Name: 높은 처리량 앞으로 화학 유전학의 화면 애기 thaliana 을 액체 처리 로봇의 사용을 최적화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 배우세요 액체 처리 로봇을 활용한 Arabidopsis thaliana 고처리량 화학 유전학 스크리닝 방법으로 식물 생리에 영향을 주는 신규 소분자 화합물을 효율적으로 발굴하는 기술입니다.

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우리가 건설 하 고 중요 한 토론을 위한 Jozsef 황새, 미첼 리치몬드, Jarrad Gollihue, 그리고 안드레아 산체스 감사합니다. Phenotypic 사진에 대 한 박사 Sharyn 페리입니다. 이 자료는 협력 계약 번호 1355438에서 국립 과학 재단에서 지 원하는 작업을 기반으로 합니다.

1. 희석 라이브러리 만들기
<ol><li>레이블을 625 희석 도서관 판, 화학 라이브러리에서 해당 그들의 접시에 일치 하는지 확인. 또한, 5 갤런 저수지에 콘솔 드라이브를 통해 그들을 전달 하 여 흐름 및 흐름 호스를 멀티 채널 팁 세척 자동화 기구 포지 셔 너 (ALP)를 연결 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>컴퓨터에 액세스 하 고 물을 회람 하기 위하여 멀티 채널 팁 세척 ALP 장치 컨트롤러의 연결을 통해 세척 펌프를 켭니다. 이 끌 것 이다 자동으로 프로토콜의 끝에.</li>
	<li>부하, 손을 스태커 10에 의해에 연결 된 호텔 A-D (그림 4, 스태커);에서 다음 순서로 스태커 회전 목마 객실 1, 96-잘 V 4에서 AP96 P20 피 펫 팁의 한 상자-바닥 접시 객실 2-5에서에서 두 위 접시는 정렬된 라이브러리와 두 낮은 접시 재고 농도 포함 하는 (그림 5, 스태커) 빈. 또한, 객실 6, 및 4 개의 96 잘 V AP96 P20 피 펫 팁의 1 개의 상자를 로드-정렬된 라이브러리와 2 개의 낮은 격판덮개의 재고 농도 포함 하 2 개의 상단 플레이트와 객실 7-9에서에서 하단 플레이트 빈 (그림 5, 스태커).</li>
	<li>설정, 손으로, P3, P7에 300 mL 70 %EtOH 목욕에 300 mL 물 저수지와 갑판 팁 로더 ALP (TL1), 그리고 멀티 채널 팁 세척 ALP (TW1) (그림 4, 갑판 및 그림 5, 갑판).</li>
	<li>운영 소프트웨어를 사용 하 여 스태커 10에서 AP96 P20 피 펫 팁을 제시 하 고 팁 로더 ALP에 이동. 참고: 액체 처리 로봇의 운영 소프트웨어; 1.5 1.12 모든 통해 완료 테이블의 자료를 참조 하십시오.</li>
	<li>호텔에서 룸 2를 제시 하 고 모든 4 개의 96 잘 V 분리-하단 플레이트는 갑판에 하단 배치 P4, P8에 2 및 P5 P9에 2 위 (그림 4).</li>
	<li>AP96 P20 피 펫 팁 팁 로더 96 채널 200 µ L 머리에 ALP와 함께 로드 합니다. 300 mL 물 저수지에서 90 µ L 발음 및 96-잘 V에 분배-P4에 바닥판 희석. P8에 접시에 대 한이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>반복적으로 발음 및 분배 15 µ L 세 번 P5에 화학 라이브러리 접시를 섞는다. 또한, P5에 화학 라이브러리 접시에서 10 µ L 발음 하 고 P4에 희석 접시에 10 µ L을 분배.</li>
	<li>총 세 번 반복적으로 발음 하 고 50 µ L를 분배 하 여 P4에 접시의 솔루션을 믹스. 혼합, 일단 깨끗 한 발음 및 70 µ L의 70%를 분배 하 여 AP96 P20 피 펫 팁 EtOH P7에서 발음 및 물 4의 110% 볼륨을 분배 하 여 멀티 채널 팁 세척 ALP에 세척 그들 시간.</li>
	<li>P8, P9에 번호판의 두 번째 쌍에 대 한 1.8-1.9 단계를 반복 합니다. 두 번째 96 잘 V 만들기 시-희석 바닥판, 스택 맨 하단에서 다음 순서로 접시: P9, P5, P8, P4. 다음, 한 빈 정적 ALP;에 스택 장소 P1, P2, P6, P10, P11, P12, 또는 P13.</li>
	<li>1.6 1.10 단계를 반복 하 여 호텔 A의 객실 5 비어. 1.5 룸 6 도달, 새로운 AP96 P20 피 펫 팁 팁 로더 ALP 고 빈 정적 ALP에 사용 된 AP96 P20 피 펫 팁을 배치에 따라 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>1.6 1.10 단계를 반복 하 여 호텔의 룸 9 A 비어. 그러나, 호텔 B를 진행 하기 위해서는 접시와 갑판에 팁 해야 합니다 다시 로드 호텔 대답에</li>
	<li>다시 작성, 손으로, 300 mL 물 저수지. 이 단계는 중요 한, 그리고 컴퓨터 프로그램 일시 중지를 치고 '계속', 다음 단계를 수행 하기 전에 사용자는이 메시지를 자세히를 통합할 수 있습니다.</li>
	<li>나머지 호텔, 보장 전체 300 mL 물 저수지 다음 호텔에 진행 하기 전에 각 시간에 대 한 1.5-1.13 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>2. 판 상영을 미디어-씨앗 혼합물 추가
<ol><li>½ 重 만들고 Skoog (MS) 미디어 0.1% 조정 5.7에 pH 4.3 g MS 소금, 0.50 g MES, 1.0 g 한 천 1 L 디 H2o.를 추가 하 여 한 천 하지만 pH 프로브를 모니터링 하는 동안 5 M 수산화 칼륨의 추가.</li>
