Name: 에서 시냅틱 후보의 Channelrhodopsin2 중재 자극 Drosophila 신경근육학 분기점 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 배우세요 Drosophila 유충 신경근육학 분기점에서 Channelrhodopsin2를 이용한 빛 자극으로 시냅스 전위를 유발하는 방법. 이 비침습적 기법은 흡입 전극 자극보다 저렴하고 간편하며 신경과학 연구 및 교육에 활용됩니다.

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이 작품은 LC 그리피스 건강 보조금 RO1GM - 33205와 MH - 067284 국립 연구소에 의해 그리고 NJ Hornstein에 브랜다 이스 대학 섬머 스쿨 학부 연구 장학 지원했다. 우즈 홀, MA에서이 기법에 대한 예비 실험은 2008 년 신경 시스템 및 행동 여름 코스 (R25 MH059472 NIMH 부여)의 일환으로 해양 생물학 연구소에서 수행되었다.

1 부 : 동물 관리 및 유전 십자가 <ol><li> UAS - ChR2 및 표준 비행 미디어 8을 포함하는 별도의 병의 OK371 - GAL4 플라이 라인 유지합니다. </li><li> OK371 - GAL4 플라이 라인과 UAS - ChR2 라인의 남성의 처녀를 수집합니다. </li><li> 1 ㎜ 모든 트랜스 망막 (ATR)과 혼합 표준 플라이 미디어가 들어있는 유리병에 남성과 여성 모두를 넣어. ATR 음식은 ~ 1 분간 전자렌지에 처음으로 용해 정기 비행 미디어로하여야한다. 일단 녹아, 1 분 30 초 동안 냉각 후 비행 미디어의 매 10 ML 100 %의 ETOH에서 ATR 100 MM 100 μl를 추가할 수 있습니다. 얼음 플레이스 튜브, 그때 4 어두운 영역에 저장 ° C.를 </li><li> 파리의 친구를하자 22-25에서 어두운 지역에서 계란 ° C.를하다 </li><li> 셋째 instar의 유충을 볼 때까지 3~4일 기다려, 그 시점에서 파리 성충 처분. </li></ol> 2 부 : 릭 설정 <ol><li> 블루 LED 어떤 10X 해부 범위 눈 조각 (우리의 경우, 칼 자이스 혈구 주식 회사, www.zeiss.com, 손우드, NY에서), 히트 싱크와 광원 (토르 연구소, www.thorlabs.com, 뉴턴, 뉴저지를 연결합니다 ). 게시하고 클램프와 자기 기지에 연결합니다. 광원에 의해 생성된 전기 노이즈를 줄이기 위해 전기 접지 방패로 히트 싱크를 커버. </li><li> 전기 생리학 장비의 공기 테이블에서 광원과 장소 자석 기지. </li><li> 회로를 제어 및 외부 전압 소스 (Powerlab 30분의 4, ADInstruments, www.adinstruments.com, 콜로라도 스프링스, CO)에 제어 회로를 연결하는 광원을 연결합니다. </li><li> 푸른 불빛을 활성화하기 위해 회로를 제어하기 1-5 V의 펄스를 제공합니다. </li><li> 마그네틱베이스와 광원 블루 라이트 빔은 애벌레 절개로 점유하는 영역에 초점을 맞춘까지를 조정합니다. </li></ol> 파트 3 : 해부 <ol><li> sylgard - 줄지어 접시의 바닥에 6 ~ 0.1 mm 곤충 핀. </li><li> 페트리 - 요리에 플라스틱으로 식품 미디어 및 장소에서 3 차 instar의 애벌레를 제거합니다. </li><li> 음식을 제거하는 호수와 애벌레를 씻어. </li><li> 플레이스 뽑아 핀 근처에 요리를 해부에 애벌레와 ½ 수준으로 살린 추가할 수 있습니다. </li><li> 당신은 동물의 등의 표면을 따라 실행이 은빛 튜브 (기관)을 볼 수 있도록 동양 애벌레. </li><li> tracheal 튜브 사이에있는 꼬리에 직접 큰 핀을 삽입합니다. 애벌레를 누른 상태의 머리에 두 번째 큰 핀을 장소, 길이 시체를 밖으로 스트레칭해야되고. </li><li> 꼬리 근처에 작은 절개를 확인하고, 신체의 길이를 그것을 계속합니다. 우연히 복부 신경 및 / 또는 신체 벽의 근육을 건드리지 않게으로 가위의 끝을 그렇게 사육되었는지 확인합니다. </li><li> 동물의 네 모퉁이에 플레이스 네 핀 이제 오픈 midsection의. 필릿 동물을 줄 수있는만큼 해부 접시에 그들을 설정합니다. 핀 준비 밖으로 가르쳤다. </li><li> 포셉 및 가위를 사용하여 동물의 내장, 기관 및 지방 기관을 제거하십시오. </li><li> 식염수에 준비를 씻어. </li><li> 이마 엽 (叶) (같은 그림에서 본)와 준비의 복부 신경절을 찾습니다. </li><li> 마이크로 가위를 사용하여, 신중하게 그냥 이마 엽 (叶) 뒤에있는 복부 신경절을 통해 했네요. </li></ol> 부 4 : 근육 녹음과 청색 광 자극 <ol><li> 전자 전극 풀러 (셔터 인 스트 루먼트)를 사용하여 10-20 μω 전극을 당기세요. </li><li> 3 M KCl로 뽑아 전극을 입력합니다. </li><li> 이곳은 전기 생리학 장비에 대한 해부 현미경으로 애벌레 준비 근처 micromanipulator와 전극 홀더 및 기동 전극 팁의 전극을 가득 채웠다. </li><li> 모든 신체 벽 세그먼트 (그림 A)의 근육 6 (M6)를 식별합니다. </li><li> 조심스럽게 M6에 전극을 삽입하고 신속한 hyperpolarization 살펴보십시오. 근육 쉬고 막 잠재력은 -30에서 -70 뮤직 비디오 MV 곳이되어야합니다. </li><li> 해부 준비가 광선에 중심 있도록 푸른 불빛을 조정합니다. </li><li> 회로를 제어하는​​ MS 20-100 전압 펄스를 제공합니다. 점진적으로 회로를 제어하는​​ 공급 전압을 증가시킵니다. 근육 세포 (그림 1B)에 흥분성의 접합을위한 잠재력보세요. </li></ol> 대표 결과 : 그림 1A는 녹화 설정 및 토막 준비의 구조를 보여줍니다. 그림 1B 짧은 광 펄스에 의해 evoked 전형 EJP를 보여줍니다. 그림 EJP 진폭은 신경을 분포시키다 M6 모두 두명의 모터 뉴런의 진폭을 표현입니다. 낮은 조명의 농도 하나의 모터 유닛 (데이터가 표시되지 않음)만을 활성화. <img src="/files/ftp_upload/1133/figure1.png" alt="그림 1" width="600" height="373" /> 그림 1 : 세포 레코딩 장비 및 청색 LED와) 일반 설계도. 뇌 (브라질)은 복부 신경절 (VG)의 리듬 활동을 억제하기 위해 제거됩니다. ChR2은 GAL4 - UAS 시스템을 사용 모터 뉴런에 표시됩니다. M6 근육에서 B) 세포 녹음. 40 MS 블루 라이트 펄스 (127에서 μW / mm 2) 안정 M6 큰 잠재력 시냅스 (별표)를 보여주고 있습니다.

