드를 제공 합니다. 다양 한 곤충 종에 다른 연구에서와 같이, 구두 전달의 dsRNA 통해 가난한 RNAi 효과 대부분 차지 dsRNA8,,910의 저하에 의해. 이 프로토콜은 구두 전달의 dsRNA에에서 저하에 대 한 보호 차량으로 봉사 하는 리를 생성 합니다. 또한, dsRNA lipoplexes의 준비는 간단 하 고 쉽게 구강 RNAi로 적용 특히 곤충에에서 강한 ribonuclease 활동에 대 한.
다른 곤충10,,<sup class="xref"...

RNAi 많은 진핵생물1dsRNA 분자에 의해 트리거되는 post-transcriptional 입을 통로의 메커니즘을 통해 최저의 유전자 발현을 효과적인 방법으로 입증 되었습니다. 연구의 지난 10 년간, RNAi 주사를 통해 특정 유전자의 표현이 없애고 또는 곤충2,3의 다양 한 taxa에 dsRNA의 먹이로 동작을 개발에서 유전자의 기능 연구를 유용한 도구가 되고있다. 특이성 및 고갈 시키는 효과의 견고성, RNAi의 응용 프로그램은 현재 해충 제어 관리4,5에 대 한 잠재적인 전략으로 간주 되고있다. 그러나, RNAi의 효율 대상 다른 유전자 전달 방법에 따라 곤충 종 사이 널리 다릅니다. 증거의 성장 몸은 ribonucleases에 의해 타락은 dsRNA의 불안정 RNAi5,6의 제한 된 효능에 중요 한 요소는 나왔다. 예를 들어, Manduca sexta 에 낮은 RNAi 감도 사실 hemolymph 섞인 dsRNA 신속 하 게 저하 1 시간7에 의해 설명 되어 있다. 유사 하 게, 효율적으로 섭취 dsRNA 저하, midgut에서 알칼리 nucleases의 존재 다른 곤충 순서8,,910낮은 RNAi 효율성과 강하게 상관 된다.
DsRNA의 구두 전달 특히 해충 제어 전략에 RNAi의 응용 프로그램에 대 한 흥미 롭 지만 midgut에 nucleases에 의해 dsRNA의 저하를 지체 하는 방법을 하지 아직 개발 되었습니다, 어떤 효과적인 보장을 했합니다 먹이 통해 RNAi입니다. 그러나, 구두 전달의 dsRNA에 RNAi의 응답 다량 dsRNA, 누에나방에 예를 들어 50 µ g의 먹이 또는 지속적으로 8 일 (총에서 8 µ g dsRNA) 메뚜기 종에서 먹이 보고 되었습니다. 독일 바퀴벌레, Blattella germinica, dsRNA11,12,,1314의 주입에 의해 RNAi에 매우 민감 하지만 먹이 통해 dsRNA에 응답 하지 않습니다. 최근, 린 외. 그는 dsRNA liposome 사업자 결과 최저에 성공적인 RNAi에 α-tubulin 유전자 발현에에서 캡슐화 독일 바퀴벌레15midgut 및 트리거 상당한 사망률 (2017) 증명. DsRNA는 midgut에의 저하는 구두 RNAi에 대 한 제한 요소, liposome 사업자 저하, 쉽게 다른 곤충에 적용 가능한 용기에 강한 nuclease 활동에서 dsRNA를 보호 하기 위해 차량으로 서브. 메모, 특정 transfection 시 약을 선택 하기 위한 이유의 현재 프로토콜에서 liposome 캐리어는 그것 테스트 되었습니다 곤충 세포 선 transfection에 대 한 더 적은 독성으로 사용 ( 재료의 표참조)에 따라에 제조 업체의 지침입니다. Gharavi 외 에 다른 liposome transfection 시스템의 비교에 따르면 (2013) 16, transfecting 작은 간섭 RNA (siRNA)의 효율은 약이 고 다른 곤충17,18 dsRNA 전달 시스템에 사용 된 다른 상용 시스템 사이의 동일 . 또한, 우리의 먹이 방법은 충분히 신중 하 게 각 바퀴벌레에 의해 dsRNA의 적절 한 양을 섭취 하 고 결과 강력 하 고 확인 합니다. 요약 하자면, 현재 프로토콜 및 결과 dsRNA 안정성 향상 dsRNA lipoplexes를 사용 하 여 하는 해충에 대 한 유망한 접근 미래에 RNAi의 전략 구두 납품의 디자인에 문을 열어 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>GenJe Plus DNA in vitro Transfection 시약</td><td>SignaGen</td><td>SL100499</td><td>리포플렉스 준비를 위한</td></tr><tr><td>Blend Taq plus</td><td>TOYOBO&nbsp;</td><td>BTQ-201</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Fast SYBR 그린 마스터 믹스</td><td>ABI&nbsp;</td><td></td><td>qPCR FirstChoice</td></tr><tr><td>RLM-RACE 키트</td><td>Invitrogen</td><td>AM1700</td><td>3' UTR 식별을 위한 4385612&nbsp;</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 전사 키트</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>dsRNA 합성을 위한</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2239</td>는 <td>dsRNA</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td>에서 DNA 템플릿을 제거합니다. <td>dsRNA 또는 총 RNA 추출을 위한</td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td>은 <td>총 RNA에서 DNA 템플릿을 제거합니다.