	<li>15 그리고 30 분 사이 1% 표 백제와 SDS에 그들을 떨고 하 여 종자를 소독 하 고 후 원심 분리에 의해 물의 동등한 양으로 4 번 린스. 씨앗은 불 임, 일단 vernilization에 대 한 일 24 시간에서 4 ° C에서 그들을 놓습니다. 애기 생물 자원 센터의 살 균, vernilization, 및 성장22추가 방법을 설명합니다.</li>
	<li>미디어 씨앗 추가 손으로 0.1 g/100 mL의 조밀도에. 이 밀도 96 잘 접시 당 3-10 씨앗의 평균 결과입니다.</li>
	<li>손으로, 96-잘 평면 4 장소-객실 1과 2 (그림 6, 호텔) 호텔 A의 하단 접시. AP96 P250 피 펫 팁 팁 로더 ALP의 상자, 300 mL 저수지 2.1-2.3에 P3, 단계에서 만든 미디어 씨 혼합물으로 가득 그리고 300 mL 저수지 가득 70% EtOH P7에 (그림 4, 갑판 및 그림 6 갑판). 참고: 2.8 통해 2.5 운영 소프트웨어와 함께 할 수 있습니다.</li>
	<li>객실 1과 2 호텔 A에 제시 하 고 4 개의 격판덮개의 더미를 분리. 빈 정적 알프스 (P4, p5 급, P6, P8, P9, P10, P11, 및 P12)의 각각에 한 접시를 놓습니다. 96 채널 200 µ L 머리에 AP96 P250 피 펫 팁을 로드 합니다.</li>
	<li>P3에 300 mL 미디어 씨 저수지에서 90 µ L 발음 하 고 첫 번째 96 잘 평면으로 분배-하단 접시. 이 프로세스를 반복 하 여 모든 8 접시 포함 미디어 씨 혼합물.</li>
	<li>발음 하 고 70% 가득 300 mL 저수지에서 70 µ L를 분배 하 여 AP96 P250 피 펫 팁을 청소 EtOH P7에. 발음 및 분배 물 110% 볼륨 4 번 멀티 채널 팁 세척 ALP에 도움말을 세척 하 고 TL1에서 팁을 언로드 손으로 접시를 수집.</li>
</ol>3. 판 검사에 작은 분자를 추가
<ol><li>부하, 손으로, 룸 1의 호텔에 A, 2 96-잘 V AP96 P250 피 펫 팁의 상자-하단 희석 라이브러리 접시 객실 2, 4, 6, 및 8, 및 두 96 잘 평면 하단 상영 판 객실 3, 5, 7, 9 (그림 4 에 스태커 및 그림 7, 호텔 A). 또한, 5 갤런 저수지에 멀티 채널 팁 세척 ALP에서 호스를 연결 합니다. 참고: 3.10 통해 3.2 운영 소프트웨어와 함께 할 수 있습니다.</li>
	<li>P7;에서 300 mL 70 %EtOH 세척 저수지 포함 하 갑판을 구성 미디어-씨앗 저수지 P3에 갑판에 남아 있을 수 있습니다 (그림 4, 갑판 및 그림 7, 갑판). 또한, 멀티 채널 팁 세척 ALP 통해 물 순환 장치 컨트롤러의 연결을 통해 콘솔 드라이브를 켜십시오. 이 끌 것 이다 자동으로 프로토콜의 끝에.</li>
	<li>AP96 P250 피 펫 팁 상자의 호텔 A에서 제시 하 고 팁 로더 ALP로 이동.</li>
	<li>현재 96 잘 V-갑판 및 정적 ALP P4, P8에 하나에 한 장소를 호텔 룸 2 A에서에서 하단 희석 라이브러리 접시. 96-잘 평면 제시-하단 상영 판에서 3 갑판을 호텔 A의 객실 및 하나 정적 ALP P5 및 p 9에.</li>
	<li>AP96 P250 피 펫 팁 팁 로더 96 채널 200 µ L 머리에 ALP와 함께 로드 합니다.</li>
	<li>96-잘 V 믹스-발음 및 분배 50 µ L 세 번 P4에 바닥판 희석. 그 다음이 플레이트에서 10 µ L 발음 하 고 96 잘 평면으로 분배-P5에 바닥판 심사.</li>
	<li>발음 및 분배 50 µ L 세 번 P5에 접시에 솔루션을 믹스. 발음 및 70 µ L의 70%를 분배 하 여 에탄올 AP96 P250 피 펫 팁을 청소 EtOH P7와 발음 및 분배의 110% 볼륨으로 멀티 채널 팁 세척 ALP에 팁 물 4 번 다음 세척 저수지에서.</li>
	<li>3.5와 3.6 단계를 반복 하 여 두 번째 96 잘 v-희석 라이브러리 바닥판 (P8) 및 96-잘 평면-바닥판 심사 (P9).</li>
	<li>스택 2 96-잘 V-함께 하단 희석 라이브러리 접시와 함께 두 96 잘 플랫 바닥 심사 접시. 정적 알프스 P1, P2, P6, P10, P11, P12, 또는 P13 번호판 이동.</li>
	<li>반복 단계 3.4-3.9 세 번, 8 번의 총 플레이트 심사에 희석된 화학 제품을 추가. 마지막으로, 시각적 구조를 통해 심사 플레이트의 각 음에 씨앗의 수를 확인 하 고 추가 소독 및 vernalized 씨에 의해 3 씨 그 우물을 보충.</li>
</ol>4. 보육 및 판 상영의 시각화
<ol><li>품 어 96 잘 평면 하단 상영 판 4 일 동안 22 ° C에서 환경 챔버에 16/8 명암 주기 건조 증거 컨테이너에서. 96-잘-바닥이 빠진 상영 판 해 현미경 시각화. 추가 조사에 대 한 모든 탈 고기를 기록 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 프로토콜은 애기에 앞으로 화학 유전학 스크린 달성에 연구자를 지원 하도록 설계 되었습니다. 우리가 제공 하는 대표적인 결과 50000 화합물 (그림 2 및 그림 3)의 화면에서 가장 큰 앞으로 화학 유전학 스크린 중의 하나는9,,1323날짜에 애기에 수행. 액체 처리 로봇의 사용에는 더 효율적인 희석 라이브러리 및 라이브러리 생성을 차단, 속도 소설 화합물의 효율성을 향상 사용할 수 있습니다. 높은 처리량 자연에서 화면에 용량을 증가 감소 하는 노동 연구원 대신 동행 했다. 이 기술은 작은 씨앗이 나 해 현미경으로 보이는 식물을 수용할 수 있는 96 잘 접시와 함께 사용 하도록 설계 되었습니다. 큰 씨앗에 맞게 큰 우물 접시를 활용 하 여 처리량과 디자인...