<ol><li>Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545(1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35(2007).</li>
<li>Lagow, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+a+hydrophobic+layer+by+a+point+mutation+in+syntaxin+1A+regulates+the+rate+of+synaptic+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion.</a> PLoS Biol. 5 (4), e72(2007).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279(2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940(2003).</li>
<li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 16 (17), 1741(2006).</li>
<li>Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+neuronal+cell+ablation+in+the+Drosophila+embryo%3A+pathfinding+by+follower+growth+cones+in+the+absence+of+pioneers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers.</a> Neuron. 14 (4), 707(1995).</li>
<li>Ralph Greenspan, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRalph+Greenspan%2C++%22Fly+Pushing%3A+The+Theory+and+Practice+of+Drosophila+Genetics%2C+2nd+ed%22">Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).</li>
</ol>

우리는 공개의 관심 충돌이 없습니다.

중요 단계는 초기 절개와 근육 세포의 입력을 모두 포함하고 있습니다. 초기 절개하는 동안 신경이 절단되거나 근육이 손상된 경우 그것은 실험의 나머지 부분을 계속하기가 어렵습니다. 해부하는 동안, 하나 등 지느러미 절개하는 동안 이상 최대한 가위를 해부 각도 매우 신중해야합니다. 두 번째 중요한 단계 동안, 근육 세포를 입력할 하나는 과거 hyperpolarization ~ 30 뮤직 비디오에 대한 감시해야합니다. -30 MV 위의 값은 전극이 근육 세포 내에서 또는 건강하지 못한 세포에서 제대로도 아니라고 나타냅니다.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862</td><td>&lt;a href="http://www.ellsworth.com" target="_blank"&gt;www.ellsworth.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Minutens Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>&lt;a href="http://www.finescience.com" target="_blank"&gt;www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>해부 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.fishersci.com" target="_blank"&gt;www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Neuroprobe 세포 내 증폭기 및 헤드 스테이지</td><td>A-M Systems</td><td>680100</td><td>&lt;a href="http://www.a-msystems.com" target="_blank"&gt;www.a-msystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;Powerlab 4/30 데이터 수집 시스템&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"&gt;www.adinstruments.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Grass 자극기</td><td>Grass Technologies</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.grasstechnologies.com" target="_blank"&gt;www.grasstechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>데스크톱 컴퓨터</td><td>Dell</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.dell.com" target="_blank"&gt;www.dell.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com" target="_blank"&gt;www.leica-microsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>광원</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>41446-062</td><td>&lt;a href="http://www.dolan-jenner.com" target="_blank"&gt;www.dolan-jenner.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>초파리 배지</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>All-Trans-Retinal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>116-31-4</td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"&gt;www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;OK-371 Gal4&lt;/em&gt; 초파리</td><td>Bloomington Stock center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-ChR2&lt;/em&gt; 초파리</td><td>Fiala lab, Griffith lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LED 제어 회로</td><td>Griffith lab 자체 제작</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.ledsupply.com" target="_blank"&gt;http://www.ledsupply.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href="http://www.futureelectronics.com" target="_blank"&gt;http://www.futureelectronics.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;구성 요소: &lt;br/&gt;1. 200 mA Buck Puck&lt;br/&gt;2. 청색 LED&lt;br/&gt;3. 절연 전선&lt;br/&gt;4. 회로 브레드보드&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>LED 방열판</td><td>Thorlabs Inc.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.thorlabs.com/" target="_blank"&gt;http://www.thorlabs.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>에어 테이블</td><td>TMC</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html" target="_blank"&gt;http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>패러데이 케이지</td><td>Griffith lab 자체 제작</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Leitz M 마이크로 조작기</td><td>Leica Microsystems</td><td>ACS01</td><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com" target="_blank"&gt;www.leica-microsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>전극 홀더</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.axon.com" target="_blank"&gt;www.axon.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>붕규산 유리</td><td>FHC, Inc.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.fh-co.com/p14-15.pdf" target="_blank"&gt;www.fh-co.com/p14-15.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>전극 풀러</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.sutter.com" target="_blank"&gt;www.sutter.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>0.8mM Ca2+ 함유 HL 3.1 식염수</td><td></td><td></td><td>함량 (mM):&lt;br/&gt; NaCl:70 KCl:5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;: 0.8&lt;br/&gt; MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;:4Sucrose:115&lt;br/&gt;NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;: 10 Trehalose: 5 HEPES</td></tr><tr><td>미세 해부 도구</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.finescience.com" target="_blank"&gt;www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