</td></tr><tr><td>클로로포름&nbsp;</td><td>dsRNA 또는 총 RNA 추출</td>2-프로판올용 <td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td></tr><tr><td></td><td>dsRNA 또는 총 RNA 추출</td>에탄올용 <td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td></tr><tr>dsRNA 또는 총 RNA 추출 에<td>탄올</td>용 <td>Sigma-Aldrich</td><td>24102</td><td>dsRNA 또는 총 RNA 추출용</td></tr><tr><td>디에틸 피로카보네이트, DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>RNase 자유 정제</td></tr><tr><td>포도당 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>리포플렉스 제제용</td>G3285</tr><tr><td>염화나트륨, NaCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>S7653</td><td>곤충 식염수 완충제 공식</td></tr><tr><td>염화칼륨, KCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9333</td><td>곤충 식염수 완충제 공식</td></tr><tr><td>염화칼슘, CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>곤충 식염수 완충제 공식</td></tr><tr><td>마그네슘 클로라이드 육수화물, MgCl2.6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>곤충 식염수 버퍼 공식</td></tr><tr><td>EGTA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>효소 억제제&nbsp;</td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>바퀴벌레 해부</td></tr><tr><td>미세 핀셋</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>바퀴벌레 해부</td></tr><tr><td>유연한 핀셋</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>바퀴벌레 홀딩&nbsp;</td></tr><tr><td>피펫맨</td><td>RAININ</td><td>P10</td><td>샘플 준비</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Axygen</td><td>MCT175C, PCR02C</td><td>샘플 준비</td></tr><tr><td>피펫 팁&nbsp;</td><td>Axygen</td><td></td><td>샘플 준비</td></tr><tr><td>vortexter</td><td>Digisystem</td><td>vm1000</td><td>샘플 준비</td></tr><tr><td>Minispin 원심분리기</td><td>The Gruffin Group</td><td>GMC 206</td><td>액체 스핀 다운&nbsp;</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>ALC</td><td>PK121R</td><td>시료 전처리</td></tr><tr><td>pH 측정기&nbsp;</td><td>JENCO</td><td>6071</td><td>pH 조정</td></tr><tr><td>마이크로 볼륨 분광광도계</td><td>Quawell</td><td>Q3000</td><td>핵산 정량</td></tr><tr><td>PCR 열 순환기</td><td>ABI&nbsp;</td><td>2720</td><td>주형 PCR 또는&nbsp; dsRNA 합성 배양&nbsp;</td></tr><tr><td>정량적 real-time PCR</td><td>ABI&nbsp;</td><td>StepOne plus</td><td>유전자 발현 정량적</td></tr><tr><td>원심 진공 농축기</td><td>eppendorf</td><td>5301</td><td>dsRNA 또는 총 RNA 추출용</td></tr><tr><td>멀티펫&nbsp;</td><td>Real-Time PCR 시료 로딩을 위한</td> <td>Eppendorf</td><td>xStream</td>&nbsp;</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>핵산 전기영동</td></tr><tr><td>욕조 유전자 specfifc forward preimer</td><td>tri-I 생명공학</td><td></td><td>GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA</td></tr><tr><td>욕조 유전자 specfifc reverse preimer</td><td>tri-I 생명공학</td><td></td><td>TCC TGC TCC TGT CTC GCT</td></tr> GA <tr><td>dsTub 템플릿 포워드 프라이머</td><td>tri-I 생명공학</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA CTA TAGA CAA GCC GGA GTG CAG&nbsp;</td></tr><tr><td>dsTub 템플릿 리버스 프라이머</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG&nbsp;</td></tr><tr><td>dsEGFP 템플릿 포워드 프리머</td><td>트라이-I 생명공학</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA 태그 GGTG GTG AGC AAG GGC GAG</td></tr><tr><td>개그 dsEGFP 템플릿 리버스 프리머</td><td>트라이-I 생명공학</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA 태그 ggt ggc gga TCT tga AGT TCA CC</td></tr><tr><td>튜브 qPCR 포워드 프라이머</td><td>트라이-I 생명공학</td><td></td><td>GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC</td></tr><tr><td>욕조 qPCR 리버스 프라이머</td><td>트라이-I 생명공학</td><td></td><td>CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC</td></tr><tr><td>ef1 qPCR 포워드 프라이머</td><td>tri-I 생명공학</td><td></td><td>CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A</td></tr><tr><td>ef1 qPCR리버스 프리머</td><td>트라이-I 생명공학</td><td></td><td>CCT GCA GAG GAA GAA GAA</td></tr></tbody></table> GA G