지난 20 년 동안에서 식물 생물학 분야에서 연구자는 큰 진전을 화학 유전학 방법, 앞으로 및 역방향, 세포 벽 생 합성, 골격, 호르몬 생 합성에 대 한 우리의 이해를 개량 하 고 신호, gravitropism, 병 인, 퓨 린 생 합성, 그리고 endomembrane,12,3,,45를 인신 매매. 앞으로 화학 유전학 기술을 관심의 고기 식별 가능 하며 특정 프로세스의 genotypic 토대를 이해 연구 반대로, 반대로 화학 유전학 미리 결정된 단백질 대상6상호 작용 하는 화학 물질을 찾고 있습니다. 애기 때문에 매핑되고 주석 그것의 게놈은 작은, 식물 생물학에서 이러한 발견의 최전선에 왔다. 그것은 짧은 생성 시간, 그리고 여러 돌연변이/기자 라인 탈 subcellular 기계7의 식별을 용이 하 게 사용할 수 있다.
천천히 앞으로 화학 유전 스크린의 진행, 초기 심사 과정 및 관심8의 화합물의 목표를 결정 하는 두 가지 주요 병목을 확인 하 고 있습니다. 작은 분자 선택의 속도 증가에서 주요 원조 자동화 및 자동화 된 장비9의 사용 이다. 액체 처리 로봇 작은 분자의 큰 도서관을 처리 하기 위한 훌륭한 도구입니다 그리고 생물 과학10에서 진행을 운전에 도움이 되었습니다. 여기에 제시 된 프로토콜은. 빠른 속도로 생리 활성 작은 분자의 식별 사용 심사 프로세스와 관련 된 병목을 완화 하도록 설계 되었습니다. 이 기술은 노동의 원리 탐정에 경제적 비용 감소 연산자 대신 시간 부담 감소.
지금까지, 대부분의 화학 라이브러리 분석으로 150, 000와 일부 몇 가지 709,,1112,,1314, 로 일부 10000 그리고 20000 화합물 사이 개최 15 , 16. 여기 소개 하는 프로토콜 ( 재료의 표참조) 50000 화합물의 분자 라이브러리에 구현 된, 더 큰 앞으로 화학 유전학 중 화면 날짜에 실시 애기. 이 프로토콜 발견 제 초 제, 살충제의 발견, 살 균 제에 관련 된으로 특히 증가 효율성과 속도 앞으로 화학 유전학에 관한 현재 트렌드에 맞는 발견, 발견, 및 암 생물학17 마약 ,,1819,,2021. 비록 여기 애기와 구현,이 프로토콜을 쉽게 될 수 세포 배양, 포자, 그리고 잠재적으로 심지어 곤충을 96-384 / 1536-잘 접시에서 액체 매체에서. 작은 크기로 인해 애기는 의무가 96 잘 접시에서 심사. 그러나, 우물에 고르게 씨앗 배포는 도전 이다. 손 시드 노동 집약, 하지만 정확한 이며 96 잘 접시에 씨앗을 분배 하도록 하는 장치는, 그들은 저렴 하 게 구입할. 여기, 우리가 어떻게이 단계 피할 수 단지 작은 손실 정확도에 보여줍니다.
이 방법의 전반적인 목표는 애기 더 관리에 대 한 큰 화학 라이브러리 사용을 통해 액체 처리 로봇의 정확도 저하 없이 심사 수 있도록 했다. 이 메서드를 사용 하 여 초기 희석 시리즈 관리 및 후속 phenotypic 화면, 빠른 시각화 해 현미경 그리고 급속 한 샘플의 수를 완료 하는 데 걸린 시간을 감소 하 여 연구원의 효율성 향상 새로운 생리 활성 작은 분자의 id입니다. 그림 1 4 단계에서이 프로토콜의 주요 결과를 보여 줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig1.jpg"> 그림 1: 앞으로 화학 유전학 스크린의 전체 워크플로. 4 주요 단계의 각각에 대 한 몇 가지 세부 사항에 설명 하는 프로토콜의 개요. 1: 화학 라이브러리, 2 수신: 3 희석 라이브러리 만들기: 심사 접시, 및 4: 잠복기 및 심사 번호판을 시각화. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>Keyboard</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>프로토콜 설계 및 운영에 사용 Biomek FX</td></tr><tr><td>Mouse</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>프로토콜 설계 및 운영에 사용 Biomek FX</td></tr><tr><td>Computer Screen</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>프로토콜 설계 및 운영에 사용 Biomek FX</td></tr><tr><td>Computer</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>프로토콜 설계 및 운영에 사용 Biomek FX</td></tr><tr><td>DIVERSet Diverse Screening Library</td><td>ChemBridge</td><td>N/A</td><td>Chemical library</td></tr><tr><td>Biomek Software Beckman</td><td>Coulter</td><td>N/A</td><td>Biomek FX Device Controller 실행 및 설계</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>719366</td><td>워터 펌프/팁 세척 스테이션 작동</td></tr><tr><td>Stacker Carousel Pendent</td><td>Beckman Coulter</td><td>148240</td><td>Biomek 수동 작동 스태커 캐러셀</td></tr><tr><td>Biomek 스태커 캐러셀</td><td>Beckman Coulter</td><td>148520</td><td>모든 것을 수용하는 로터리 유닛 FX Stacker 10의</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>스크린용 구성 요소를 수용하는 엘리베이터 유닛</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>스크린용 구성 요소를 수용하는 엘리베이터 유닛</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>스크린의 구성 요소를 수용하는 엘리베이터 유닛</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>스크린의 구성 요소를 수용하는 엘리베이터 유닛</td></tr><tr><td>Biomek FX</td><td>Beckman Coulter</td><td>https://www.beckman.com/liquid-handlers</td><td>원하는 작업을 수행하는 로봇</td></tr><tr><td>Accuframe</td><td>Artisan Technology Group</td><td>76853-4</td><td>프레임 암을 사용하여 구성 요소를 적절하게 배치</td></tr><tr><td>프레이밍 