에서 시냅틱 후보의 channelrhodopsin2 중재 ​​자극 drosophila 신경근육학 분기점

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레 신경근육학 준비는 시냅스 생리학을 공부에 유용한 도구로 입증되었습니다<sup&gt; 1,2,3</sup&gt;. 현재, 유일하게이 준비 흥분성의 junctional 잠재력 (EJPs)를 보여주고에 사용할 의미 흡입 전극의 사용을 포함한다. 연구 및 교육 실험실 모두에서, 학생들은 종종 어려움 자극 전극의 유형을 작전하고 조작 있습니다. 현재 작업에서 우리는 원격 흡입 전극을 사용하지 않고 애벌레 NMJ에 신경 잠재력을 자극하는 방법을 보여줍니다. channelrhodopsin2 (ChR2)을 표현함으로써<sup&gt; 4,5,6</sup&gt;에<em&gt; Drosophila</em를 사용하여&gt; 모터 뉴런<em&gt; GAL4 - UAS</em&gt; 시스템<sup&gt; 7</sup&gt;, 그리고 기본적인 전기 생리학의 장비에 약간 변화를주고, 우리는 푸른 빛의 펄스와 EJPs을 안정적으로 보여주고 수 있었다. 이 기술은 학생 릭 연습 시간과 자원이 제한됩니다 neurophysiology 교육 연구소에서 특정 사용이 될 수 있습니다.

이 절차에 신경근육학 교차로 (NMJ)에서 광 펄스로 신경 잠재력을 보여주고에 푸른 빛을 활성화 algal 채널 및 셀 - 특정 유전자 표현 도구를 사용하여<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레. 이 기술은 저렴하고 연구 및 교육 연구소에서 신경 생리학 연구를위한 흡입 전극 자극을 대체 사용하기 쉬운 것입니다.

에서 시냅틱 후보의 Channelrhodopsin2 중재 ​​자극 Drosophila 신경근육학 분기점

초파리 유충 신경근 준비물은 시냅스 생리학을 연구하는 데 유용한 도구임이 입증되었습니다1,2,3. 현재 이용 가능한 유일한 방법은...

