높은 처리량 앞으로 화학 유전학의 화면 애기 thaliana 을 액체 처리 로봇의 사용을 최적화

이 프로토콜의 전반적인 목표는 애기장대 묘목에 대해 고처리량 순방향 화학 유전학 스크리닝을 수행하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 식물 생리학에 영향을 미치는 새로운 작은 분자를 효율적이고 효과적으로 발견할 수 있습니다. 이러한 발견은 세포벽 합성과 같은 생리학적 과정에 대한 추가 연구의 기초를 제공할 것입니다.

이 기술의 주요 장점은 단기간에 수만 개의 작은 분자를 스크리닝할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 모델 식물 종 애기장대(Arabidopsis)를 위해 설계되었지만 곤충, 미생물 또는 세포 배양과 같은 다른 유기체에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜에 대한 아이디어는 대학의 게놈 센터(genomic center)가 잉여 액체 처리 로봇을 위한 보금자리를 찾아야 한다는 것을 알았을 때 처음 떠올랐습니다.

우리는 즉시 그들의 손에서 그것을 빼앗겠다고 자원했습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 희석 라이브러리와 Multichannel Tip Wash Automated Labware Positioner 또는 ALP를 준비합니다. 스태커 캐러셀에 부착된 Stacker 10s를 수동으로 로드합니다.

호텔 A부터 D까지 먼저 AP96 P20 파이펫 팁 한 상자를 룸 1에 로드합니다. 그런 다음 2호실에서 5호실에 4개의 96웰 V-바닥 플레이트를 로드하고 주문한 라이브러리의 재고 농도를 포함하는 2개의 상단 플레이트와 다른 2개의 하단 플레이트는 비어 있습니다. 또한 AP96 P20 파이펫 팁 한 상자를 Room Six에 로드합니다.

7호실에서 9호실까지 4개의 96웰 V-바닥 플레이트를 로드하며, 2개의 상단 플레이트에는 주문된 라이브러리의 재고 농도가 포함되어 있고 2개의 하단 플레이트는 비어 있습니다. P3의 저장통에 300ml의 물, P7의 300ml 70% 에탄올 수조, Tip Loader ALP 및 다중 채널 Tip Wash ALP로 데크를 설정합니다. 액체 처리 로봇의 작동 소프트웨어를 사용하여 Stacker 10의 AP96 P20 피펫 팁을 제시하고 Tip Loader ALP로 이동합니다.

호텔 A의 2호실을 제시하고 갑판에 있는 4개의 96웰 V-바닥 플레이트를 모두 분리하여 하단 2개는 P4 및 P8에, 상단 2개는 P5 및 P9에 배치합니다. Tip Loader ALP를 사용하여 AP96 P20 피펫 팁을 96채널 200마이크로리터 헤드에 로드합니다. 300ml 물통에서 90마이크로리터를 흡입하고 P4의 96웰 V-바닥 희석 플레이트에 분배합니다. P8의 플레이트에 대해 단계를 반복합니다. 15마이크로리터를 3회 흡입 및 분주를 반복하여 P5의 화학 라이브러리 플레이트를 혼합합니다. 또한 P5의 화학 라이브러리 플레이트에서 10마이크로리터를 흡입하고 P4의 희석 플레이트에 10마이크로리터를 분배합니다. P4에서 플레이트의 용액을 50마이크로리터를 총 3회 흡입 및 분주를 반복하여 혼합합니다.

혼합이 완료되면 P7에서 70마이크로리터의 70% 에탄올을 흡입 및 분주하여 AP96 P20 피펫 팁을 세척한 다음 110% 부피의 물을 4회 흡입 및 분주하여 Multichannel Tip Wash ALP에서 세척합니다. P8 및 P9의 두 번째 플레이트 쌍에 대해 이 단계를 반복합니다. 두 번째 96웰 V-바닥 희석판을 만들 때 P9, P5, P8 및 P4 플레이트를 아래에서 위로 순서대로 쌓습니다. 그런 다음 하나의 빈 정적 ALP에 스택을 배치합니다.