픽스처</td><td>Beckman Coulter</td><td>719415</td><td>Accuframe</td></tr><tr><td>Multichannel Tip Wash ALP</td><td>Beckman Coulter</td><td>719662</td><td>에탄올 수조 후 팁</td></tr><tr><td>세척 팁 로더 ALP</td><td>Beckman Coulter</td><td>719356</td><td>암에 팁을 공압식으로 적재</td></tr><tr><td>공기 압축기</td><td>현지 공급자</td><td>N/A</td><td>공압 팁 로딩을 위한 공기 제공</td></tr><tr><td>MasterFlex 콘솔 드라이브</td><td>Cole-Parmer</td><td>77200-65</td><td>다중 채널 팁 와셔 에어 호스를 통해 물을 순환시키는 데 사용되는 펌프</td></tr><tr><td></td><td>로컬 공급자</td><td>N/A</td><td>공기 압축기에서 팁 로더 물 호스로 공기 제공</td></tr><tr><td></td><td>로컬 공급자</td><td>N/A</td><td>5갤런 예비에서 팁 와셔까지 물 제공</td></tr><tr><td>정적 ALP의</td><td>Beckman Coulter</td><td>는 Biomek FX와 함께 제공됩니다</td>. 스크린 <td>장비 지원</td></tr><tr><td>5 갤런 리저브</td><td>현지 공급자</td><td>N/A</td><td>는 팁 청소 과정에서 더러운 물을 재순환시킵니다.</td></tr><tr><td>그리퍼</td><td>Beckman Coulter</td>는 <td>Biomek FX가 함께 제공됩니다</td><td>. 장비를 잡아서 올바른 위치로 이동시킵니다.</td></tr><tr><td>96-채널 200 &마이크로; L 헤드</td><td>Beckman Coulter</td><td>는 Biomek FX와 함께 제공됩니다</td><td>스크린 내에서 사용되는 96 개의 팁을 보유합니다</td></tr><tr><td>AP96 P200 피펫 팁</td><td>Beckman Coulter</td><td>717251</td><td>스크리닝 라이브러리</td></tr><tr><td>96 Well Flat Bottom Plate</td><td>Costar</td><td>9018</td><td>스크린의 시각화를 돕습니다</td></tr><tr><td>96 Well V-Bottom Plate</td><td>Costar</td><td>3897</td><td>희석 라이브러리</td></tr><tr><td>AlumaSeal 96의 저장을 돕습니다. 씰링 필름</td><td>MedSci</td><td>F-96-100</td><td>화학 라이브러리 및 희석 라이브러리 저장용 씰</td></tr><tr><td>플라스틱 지퍼락 샌드위치 백</td><td>현지 공급업체</td><td>N/A</td><td>스크린의 습한 환경을 보장하기 위해 사용</td></tr><tr><td>AP96 P20 피펫 팁</td><td>Beckman Coulter</td><td>717254</td><td>희석 라이브러리 생성에 사용</td></tr><tr><td>성장 챔버</td><td>Percival</td><td>AR36L3</td><td>표현형을 위한 씨앗 발아 visulization</td></tr><tr><td>주걱</td><td>현지 공급자</td><td>N/A</td><td>액체 파종에 실패한 씨앗이 적절하게 실패한 우물에 추가할 씨앗을 보유</td></tr><tr><td>이쑤시개</td><td>지역 공급자</td><td>N/A</td><td>주걱에서 우물로 씨앗 밀어</td></tr><tr><td>Murashige 및 Skoog 기초 염 혼합물</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>M524</td><td>MS 매체 혼합물에 추가</td></tr><tr><td>MES 유리산 일수화물</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>pH 감소를 위해 MS 매체에 ICN19483580 첨가</td></tr><tr><td>한천 분말</td><td>Alfa Aesar</td><td>9002-18-0</td><td>종자 현탁액을 지원하기 위해 매체의 두께 증가</td></tr><tr><td>5M KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td>pH를 적절한 수준으로 증가</td></tr><tr><td>1L 매체 보관 병</td><td>Corning</td><td>1395-1L</td><td>스크린에 충분한 매체 수용</td></tr><tr><td>폴리프로필렌 원심 분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>431470</td><td>vernilization 전에 종자를 살균합니다</td></tr><tr><td>pH 프로브</td><td>Davis Instruments</td><td>YX-58825-26</td><td>미디어 ALP</td></tr><tr><td>(Automated Labware Positioners) 사용자 매뉴얼</td> 제작에 사용 <td>Beckman Coulter</td><td>PN 987836</td><td>Biomek FX의 수반 장비 설정 지원</td></tr><tr><td>Biomek 2000 Stacker Carousel 사용자 가이드</td><td>Beckman Coulter</td><td>609862-AA</td><td>Stacker Carousel</td></tr> <tr><td>설정 지원Biomek FX 및 FXP 실험실 자동화 워크스테이션 사용자 매뉴얼</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987834</td><td>멀티채널 포드를 구성하는 데 사용</td></tr><tr><td>Biomek FXP 실험실 자동화 워크스테이션 고객 시작 가이드</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN B32335AB</td><td>Biomek FX</td></tr><tr><td>Biomek 소프트웨어 사용자 설명서</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987835</td><td>설정하고 이해하는 데 사용됩니다. 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