이 절차는 초파리를 배양하는 것으로 시작합니다. 모든 트랜스 레티놀(all trans retinol)이 포함된 먹이에서 적절한 유전자형을 가진 3령 유충을 기릅니다. 각 유충의 머리와 꼬리 부분을 핀으로 고정합니다.그 다음 FLA를 평평하게 폅니다. 이어 뇌와 후방 신경을 절단하여 리듬감 있는 운동 활동을 중단시킵니다. 다음으로, 컨트롤 박스가 포함된 청색 LED 광원을 조절하여 표본에 초점을 맞춥니다.마지막으로, 날카로운 전극을 사용하여 6번 근육을 찌릅니다. 그런 다음 전압원을 통해 빛 펄스를 가합니다. 안녕하세요, Brandeis University 생물학과 Dr. Leslie Griffith 연구실의 Nicholas Marstein입니다.안녕하세요, Griffith 연구실의 Stefan Pulver입니다. 오늘은 초파리 유충의 신경근 접합부에서 channel rhodopsin 2를 이용해 시냅스 전위를 유도하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 초파리의 시냅스 생리학을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.우리는 또한 이를 사용하여 학생들에게 시냅스 생리학을 가르치고 교육 실습을 진행합니다. 이제 시작해 보겠습니다. 이 프로토콜을 시작하려면 UAS channel redsin two와 3 7, 1 gal four 초파리 라인을 표준 초파리 배지가 들어 있는 별도의 병에서 유지하십시오.3 7, 1 gal, 네 가지 초파리 라인에서 처녀 초파리를 수집하고, UAS channel redsin의 두 가지 라인에서 수컷을 수집하십시오. 다음으로, 1 mM의 all trans retinol(ATR)이 혼합된 초파리 배지를 만듭니다. 이를 위해 일반 초파리 배지를 전자레인지에서 약 1분 동안 녹입니다.배지가 녹으면 약 30에서 60초 동안 식힌 후, 파리 배지 10 mL마다 100% 에탄올에 녹인 100 mM a TR 100 µL를 첨가합니다. a TR 배지가 담긴 바이알이 준비되면, 수집한 수컷과 암컷 파리를 각 바이알에 넣습니다. 바이알을 22에서 25 °C의 어두운 곳에 두어 파리가 교미하고 알을 낳게 하며, 3령 유충이 보일 때까지 4~5일 동안 기다립니다.이 시점에서 성체 파리는 폐기해도 좋습니다. 이제 전기생리학 장비 설정을 진행할 준비가 되었습니다. 해부 현미경의 접안렌즈를 히트싱크가 장착된 청색 LED 광원에 부착하십시오.포스트와 클램프를 사용하여 마그네틱 베이스를 접안렌즈와 LED 광원에 부착합니다. 마그네틱 베이스를 전기생리학 장비의 에어 테이블 위에 배치합니다. 다음으로, 광원을 제어 회로에 연결하고, 제어 회로를 외부 전압원에 연결합니다.우리는 AD Instruments 사의 PowerLab 전기생리학 데이터 수집 시스템에서 출력되는 전압을 사용합니다. 전압원에 연결한 후, 청색광을 활성화하기 위해 제어 회로에 1~5V 펄스를 가하며, 청색광 빔이 유충 해부 부위에 집중될 때까지 마그네틱 베이스와 광원을 조정합니다. 적절한 조정이 완료되면 유충 해부 단계로 넘어갈 준비가 된 것입니다.해부를 시작하려면, agar가 깔린 접시 바닥에 0.1 mm 핀 6개를 꽂습니다. 먹이 배지에서 3주 된 star larvae를 꺼내어 플라스틱 페트리 접시에 옮깁니다. 식염수로 유충을 헹구어 유충에 붙어 있는 먹이를 제거합니다.그 다음 유충을 뽑힌 핀 근처의 해부 접시에 놓고, 접시의 절반을 식염수로 채웁니다. 