rna 방해의 실용적인 사용: liposome 캐리어 바퀴벌레에 대 한 이중 가닥 rna의 구두 납품

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA 간섭 (RNAi) 수많은 유전자의 생물 학적 기능을 잠복 근무에 대 한 광범위 하 게 적용 하 고 필수 유전자 발현의 중단에 의해 해충 제어 도구 운영으로 envisaged 되었습니다. 다른 메서드를 주입, 먹이, 및 몸을 담글, 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 배달에 대 한 보고 되었습니다, 비록 구두 전달의 dsRNA 통해 RNAi의 효율은 매우 다른 곤충 집단 변수. 이전에 게시 하는 많은 연구에 의해 표시 된 독일 바퀴벌레, Blattella germanica, dsRNA 주입에 매우 민감한입니다. 현재 연구는 dsRNA liposome 사업자와 캡슐화 midgut 주스 dsRNA의 저하를 지체 시키는 충분 한지 설명 하는 방법을 설명 합니다. 특히, dsRNA 리 크게 캡슐화의 지속적인 먹이 midgut tubulin 식 감소 하 고 바퀴벌레의 죽음에 지도. 결론적으로, 수립 및 활용 dsRNA nucleases에 대 한 보호, dsRNA lipoplexes 수 곤충 해충에 대 한 RNAi의 실제적인 사용을 미래에 있습니다.

DsRNA의 구두 전달 프로토콜의 단순화 된 구조는 그림 1, dsRNA lipoplexes의 준비에 대 한 주요 단계 표시 됩니다에 표시 됩니다.
B. germanica, 비보 전 분석 결과 dsTub lipoplexes midgut 주스 incubated 했다 실시 됐다는 dsRNA의 무결성의 midgut 주스에서 dsRNA 저하 시 liposome 사업자에 의해 주어진 보호를 조사 하기 위하여 이후에 1.5 %agarose 젤에 분석 했다. 그림 2 는 반면 liposome 사업자 비보 전 에서 1 시간 이상 저하에 대 한 dsRNA를 보호 하기 위해 수 있었다 강한 RNA nuclease 활동 midgut 주스의...

이 원고는의 리에 이중 가닥 RNA의 구강 섭취를 통해 독일 바퀴벌레는 midgut에 유전자 발현의 고갈 보여 줍니다.