높은 처리량 앞으로 화학 유전학의 화면 애기 thaliana 을 액체 처리 로봇의 사용을 최적화

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

화학 유전학은 점점 해독 식물 유전자 중복 또는 치 전통 유전학에 고집 불통 될 수 있는 특성을 채용 되 고 있습니다. 그러나, 생리 되는 합성 분자의 확률이 낮습니다; 따라서, 분자의 수천은 그 관심을 찾기 위해 테스트 되어야 한다. 액체 처리 로봇 시스템은 샘플, 속도는 화학 라이브러리 오류 최소화/표준화 이외에 상영 될 수 증가의 큰 숫자를 처리 하기 위해 설계 되었습니다. 벤치 탑 멀티 채널 액체를 사용 하 여 프로토콜 애기 thaliana (애기)에 50000 작은 분자의 도서관의 높은 처리량 앞으로 화학 유전학 스크린을 달성 하기 위해 필요한 최소한의 개발 되었다 로봇을 처리 기술 자가 참여. 이러한 프로토콜을 3,271 작은 분자는 그 표시 phenotypic 변경 발생 발견 되었다. 1,563 화합물 짧은 뿌리, 1,148 화합물 변경 채색, 383 화합물 발생 루트 머리와 다른, 비-, 분류 변경 및 177 화합물 저해 발 아를 유도 한다.

정확 하 고 효율적으로 특성화 해 현미경 농도 검사에서 작은 분자의 추가에 따라 고기 기능은 애기. 에 앞으로 화학 유전학의이 방법의 최종 목표 모든 50000 화합물 상영 되어 했다 때 관찰 하는 고기 다양 한 되었고 여러 가지 클래스 (그림 2)에 깨진 수 있습니다. 그림 3A -F 해 현미경 저 배율에서 관찰 된 고기의 예를 보여 줍니다. 일부 고기 결정적이 결과 (그림 3G, H) 제공. 이러한 화학 더 낮은 복용량에 다른 표현 형을 제공 하지 않은 되도록 낮은 농도에 필적 했다.
불 쌍 한 결과 여러 가지 이유로 발생할 ...

합성 작은 분자의 높은 처리량 화면 모델 식물 종, 애기 thaliana에 실시 됐다. 액체 처리 로봇에 대 한 개발이 프로토콜 앞으로 화학 유전학 스크린, 식물 생리학에 영향을 미치는 새로운 작은 분자의 발견을 가속의 속도가 증가 합니다.

