실험 설계 및 자동화 워크플로우를 통해 유전적으로 인코딩된 바이오센서 설계 공간의 효율적인 샘플링

생명공학 응용을 위한 바이오센서의 개발 및 최적화는 우리 연구의 범위입니다. 특히, 우리는 유전적 요소의 조절을 통해 바이오센서를 최적화하고 엔지니어링하는 방법을 이해하는 것을 목표로 합니다. 고전적 프로모터 엔지니어링 및 형광 활성화 세포 분류와 같은 직관 기반 설계 선택은 바이오센서의 특성화 및 설계에 일상적으로 적용되는 기술입니다.

실험 계획 방법론은 아직 유전자 회로 설계에 널리 채택되지 않았습니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 유전자 회로 및 바이오센서 설계에서 이러한 유형의 기술 활용을 늘리고자 합니다. 시작하려면 이론적인 라이브러리 크기를 결정하고 95% 이상의 라이브러리 커버리지를 보장하는 데 필요한 개별 변이체의 수를 계산합니다.

스크리닝할 콜로니의 수에 따라 항생제가 보충된 용원성 국물 배지의 필요한 양을 계산합니다. 액체 처리기 소프트웨어를 열고 MTP 액체 이송 프로그램 옆에 있는 실행을 클릭합니다. 준비된 미디어를 해당 저장소 위치에 놓습니다.

그런 다음 레이아웃에 따라 빈 마이크로타이터 플레이트로 데크를 채웁니다. 200마이크로리터의 배지를 분배하도록 프로그램을 설정합니다. 딸깍 하는 소리 확인을 클릭하여 프로그램 시작을 확인합니다.

이제 채워진 마이크로타이터 플레이트 웰을 콜로니 피커 플랫폼으로 옮기고 플라스미드 변이 라이브러리 DNA로 형질전환된 슈도모나스 푸티다의 사각 오거 플레이트를 밀봉을 풀고 콜로니 피커 플랫폼으로 옮깁니다. 콜로니 피커를 사용하여 형질전환 플레이트의 단일 콜로니로 미리 채워진 각 웰을 접종합니다. 접종된 플레이트를 다시 밀봉하고 오프라인 진영 인큐베이터로 옮깁니다.

배양 후 성장한 플레이트를 액체 처리기 플랫폼으로 되돌리고 밀봉을 풉니다. MTP에 글리세롤 추가 프로토콜 옆에 있는 실행을 클릭합니다. 화면의 플레이트 레이아웃이 리퀴드 핸들러 도크의 플레이트 레이아웃과 일치하는지 확인합니다.

그리고 순차적으로 확인을 클릭하여 프로토콜을 실행합니다. 완료되면 플레이트를 밀봉하고 오프라인 진과 인큐베이터에서 분당 800회전으로 5분 동안 잠시 혼합합니다. 접시에 바코드를 붙이고 필요할 때까지 섭씨 80도에서 보관합니다.

딥웰 블록에 필요한 항생제 보충 배지의 양을 계산합니다. DWB 액체 이송 프로그램 옆에 있는 실행을 클릭합니다. 미디어가 올바른 저장소에 추가되었는지 확인하십시오.

빈 딥 웰 블록은 올바른 레이아웃 위치에 있으며 적절한 팁 공급이 가능합니다. 495마이크로리터의 배지를 분배하도록 프로그램을 설정합니다. 준비가 되면 확인을 순차적으로 클릭하여 프로그램을 시작합니다.

이제 채워진 깊은 우물 블록을 통기성 멤브레인으로 밀봉하고 섭씨 4도에서 임시 보관소로 옮깁니다. 그런 다음 해동된 MTP 프로그램에서 접종 옆에 있는 실행을 클릭합니다. MTP 극저온 스톡과 딥 웰 채우기 블록이 레이아웃에 따라 플랫폼으로 옮겨지고 충분한 팁이 적재되었는지 확인하십시오.

순차적으로 확인을 클릭하여 초기화합니다. 프로그램이 끝나면 접종한 하룻밤 깊은 우물 블록을 통기성 멤브레인으로 밀봉합니다. 섭씨 30도, 분당 800회전, 습도 75%에서 16시간 동안 설정된 오프라인 플레이트 셰이커 인큐베이터로 옮깁니다.

cryostock 마이크로타이터 플레이트를 다시 밀봉하고 혼합한 후 섭씨 80도의 냉동고로 되돌립니다. 이제 스크리닝할 하룻밤 딥 웰 블록에 대해 다양한 이펙터 및 항생제 농도로 보충된 배지의 필요한 양을 계산합니다. DWB 액체 이송 프로그램 옆에 있는 실행을 클릭합니다.