이제 유충의 등 쪽에 두 개의 은색 튜브가 보이는 방향으로 놓습니다. 이 은색 튜브들이 바로 기관입니다.기관 튜브 사이의 꼬리 부분에 커다란 핀을 직접 꽂습니다. 유충을 눌러 고정시킨 뒤, 머리 부분에 두 번째 커다란 핀을 꽂습니다. 핀을 꽂을 때 몸통이 길이 방향으로 길게 펴지도록 하십시오.가위를 사용하여 꼬리 근처에 작은 절개를 만듭니다. 몸통 길이를 따라 절개를 계속합니다. 이때 가위 끝을 들어 올려 복측 신경이나 체벽 근육이 잘리지 않도록 주의하십시오.동물의 네 모서리에 핀 4개를 꽂습니다. 이제 중앙 부분을 엽니다. 동물을 필렛 형태로 펼치기 위해 핀을 해부 접시에 고정합니다.또한 핀셋과 가위를 사용하여 고정하는 방법을 교육할 수 있도록 표본을 고정하십시오. 동물의 소화 기관, 기관 및 지방체를 제거하십시오. 표본을 식염수로 헹굽니다.세척 후, 마이크로 가위를 사용하여 표본의 전두엽과 복측 신경절의 위치를 찾습니다. 전두엽 바로 뒤쪽의 복측 신경절을 조심스럽게 절개합니다. 해부가 완료되면 청색광 자극 및 근육 기록을 진행합니다.근육 기록을 수행하려면 10~20 MΩ 저항의 전극을 뽑습니다. 전자 전극 추출기를 사용하여 추출된 전극을 3 M KCl로 채웁니다. 채워진 전극을 전극 홀더에 장착합니다.이제 유충 표본을 장치 위의 실체 현미경 아래에 놓습니다. 청색광을 조절하여 해부된 표본이 광선의 중심에 오도록 합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 유충의 신체벽 마디에서 6번 근육(M6)을 식별하고, 전극을 M6에 조심스럽게 삽입한 후 근육의 급격한 과분극 현상을 관찰합니다.휴지 막전위는 -30 mV에서 -70 mV 사이여야 합니다. 전극이 적절하게 삽입되면 제어 회로에 20 내지 100 ms의 전압 펄스를 가하십시오. 제어 회로에 공급되는 전압을 점진적으로 증가시키십시오.근육 세포에서 흥분성 접합 전위(exci junction potentials)를 관찰하십시오. 다음은 짧은 광펄스에 의해 유도된 흥분성 접합 전위를 보여주는 대표적인 결과입니다. 여기서 제시된 흥분성 접합 전위의 진폭은 모두 활성화되는 것으로 알려진 두 개의 운동 뉴런에서 합산된 진폭입니다.M six. 빛의 강도를 낮추거나 조사 시간을 짧게 하면, 단일 운동 뉴런에서 발생하는 더 작은 진폭의 흥분성 접합 후전위를 노출시킬 수 있습니다. 지금까지 우리는 개구리 신경근 접합부에서 채널 로드 absent 2 매개 자극을 통해 시냅스 전위를 유도하는 방법을 보여드렸습니다.이 절차를 수행할 때, 해부 과정 중 표본의 체벽이 손상되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 또한, 해부 직후에는 표본이 과하게 흥분될 수 있으나, 시간이 지나면 점차 진정되어 양호한 기록이 가능해진다는 점을 기억하십시오. 근육에 핀을 꽂을 때는 첫 번째 근육층 아래의 체벽까지 들어가지 않도록 주의하시기 바랍니다.전극이 체벽에 박혀 있을 때, 때때로 과분극 전위를 얻을 수 있지만 실제로 근육 세포 내에 진입한 상태는 아닐 수 있습니다. 이상입니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 Drosophila의 유충의 신경근육학 교차점에서 시냅스 전송을 측정 electrophysiological 방법을 설명합니다. Evoked 릴리스는 모터 신경의 axons을 자극하여 인공적으로 시작되며, NMJ을 통해 전송은 근육에 evoked postsynaptic 반응에 의해 측정할 수 있습니다.