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 애기장대 묘목에 대해 고처리량 순방향 화학 유전학 스크리닝을 수행하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 식물 생리학에 영향을 미치는 새로운 작은 분자를 효율적이고 효과적으로 발견할 수 있습니다. 이러한 발견은 세포벽 합성과 같은 생리학적 과정에 대한 추가 연구의 기초를 제공할 것입니다.이 기술의 주요 장점은 단기간에 수만 개의 작은 분자를 스크리닝할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 모델 식물 종 애기장대(Arabidopsis)를 위해 설계되었지만 곤충, 미생물 또는 세포 배양과 같은 다른 유기체에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜에 대한 아이디어는 대학의 게놈 센터(genomic center)가 잉여 액체 처리 로봇을 위한 보금자리를 찾아야 한다는 것을 알았을 때 처음 떠올랐습니다.우리는 즉시 그들의 손에서 그것을 빼앗겠다고 자원했습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 희석 라이브러리와 Multichannel Tip Wash Automated Labware Positioner 또는 ALP를 준비합니다. 스태커 캐러셀에 부착된 Stacker 10s를 수동으로 로드합니다.호텔 A부터 D까지 먼저 AP96 P20 파이펫 팁 한 상자를 룸 1에 로드합니다. 그런 다음 2호실에서 5호실에 4개의 96웰 V-바닥 플레이트를 로드하고 주문한 라이브러리의 재고 농도를 포함하는 2개의 상단 플레이트와 다른 2개의 하단 플레이트는 비어 있습니다. 또한 AP96 P20 파이펫 팁 한 상자를 Room Six에 로드합니다.7호실에서 9호실까지 4개의 96웰 V-바닥 플레이트를 로드하며, 2개의 상단 플레이트에는 주문된 라이브러리의 재고 농도가 포함되어 있고 2개의 하단 플레이트는 비어 있습니다. P3의 저장통에 300ml의 물, P7의 300ml 70% 에탄올 수조, Tip Loader ALP 및 다중 채널 Tip Wash ALP로 데크를 설정합니다. 액체 처리 로봇의 작동 소프트웨어를 사용하여 Stacker 10의 AP96 P20 피펫 팁을 제시하고 Tip Loader ALP로 이동합니다.호텔 A의 2호실을 제시하고 갑판에 있는 4개의 96웰 V-바닥 플레이트를 모두 분리하여 하단 2개는 P4 및 P8에, 상단 2개는 P5 및 P9에 배치합니다. Tip Loader ALP를 사용하여 AP96 P20 피펫 팁을 96채널 200마이크로리터 헤드에 로드합니다. 300ml 물통에서 90마이크로리터를 흡입하고 P4의 96웰 V-바닥 희석 플레이트에 분배합니다. P8의 플레이트에 대해 단계를 반복합니다. 15마이크로리터를 3회 흡입 및 분주를 반복하여 P5의 화학 라이브러리 플레이트를 혼합합니다. 또한 P5의 화학 라이브러리 플레이트에서 10마이크로리터를 흡입하고 P4의 희석 플레이트에 10마이크로리터를 분배합니다. P4에서 플레이트의 용액을 50마이크로리터를 총 3회 흡입 및 분주를 반복하여 혼합합니다.혼합이 완료되면 P7에서 70마이크로리터의 70% 에탄올을 흡입 및 분주하여 AP96 P20 피펫 팁을 세척한 다음 110% 부피의 물을 4회 흡입 및 분주하여 Multichannel Tip Wash ALP에서 세척합니다. P8 및 P9의 두 번째 플레이트 쌍에 대해 이 단계를 반복합니다. 두 번째 96웰 V-바닥 희석판을 만들 때 P9, P5, P8 및 P4 플레이트를 아래에서 위로 순서대로 쌓습니다. 그런 다음 하나의 빈 정적 ALP에 스택을 배치합니다.P1, P2, P6, P10, P11, P12 또는 P13을 사용합니다. 호텔 A의 5호실이 비워질 때까지 이 단계를 반복한 다음, 6호실에 도착하면 프로세스를 다시 시작하여 새 AP96 P20 파이펫 팁을 팁 로더 ALP로 옮기고 사용된 AP96 P20 파이펫 팁을 빈 정적 ALP에 놓습니다. 호텔 A의 9호실이 비어있을 때까지 절차를 반복합니다.호텔 B로 진행하려면 갑판의 플레이트와 팁을 호텔 A에 다시 로드해야 합니다. 로봇은 감독 없이 작업할 수 있지만 각 희석 주기 후에 물통을 다시 채워야 합니다. 물이 부족한 상태에서 사이클이 다시 시작되면 로봇은 공기를 흡입하고 화학 물질은 희석되지 않습니다. 300ml 물통을 수동으로 다시 채웁니다.컴퓨터 프로그램은 이 메시지를 자세히 설명하는 일시 중지를 통합하여 사용자가 다음 단계를 수행하기 전에 계속을 누르도록 요구할 수 있습니다. 나머지 3개 호텔에 대해 희석 단계를 반복합니다. 100밀리리터당 0.1g의 밀도로 미디어에 씨앗을 수동으로 추가합니다.이 밀도는 96웰 플레이트의 웰당 평균 3-10개의 씨앗을 생성합니다. 호텔 A의 객실 1과 2에 4 개의 96 웰 평평한 바닥 플레이트를 수동으로 놓습니다.팁 로더 ALP에 AP96 P250 피펫 팁 상자, P3에 미디어 시드 혼합물로 채워진 300 밀리리터 저장소, P7에 70 % 에탄올로 채워진 300 밀리리터 저장소를 놓습니다. 