그런 다음 이펙터가 보충된 배지 저장소가 올바르게 배치되었는지 확인합니다. 빈 딥 웰 블록을 액체 처리기 플랫폼에 추가합니다. 충분한 팁을 사용할 수 있는 경우 확인을 순차적으로 클릭하여 프로토콜을 시작하여 분석 딥웰 블록을 생성합니다.

충전 후 통기성 멤브레인으로 분석 딥웰 블록을 밀봉합니다. 액체 처리기를 빈 접시로 다시 채우십시오. 모든 분석 블록이 채워질 때까지 접종을 반복합니다.

그런 다음 DWB 프로그램 분석 옆에 있는 실행을 클릭합니다. 이펙터 보충 배지가 있는 밀봉되지 않은 분석 딥웰 블록이 올바르게 배치된 후, 레이아웃에 따라 성장한 P.putida가 포함된 하룻밤 딥웰 블록을 옮기고 밀봉을 풉니다. 확인을 순차적으로 클릭하여 프로토콜을 시작합니다.

프로그램이 완료되면 분석 플레이트를 오프라인 인큐베이터로 밀봉합니다. 접종 후 하룻밤 깊은 우물 블록을 폐기하십시오. 다음으로, 깊은 우물 블록을 원심분리기로 옮깁니다.

4, 000G의 펠릿 세포를 섭씨 18도의 얼음 제어 로터에서 5분 동안 펠릿화합니다. 상청액을 버린 후 원심분리기 블록을 액체 처리기 플랫폼에 놓습니다. 스크리닝할 딥웰 블록의 수를 기준으로 필요한 PBS의 1배의 부피를 계산합니다.

분석 설정 PBS 재현탁 DWB 프로그램 옆에 있는 실행을 클릭하고 분배량을 500마이크로리터로 설정합니다. 그런 다음 PBS가 올바른 저장소에 추가되었는지 확인하고 레이아웃에 따라 원심분리된 플레이트를 배열합니다. 확인을 클릭하여 팁 가용성을 확인한 후 프로그램을 시작합니다.

액체 처리기에서 재현탁된 딥 웰 블록을 다시 밀봉하고 제거합니다. 플레이트의 밑면을 확인하여 펠릿이 완전히 재현탁되었는지 확인하십시오. 분석 설정 셀 및 PBS 에디션 MTP 프로그램 옆에 있는 실행을 클릭합니다.

그런 다음 재현탁된 딥 웰 블록을 레이아웃에 따라 액체 처리기로 옮깁니다. 레이아웃에 따라 빈 마이크로타이터 플레이트를 로드하고 확인을 클릭하기 전에 디스펜스 용량을 200마이크로리터로 설정합니다. 채워진 마이크로타이터 플레이트를 오프라인 다중 모드 플레이트 리더로 옮기고 상대 형광 및 OD600을 측정합니다.

5, 000개의 프로모터 변이체에 대한 자동 스크리닝은 3.6배 이상의 활성화를 나타내는 상위 후보를 식별했습니다. 100개의 고유한 변이에 대한 EC 50 값을 표시하여 민감도 분포를 시각화하고 강력한 후보를 식별했습니다. EC 50 값은 226개의 강화된 변이에 대해 계산되었고 Lin-log 변환을 사용하여 순위를 매겨 민감도 스케일 라이브러리를 형성했습니다.

최종 스크리닝 설계는 4개 모듈의 1, 0 및 1 수준 분산을 사용하여 구성되었습니다. 수송, 조절자, P-out 및 출력 리보솜 결합 부위 모델 프로파일은 4개 모듈의 발현 수준의 변화가 EC 50 및 Hill의 계수에 비선형적으로 어떤 영향을 미치는지 보여주었습니다. RBS-Out으로 최적의 발현 조합을 식별하여 민감도와 기울기 모두에 강력한 긍정적 효과를 보여줍니다.

이상적인 모듈 강도를 통합한 전 세계적으로 최적화된 바이오센서 변형은 부모 및 DSD 최적화 버전에 비해 향상된 감도와 힐 계수를 보여주었습니다.