Drosophila의 애벌레의 NMJ에서 시냅틱 후보를 녹음 Electrophysiological 방법

이 비디오는 초파리 유충의 신경근 접합부에 있는 시냅스 부톤의 시냅스 전류를 기록하는 기술을 보여줍니다. 이 기술을 사용하면 단일 시냅스 부톤의 활동을 모니터링할 수 있으며, 이는 자발적 또는 비동기적 시냅스 활동이 향상된 돌연변이 파리 계통 연구에 중요합니다.

Drosophila larval neuromuscular junction에서 시냅스 전류 기록

준 그대로의 모터 출력의 변화 (근육 수축) 모니터링하면서 여기에 우리가 motoneuronal 활동 optogenetic 조작에 대한 프로토콜을...

세미 그대로의 레이저 조명과 신경 활동의 Optogenetic 섭동<em&gt; 초파리</em모션&gt; 유충

Sharp microelectrodes는 살아있는 초파리에서 광수용체 및 시각 중간뉴런 출력의 정확한 전기생리학적 특성을 가능하게 합니다. 여기에서는 이 방법을 사용하여 제어된 광 자극에 대한 개별 셀의 고품질 전압 응답을 기록하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 곤충 겹눈의 신경 정보 처리를 연구하는 데 이상적입니다.

의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

Drosophila melanogaster photoreceptor의 전체 세포 기록은 다양한 조건 에서 자연스런 어두운 범프, 양자 범프, 빛에 대한 거시적 반응 및 전류 - 전압 관계를 측정 할 수있게합니다. D. melanogaster 유전자 조작 도구와 결합하여이 방법은 유비쿼터스 이노시톨 - 지질 신호 전달 경로와 그 표적 인 TRP 채널에 대한 연구를 가능하게합니다.