P1, P2, P6, P10, P11, P12 또는 P13을 사용합니다. 호텔 A의 5호실이 비워질 때까지 이 단계를 반복한 다음, 6호실에 도착하면 프로세스를 다시 시작하여 새 AP96 P20 파이펫 팁을 팁 로더 ALP로 옮기고 사용된 AP96 P20 파이펫 팁을 빈 정적 ALP에 놓습니다. 호텔 A의 9호실이 비어있을 때까지 절차를 반복합니다.

호텔 B로 진행하려면 갑판의 플레이트와 팁을 호텔 A에 다시 로드해야 합니다. 로봇은 감독 없이 작업할 수 있지만 각 희석 주기 후에 물통을 다시 채워야 합니다. 물이 부족한 상태에서 사이클이 다시 시작되면 로봇은 공기를 흡입하고 화학 물질은 희석되지 않습니다. 300ml 물통을 수동으로 다시 채웁니다.

컴퓨터 프로그램은 이 메시지를 자세히 설명하는 일시 중지를 통합하여 사용자가 다음 단계를 수행하기 전에 계속을 누르도록 요구할 수 있습니다. 나머지 3개 호텔에 대해 희석 단계를 반복합니다. 100밀리리터당 0.1g의 밀도로 미디어에 씨앗을 수동으로 추가합니다.

이 밀도는 96웰 플레이트의 웰당 평균 3-10개의 씨앗을 생성합니다. 호텔 A의 객실 1과 2에 4 개의 96 웰 평평한 바닥 플레이트를 수동으로 놓습니다.팁 로더 ALP에 AP96 P250 피펫 팁 상자, P3에 미디어 시드 혼합물로 채워진 300 밀리리터 저장소, P7에 70 % 에탄올로 채워진 300 밀리리터 저장소를 놓습니다. 운영 소프트웨어를 사용하여 호텔 A에 객실 1과 2를 제시하고 4개의 접시 스택을 분리합니다. 비어 있는 고정식 ALP 각각에 하나의 플레이트를 놓고 96채널 250마이크로리터 헤드에 AP96 P200 피펫 팁을 로드합니다.

P3의 300ml 매체 시드 저장소에서 90마이크로리터를 흡입하고 첫 번째 96웰 플랫 바닥 플레이트에 분배합니다. 8개의 플레이트에 모두 미디어-시드 혼합물이 포함될 때까지 이 과정을 반복합니다. P70에서 70% 에탄올로 채워진 300ml 용기에서 70마이크로리터를 흡입하고 분주하여 AP96 P250 피펫 팁을 세척합니다. 110% 부피의 물을 4회 흡입 및 분주하여 Multichannel Tip Wash ALP에서 팁을 세척한 다음 TL1에서 팁을 언로드합니다.

마지막으로 접시를 손으로 모으십시오. AP96 P250 피펫 팁 상자를 호텔 A의 1호실에 수동으로 로드합니다.또한 2개의 96웰 V-bottom 희석 라이브러리 플레이트를 2호실, 4호실, 6호실, 8호실에 로드합니다. 2개의 96웰 평평한 바닥 스크리닝 플레이트를 룸 3, 5, 7 및 9에 로드합니다.

운영 소프트웨어를 사용하여 P7에서 300밀리리터의 70% 에탄올 세척 저장소를 포함하도록 데크를 구성합니다. 미디어 시드 저장소는 P3의 데크에 남겨 둘 수 있습니다. 또한 장치 컨트롤러의 콘솔 드라이브 스루 연결을 켜서 Multichannel Tip Wash ALP를 통해 물을 순환시킵니다. 프로토콜이 끝나면 자동으로 꺼집니다. 호텔 A의 AP96 P250 피펫 팁 상자를 제시하고 팁 로더 ALP로 옮깁니다.