RNA 방해의 실용적인 사용: Liposome 캐리어 바퀴벌레에 대 한 이중 가닥 RNA의 구두 납품

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 리포좀 운반체에 캡슐화된 이중 가닥 RNA의 경구 섭취를 통해 RNA 간섭을 사용하여 바퀴벌레의 장에서 유전자 발현을 고갈시키는 것입니다. 이 방법은 새로운 해충 방제 방법 개발의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다., 예를 들어 열린 들판에서 필수 유전자를 쓰러뜨리면 해충을 죽일 수 있습니까? 이 기술의 주요 장점은 리포솜이 유전자 특이적 이중 가닥 RNA를 보호하여 표적 세포로의 전달을 보장한다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 박사후 연구원인 Jia-Hsin Huang과 제 연구실의 기술자인 Yun Liu입니다. 먼저 바퀴벌레가 3분 동안 움직이지 않을 때까지 얼음 위에서 바퀴벌레를 마취시킨다. 그런 다음 엄지와 검지를 사용하여 곤충을 집어 배쪽에 접근합니다.다음으로, 해부 가위를 사용하여 뒷다리의 콕사 끝을 콕사와 트로챈터 사이에서 잘라냅니다. 콕사의 다른 곳을 절단하는 것은 혈림프 수집에 덜 효율적입니다. 이제 절개 부위에 10마이크로리터의 마이크로피펫을 놓고 출혈하는 혈림프를 끌어올리면서 복부를 부드럽게 조입니다.바퀴벌레 다섯 마리의 혈림프가 하나의 마이크로 원심분리기 튜브에 모일 때까지 이 과정을 반복합니다. 다음으로, 10초 동안 고인 혈림프를 잠시 회전시킵니다. 그런 다음 10마이크로리터의 혈림프와 50마이크로리터의 1x 곤충 식염수 완충액을 결합합니다.이제 희석된 혈림프를 10분 동안 원심분리하여 용액에서 혈구를 빼냅니다. 그런 다음 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 마지막으로, 마이크로볼륨 UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 총 단백질 농도를 정량화하고 각 샘플의 농도를 마이크로리터당 단백질 6mg으로 조정합니다.중장액을 모으려면 먼저 얼음 위에서 바퀴벌레를 마취한다. 그런 다음 차가운 1x 곤충 식염수 완충액이 들어 있는 해부 플레이트로 하나를 옮기고 곤충 핀을 사용하여 복부 면이 위로 향하도록 고정합니다. 이제 가는 핀셋을 사용하여 복부를 해부합니다.그런 다음 장 전체를 제거하고 1x 곤충 식염수 완충액이 있는 신선한 접시에 옮깁니다. 다음으로, 작물과 말피기안 세뇨관 사이의 영역인 중장을 분리합니다. 이렇게 하려면 동물의 앞부분을 제거하고 뒷부분을 제거한다.다음으로, 100마이크로리터의 곤충 식염수 완충액이 있는 미세 원심분리 튜브로 중장을 빠르게 옮깁니다. 바퀴벌레 여섯 마리의 중간 내장을 같은 튜브에 모으십시오. 그런 다음 10초 동안 튜브를 소용돌이칩니다.다음으로, 혼합물을 10분 동안 원심분리하여 혈구와 장 조직을 분리합니다. 그런 다음 상층액을 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 농도를 마이크로리터당 단백질 6mg으로 조정합니다. 이중 가닥 RNA 리포플렉스는 준비 후 한 시간 이내에 사용해야 합니다.준비하는 동안 모든 희석된 시약과 희석된 이중 가닥 RNA를 동시에 결합해야 합니다. 그런 다음 혼합물을 빠르게 와류로 배양하십시오. 준비가 되면 4마이크로리터의 이중 가닥 RNA 용액을 대조군으로 10마이크로리터의 곤충 식염수 완충액과 혼합하거나 혈림프 또는 중장액에서 추출한 10마이크로리터의 추출된 효소와 혼합합니다.