전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 광 수용체

시 냅 스 전류 초파리 3 탈피 애벌레 neuromuscular 접속점에 시각화 된 시 냅 스 boutons에서 focally 기록 될 수 있습니다. 이 기술은 단일 시 냅 시스 bouton의 활동을 모니터링 수 있습니다.

초파리 애벌레 신경 근육 학 교차로에서 시 냅 스 전류의 초점 Macropatch 녹음

이 문서는 테트로도톡신와 테트로도톡신 저항 나트륨 채널, NaChBac 채용 하 여 뉴런 사이의 monosynaptic 연결을 테스트 하는 방법을 갖추고 있습니다.

Drosophila 테트로도톡신 저항 나트륨 채널을 사용 하 여 Monosynaptic 연결 검사

시 냅 스 소포 (SV) 자전거는 신경 시 냅 스에서 세포 커뮤니케이션의 핵심 메커니즘. FM 염료 통풍 관 및 릴리스 양적 SV 엔도-및 exocytosis 시 금의 기본 수단입니다. 여기, 우리는 모든 자극 방법 FM1 43 초파리 신경 근육 학 교차로 (NMJ) 모델 시 냅 스에서 자전거를 비교 합니다.

시 냅 스에서 사이클링 하는 FM 염료: 높은 칼륨 도발은, 전기 및 Channelrhodopsin 자극을 비교

Channelrhodopsin 보조 회로 매핑 (CRACM)은 해부학 및 / 또는 유전적으로 식별 된 뉴런 그룹 사이의 장거리 신경 투영의 기능 적 매핑을위한 정밀 기술입니다. 여기에서는 CRACM을 사용하여 적색 이동 옵신, ChrimsonR의 사용을 포함하여 청각 뇌간 연결을 매핑하는 방법을 설명합니다.

청색 및 적색 이동 채널로도프신을 가진 열등한 콜리큘러스 뉴런의 장거리 채널로돕신 보조 회로 매핑

우리는 전기생리학적으로 이중 안정한 광안료를 특성화하기 위한 프로토콜을 제시한다: (i) 광자-흡수 및 광수용체에서의 그들의 엄청난 양에 뒤따르는 광안료 분자 내의 전하 변위를 이용하고, (ii) 로돕신과 메타로돕신 광안료 상태의 흡수-스펙트럼 차이를 이용한다. 이들 프로토콜은 이중-안정한 광안료 시스템에 영향을 미치는 돌연변이를 스크리닝하는데 유용하다.

초파리 광수용체에서 광안료 수준을 측정하기 위한 전기생리학적 방법

이 프로토콜은 유전적으로 인코딩된 도구를 사용하여 Drosophila melanogaster 유충의 중추신경계에서 정의된 신경 파트너 간의 기능적 시냅스 활동을 생체 내에서 평가합니다. CsChrimson 매개 광유전학적 자극은 시냅스 전 감각 신경세포 cIVda 신경세포를 유발하여 시냅스 후 분지 4 중간뉴런에서 CaMPARI의 칼슘 의존적 광변환을 유도합니다.

CaMPARI를 이용한 초파리 유충 중추신경계에서 개별 시냅스 전후 파트너의 기능적 특성 분석

배우세요 Drosophila 유충 신경근육학 분기점에서 Channelrhodopsin2를 이용한 빛 자극으로 시냅스 전위를 유발하는 방법. 이 비침습적 기법은 흡입 전극 자극보다 저렴하고 간편하며 신경과학 연구 및 교육에 활용됩니다.

에서 시냅틱 후보의 Channelrhodopsin2 중재 ​​자극 Drosophila 신경근육학 분기점

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에서 시냅틱 후보의 Channelrhodopsin2 중재 자극 Drosophila 신경근육학 분기점