운영 소프트웨어를 사용하여 호텔 A에 객실 1과 2를 제시하고 4개의 접시 스택을 분리합니다. 비어 있는 고정식 ALP 각각에 하나의 플레이트를 놓고 96채널 250마이크로리터 헤드에 AP96 P200 피펫 팁을 로드합니다.P3의 300ml 매체 시드 저장소에서 90마이크로리터를 흡입하고 첫 번째 96웰 플랫 바닥 플레이트에 분배합니다. 8개의 플레이트에 모두 미디어-시드 혼합물이 포함될 때까지 이 과정을 반복합니다. P70에서 70% 에탄올로 채워진 300ml 용기에서 70마이크로리터를 흡입하고 분주하여 AP96 P250 피펫 팁을 세척합니다. 110% 부피의 물을 4회 흡입 및 분주하여 Multichannel Tip Wash ALP에서 팁을 세척한 다음 TL1에서 팁을 언로드합니다.마지막으로 접시를 손으로 모으십시오. AP96 P250 피펫 팁 상자를 호텔 A의 1호실에 수동으로 로드합니다.또한 2개의 96웰 V-bottom 희석 라이브러리 플레이트를 2호실, 4호실, 6호실, 8호실에 로드합니다. 2개의 96웰 평평한 바닥 스크리닝 플레이트를 룸 3, 5, 7 및 9에 로드합니다.운영 소프트웨어를 사용하여 P7에서 300밀리리터의 70% 에탄올 세척 저장소를 포함하도록 데크를 구성합니다. 미디어 시드 저장소는 P3의 데크에 남겨 둘 수 있습니다. 또한 장치 컨트롤러의 콘솔 드라이브 스루 연결을 켜서 Multichannel Tip Wash ALP를 통해 물을 순환시킵니다. 프로토콜이 끝나면 자동으로 꺼집니다. 호텔 A의 AP96 P250 피펫 팁 상자를 제시하고 팁 로더 ALP로 옮깁니다.다음으로, 호텔 A의 2호실에서 96웰 V-바닥 희석 라이브러리 플레이트를 데크로 제시합니다. 정적 ALP P4에 하나의 플레이트를 놓고 P8에 하나의 플레이트를 놓습니다. 그런 다음 호텔 A의 3 호실에서 96 웰의 평평한 바닥 선별 플레이트를 갑판으로 제시합니다. 정적 ALP P5에 플레이트 하나를, P9에 플레이트 하나를 놓습니다. Tip Loader ALP를 사용하여 AP96 P250 피펫 팁을 96채널 200마이크로리터 헤드에 로드합니다.50마이크로리터를 3회 흡입 및 분주하여 P4의 96웰 V-바닥 희석 플레이트를 혼합합니다. 그런 다음 이 플레이트에서 10마이크로리터를 흡입하고 P5의 96웰 평평한 바닥 스크리닝 플레이트에 분배합니다. P5에서 플레이트의 용액을 50마이크로리터를 세 번 흡입하고 분주하여 혼합합니다. P7의 저장소에서 70마이크로리터의 70% 에탄올을 흡입하고 분주하여 AP96 P250 피펫 팁을 에탄올로 세척합니다. 그런 다음 110% 부피의 물을 4회 흡입하고 분배하여 Multichannel Tip Wash ALP의 팁을 세척합니다.두 번째 96웰 V-바닥 희석 라이브러리 플레이트와 96웰 평면 바닥 스크리닝 플레이트에 대해 이 단계를 반복합니다. 두 개의 96웰 V-바닥 희석 라이브러리 플레이트를 함께 쌓고 두 개의 96웰 평평한 바닥 스크리닝 플레이트를 함께 쌓습니다. 플레이트를 정적 ALP로 이동합니다.그런 다음 이 과정을 세 번 반복하여 희석된 화학 물질을 스크리닝 플레이트에 총 8회 추가합니다. 마지막으로, 육안 확인을 통해 스크리닝 플레이트의 각 웰에 있는 종자 수를 확인합니다. 살균 및 vernalized 종자를 추가하여 3 개 미만의 씨앗으로 우물을 보충하십시오.묘목이 자라는 매체가 마르지 않도록하는 것이 중요합니다., 이는 발아를 떨어 뜨리기 때문입니다. 묘목이 들어있는 접시는 습도가 높거나 건조에 강한 용기에 보관해야합니다. 96웰 바닥이 평평한 스크리닝 플레이트를 섭씨 22도의 환경 챔버에서 16/8 라이트/다크 주기로 건조 방지 용기에 4일 동안 배양합니다.해부 현미경으로 바닥이 평평한 96웰 스크리닝 플레이트를 시각화하고 추가 조사를 위해 모든 비정상적인 표현형을 기록합니다. 정상 및 이상 표현형의 예로는 눈에 보이는 형태학적 이상 없음, 갈색 뿌리 털, 발육 부진, 심하게 발육 부진, 탈색, 녹색 점액질, 불완전한 발아 및 발아 없음이 있습니다. 백분율별로 표시되는 표현형이 파이 차트에 표시됩니다.묘목은 뿌리 형태, 색소 침착, 뿌리 털 및 발아에 이상을 보였습니다. 또한 녹색 점액질의 생산을 포함하는 다양한 다른 것들이 포함되어 있습니다. 이 기술을 완전히 익히면 대형 전방 화학 유전자 스크리닝의 효율성과 정확성을 크게 높일 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 종자를 멸균 및 버날화하고, 희석 단계 중에 물통을 다시 채우고, 샘플이 건조 방지 용기에 보관되었는지 확인하고, 모든 이미징이 평평한 바닥 플레이트에서 수행되는지 확인하는 것이 중요합니다. 조사하고자 하는 생리학적 과정에 따라 이 초기 검사에 추가 분석을 통해 각 화학 물질의 작용 모드를 결정할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 액체 처리 로봇을 사용하여 화학적 유전자 스크리닝의 효율성과 정확성을 향상시키는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