다음으로, 2마이크로리터의 EGTA를 첨가하여 효소 억제 방제를 만듭니다. 그렇지 않으면 RNase가 없는 물 2마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 25도에서 한 시간 이상 샘플을 배양합니다.배양 후 200 마이크로 리터의 추출 시약과 40 마이크로 리터의 클로로포름을 첨가 한 다음 와류를 첨가하십시오. 다음으로, 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 다음으로, 각 상등액 150마이크로리터를 새 튜브로 옮기고 150마이크로리터의 이소프로판올을 첨가하고 샘플을 얼음에서 15분 동안 배양하여 각 샘플에서 이중 가닥 RNA를 침전시킵니다.배양 후 샘플을 다시 원심분리하고 상등액을 폐기합니다. 그런 다음 각 펠릿에 200마이크로리터의 70% 에탄올을 추가하고 튜브를 원심분리하여 RNA 펠릿을 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후 이중 가닥 RNA 펠릿을 원심 진공 농축기를 사용하여 3분 동안 건조시킵니다.그런 다음 펠릿을 RNase가 없는 물 10마이크로리터에 재현탁합니다. 마지막으로 1.5% 아가로스 겔을 사용하여 처리된 이중 가닥 RNA의 무결성을 확인합니다. 바퀴벌레에게 하루에 두 번, 불을 켠 후 1시간 후와 불이 꺼지기 1시간 전에 먹이를 줍니다.8일 또는 16일 동안 쉬지 않고 이 작업을 수행하십시오. 이 기간 동안 바퀴벌레는 그렇지 않으면 물이 부족해야 합니다. 수유를 위해 갓 준비된 이중 가닥 RNA 리포플렉스와 네이키드 이중 가닥 RNA를 사용할 수 있습니다.볼루스의 경우 4마이크로리터의 이중 가닥 RNA 리포플렉스 또는 250나노그램의 네이키드 이중 가닥 RNA와 함께 사용합니다. 바퀴벌레에게 먹이를 주려면 먼저 유연한 집게를 사용하여 날개를 잡습니다. 바퀴벌레의 신체 부위를 잡지 마십시오.그런 다음 용액 방울을 입 부분 가까이에서 천천히 피펫으로 피펫하고 바퀴벌레가 방울을 섭취하는 것을 지켜보십시오. 마지막으로 먹이를 준 후에는 바퀴벌레에게 물병을 제공하십시오. 먹이를 주는 동안 매일 곤충을 평가하여 폐사율을 확인하고 실험에서 더 이상 움직이지 않는 바퀴벌레를 제거하십시오.이중 가닥 욕조 리포플렉스를 지속적으로 경구 투여하면 중장 내 튜불린 발현을 9일째 40%에서 17일째 60%로 줄일 수 있었습니다. 이에 비해 벌거벗은 이중 가닥 RNA는 효과가 없었습니다. 이는 벌거벗은 이중 가닥 RNA를 중장 주스에 노출시키면 한 시간 이내에 분해되는 반면, 리포솜 접합 이중 가닥 RNA는 안정적으로 유지된다는 사실에 기인할 가능성이 가장 높습니다.RNA 수치가 감소했을 뿐만 아니라 튜불린 이중 가닥 RNA 리포플렉스를 지속적으로 공급하는 것도 상당한 치사율을 초래했습니다. 이는 이중 가닥 RNA를 EGFP로 운반하는 리포플렉스가 치사율을 나타내지 않았기 때문에 벡터 때문일 가능성은 낮습니다. RNA 간섭의 이러한 구강 전달 시스템을 시도하는 동안 며칠 동안 이중 가닥 RNA를 지속적으로 공급하는 것이 중요합니다.일단 숙달되면 먹이 단계는 적절하게 수행되면 곤충 한 마리당 2분 안에 완료할 수 있습니다. 필요한 경우 공급 절차와 RNAi 효율성을 개선하기 위해 리포좀 나노 입자의 다른 제형을 적용할 수 있습니다. 궁극적으로 이 기술은 병충해 관리 분야의 연구자들이 RNAi를 사용하여 새로운 방제 전략을 탐구하는 것을 가능하게 했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