다음으로, 호텔 A의 2호실에서 96웰 V-바닥 희석 라이브러리 플레이트를 데크로 제시합니다. 정적 ALP P4에 하나의 플레이트를 놓고 P8에 하나의 플레이트를 놓습니다. 그런 다음 호텔 A의 3 호실에서 96 웰의 평평한 바닥 선별 플레이트를 갑판으로 제시합니다. 정적 ALP P5에 플레이트 하나를, P9에 플레이트 하나를 놓습니다. Tip Loader ALP를 사용하여 AP96 P250 피펫 팁을 96채널 200마이크로리터 헤드에 로드합니다.

50마이크로리터를 3회 흡입 및 분주하여 P4의 96웰 V-바닥 희석 플레이트를 혼합합니다. 그런 다음 이 플레이트에서 10마이크로리터를 흡입하고 P5의 96웰 평평한 바닥 스크리닝 플레이트에 분배합니다. P5에서 플레이트의 용액을 50마이크로리터를 세 번 흡입하고 분주하여 혼합합니다. P7의 저장소에서 70마이크로리터의 70% 에탄올을 흡입하고 분주하여 AP96 P250 피펫 팁을 에탄올로 세척합니다. 그런 다음 110% 부피의 물을 4회 흡입하고 분배하여 Multichannel Tip Wash ALP의 팁을 세척합니다.

두 번째 96웰 V-바닥 희석 라이브러리 플레이트와 96웰 평면 바닥 스크리닝 플레이트에 대해 이 단계를 반복합니다. 두 개의 96웰 V-바닥 희석 라이브러리 플레이트를 함께 쌓고 두 개의 96웰 평평한 바닥 스크리닝 플레이트를 함께 쌓습니다. 플레이트를 정적 ALP로 이동합니다.

그런 다음 이 과정을 세 번 반복하여 희석된 화학 물질을 스크리닝 플레이트에 총 8회 추가합니다. 마지막으로, 육안 확인을 통해 스크리닝 플레이트의 각 웰에 있는 종자 수를 확인합니다. 살균 및 vernalized 종자를 추가하여 3 개 미만의 씨앗으로 우물을 보충하십시오.

묘목이 자라는 매체가 마르지 않도록하는 것이 중요합니다., 이는 발아를 떨어 뜨리기 때문입니다. 묘목이 들어있는 접시는 습도가 높거나 건조에 강한 용기에 보관해야합니다. 96웰 바닥이 평평한 스크리닝 플레이트를 섭씨 22도의 환경 챔버에서 16/8 라이트/다크 주기로 건조 방지 용기에 4일 동안 배양합니다.

해부 현미경으로 바닥이 평평한 96웰 스크리닝 플레이트를 시각화하고 추가 조사를 위해 모든 비정상적인 표현형을 기록합니다. 정상 및 이상 표현형의 예로는 눈에 보이는 형태학적 이상 없음, 갈색 뿌리 털, 발육 부진, 심하게 발육 부진, 탈색, 녹색 점액질, 불완전한 발아 및 발아 없음이 있습니다. 백분율별로 표시되는 표현형이 파이 차트에 표시됩니다.

묘목은 뿌리 형태, 색소 침착, 뿌리 털 및 발아에 이상을 보였습니다. 또한 녹색 점액질의 생산을 포함하는 다양한 다른 것들이 포함되어 있습니다. 이 기술을 완전히 익히면 대형 전방 화학 유전자 스크리닝의 효율성과 정확성을 크게 높일 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 종자를 멸균 및 버날화하고, 희석 단계 중에 물통을 다시 채우고, 샘플이 건조 방지 용기에 보관되었는지 확인하고, 모든 이미징이 평평한 바닥 플레이트에서 수행되는지 확인하는 것이 중요합니다. 조사하고자 하는 생리학적 과정에 따라 이 초기 검사에 추가 분석을 통해 각 화학 물질의 작용 모드를 결정할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 액체 처리 로봇을 사용하여 화학적 유전자 스크리닝의 효율성과 정확성을 향상시키는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.