optimizing-use-liquid-handling-robot-to-conduct-high-throughput

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 소개, 추적 및 식물 세포에서 GFP의 표현의 정량 분석​​에 대한 방법을보고합니다. 이 방법은 시간이 지남에 샘플을 다수의 세미 연속 이미지 수집을위한 맞춤 설계된 로봇 시스템을 사용합니다. 우리는 또한 이미지 시리즈의 분석 ImageJ와 ImageReady의 사용을 보여줍니다.

로보틱스 및 식물 조직에서 유전자 발현의 연구 동적 이미지 분석

의 액체 기반 culturing 및 분배를위한...

형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

심사 양적, 높은 처리량의 표현과 소규모 대장균 문화의 융합 단백질의 분석 정화하기위한 프로토콜을 설명하고 이황화 풍부한 동물 독의 표적 단백질의 발현에 적용됩니다.

에서 생산 재조합 이황화 풍부한 독 단백질에 적용되는 높은 처리량 정량 식 검사 및 정화<em&gt; E. 대장균</em

여기에서는 세포 기반 리포터 유전자 분석을 3' UTR을 통해 발휘되는 전사 후 제어 메커니즘을 조절하는 화합물에 대한 화학 라이브러리를 스크리닝하는 유용한 도구로 설명합니다.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

높은 처리량, 자동화, 담배 원형질체 생산 및 변환 방법이 설명되어 있습니다. 로봇 시스템이 아닌 모델 작물로 번역해야한다 모델 BY-2 시스템에 대규모 병렬 유전자 발현 및 검색 할 수 있습니다.

높은 처리량 원형질체 분리 및 변환을위한 로봇 플랫폼

여기, 모듈형 DNA "장치" 어셈블리 액체 처리 로봇에 모듈형 복제 DNA 어셈블리 메서드를 사용 하 여 수행 하는 자동화 된 워크플로 제공 됩니다. 프로토콜 조합 DNA 장치 라이브러리 생성, 우리는 두 액체 처리 플랫폼을 사용 하 여 설명 하는 액체 처리기 선택 목록 생성 하기 위한 소프트웨어 도구를 사용 합니다.

모듈형 DNA 장치 조립 로봇 액체 처리 자동화

여기 우리는 빠르게 잘 당 Caenorhhabditis 선 충 의 일관 된 번호 96 잘 문화 접시 선 충 성장 미디어 agar의 수백을 생산에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 문화는 전체 생물의 phenotypic 심사에 대 한 유용 합니다. 우리는 여기 화면 화학 물질에 이러한 culture를 사용 하 여 프로 장 수 효과 초점.

꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

아라비도프스탈리아나(Arabidopsis) 종자의 표면 살균을 위한 고처리량 프로토콜이 제공되어 진공 펌프로 구성된 간단한 흡입 장치로 액체 처리 단계를 최적화합니다. 수백 개의 종자 시료는 하루에 표면 살균될 수 있습니다.

애기장염 씨앗의 표면 살균을 위한 높은 처리량, 견고하고 매우 시간 유연한 방법

이 프로토콜은 자동화 지원 유전자 라이브러리 생성 및 평가를 통해 유전적으로 인코딩된 바이오센서의 체계적인 글로벌 최적화 방법을 제공합니다. 이는 실험을 간소화하고 유전적 구성 요소를 선택하여 바이오센서를 특정 설계 결과에 맞게 조정할 수 있도록 하는 실험 설계 방법론과 결합됩니다.

실험 설계 및 자동화 워크플로우를 통해 유전적으로 인코딩된 바이오센서 설계 공간의 효율적인 샘플링

이 프로토콜은 산업 미생물을 위한 표준 고처리량 스크리닝 워크플로우를 제공합니다. 이 과정은 ARTP 돌연변이 유발을 통해 돌연변이 라이브러리를 구축하고, 자동화된 마이크로플루이딕스를 이용한 양성 액상 스크리닝을 수행하며, 이후 결과를 검증하는 과정을 포함합니다. 이 워크플로우의 신뢰성은 고수율 B. coagulans 균주를 스크리닝하여 검증되었습니다.

자동 액상 마이크로플루이딕 플랫폼을 이용한 L-락산을 과생산하는 바실루스 응고 체 돌연변이체의 고처리량 스크리닝

배우세요 액체 처리 로봇을 활용한 Arabidopsis thaliana 고처리량 화학 유전학 스크리닝 방법으로 식물 생리에 영향을 주는 신규 소분자 화합물을 효율적으로 발굴하는 기술입니다.

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