RNA 간섭은 유전자의 기능을 분석하는 매우 효과적인...

dsRNA 주입하여 RNAi 간섭에 Drosophila 태아

여기서 우리는 유충 섭취 RNA 나노 입자 / 키토산의 사용을 통해 질병 벡터 모기 유전자 기능을 억제 간섭하는 절차를 설명한다.

질병 벡터 모기 유충의 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자 중재 유전자 음소거

여기, 우리는 실험실에서 중간 - 세균 딱정벌레, Dermestes maculatus (D. maculatus)를 양육하기위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한이 종에서 유전자 기능을 연구하기 위해 배아 표현형을 분석 배아 및 부모의 RNAi를위한 프로토콜과 방법을 공유 할 수 있습니다.

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초, Dermestes maculatus

이 문서에는 RNA 간섭 (RNAi) 곤충 먹이 체 관 부 수액에 대 한 식물의 혈관 조직을 통해 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 구두 납품을 위해 개발 된 새로운 기술을 보여 줍니다.

체 관 부 식물 수액 공급 Hemipteran 곤충에 RNA 간섭을 유도 하 이중 가닥 RNA 구두 전달 방법

이 프로토콜 우리가 표준화 하 고 몇 년 동안 모기와 집 파리의 hemolymph를 직접 핵 산의 특정 수량을 제공 하는 데 사용 하는 microinjection 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 최소 주입 죽음 귀착되 고 통치의 복용량 상관 측정을 허용 한다.

재현할 수 dsRNA Microinjection 및 산란 검정 집 파리 모기에

RNA 간섭은 특정 발달 단계에서 유전자 발현을 조작하기 위한 널리 적용가능하고 강력한 기술입니다. 여기서, 우리는 수중 다이빙 딱정벌레 Thermonectus marmoratus에서이 기술을 구현하기 위한 필요한 단계를 기술합니다, 구조 또는 행동에 영향을 미치는 유전자의 녹다운에 유전자 의 취득에서.

특정 발달 시점에서 유전자 발현을 조작하기 위한 강력한 도구로 수생 딱정벌레의 RNA 간섭

세균에 의해 생산된 dsRNA의 경구 투여는, 예쁜꼬 마선충에서 일상적으로 사용되는 RNA 간섭(RNAi)에 대한 전달 방법으로서, 성인 모기에 성공적으로 적용되었다. 우리의 방법은 주사를 사용하지 않고도 강력한 역 유전학 연구 및 전송 차단 벡터 연구를 가능하게합니다.

성인 Anopheles 감비아 모기에 효과적인 경구 RNA 간섭 (RNAi) 투여

본 프로토콜은 P. americana에서 RNAi 조작 기술에 대한 단계별 지침을 설명합니다.

미국 바퀴벌레에 있는 RNA 간섭의 신청

여기에는 누에 Bombyx mori 유충에서 키토산/dsRNA 나노입자 전달을 통해 유전자 침묵을 유도하기 위한 프로토콜이 제시되어 있습니다.

키토산/dsRNA 나노입자 전달을 통한 누에 Bombyx mori 의 유충 RNA 간섭

Gaussia 루시페라아제 (GLuc) 유전자를 포함하는 선형화된 플라스미드로부터 캡핑 및 비캡핑 mRNA를 모두 고수율로 in vitro 합성하는 방법을 설명합니다. 합성된 RNA를 정제하고, 비캡핑 RNA의 일부를 Vaccinia 바이러스 캡핑 효소를 사용하여 효소적으로 캡핑합니다. 마지막 단계로, mRNA를 HeLa 세포에 형질전환하고 세포 배양 상청액의 루시페라아제 활성을 측정합니다.

HELA 세포 Transfection 얹는 Gaussia의 루시페라제의 mRNA의 시험 관내 스크립트 작성 및 상한에

배우세요 독일바퀴벌레 중장 유전자 발현을 억제하는 RNA 간섭 기술을 리포좀 캐리어를 이용한 경구 투여로 수행하는 방법입니다. 이 기술은 해충 관리를 위한 새로운 유전자 표적 전략 개발에 활용됩니다.

RNA 방해의 실용적인 사용: Liposome 캐리어 바퀴벌레에 대 한 이중 가닥 RNA의 구두 납품

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