에서 시냅틱 후보의 Channelrhodopsin2 중재 ​​자극 Drosophila 신경근육학 분기점

이 절차는 초파리가 자라는 것으로 시작됩니다. 셋째, 모든 트랜스 레티놀을 함유한 식품에 적절한 유전자형을 가진 인스타 구더기. 각 구더기는 머리와 꼬리가 핀으로 꽂혀 있습니다.

그런 다음 FLA 플랫. 그런 다음 뇌와 후방 신경을 절단하여 리듬 운동 활동을 중단합니다. 다음으로, 컨트롤 박스가 있는 파란색 LED 광원을 조정하고 준비에 집중합니다.

마지막으로 날카로운 전극을 사용하여 6번 근육을 꿰뚫습니다. 그런 다음 전압 소스로 광 펄스를 전달합니다. 안녕하세요, 저는 브랜다이스 대학교 생물학과 레슬리 그리피스 박사 연구실의 니콜라스 마스타인입니다.

안녕하세요, 저는 그리피스 연구소의 스테판 펄버입니다. 오늘 우리는 초파리 유충의 신경근 접합부에서 채널 루트가 2 개없는 시냅스 전위를 불러 일으키는 절차를 보여 드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 시냅스 생리학과 초파리를 연구합니다.

우리는 또한 학생들에게 시냅스 생리학 및 교육 실험실을 가르치는 데 사용합니다. 시작하겠습니다. 이 프로토콜을 시작하려면 표준 플라이 미디어를 포함하는 별도의 병에 UAS 채널 redsin 2 및 okay, 3 7, 1 gal four fly lines를 유지하십시오.

3 7, 1 gal, 4 개의 플라이 라인에서 처녀와 UAS 채널 redsin에서 수컷을 수집합니다. 두 줄. 다음으로, 1 밀리 몰, 모든 트랜스 레티놀 또는 TR.To 와 혼합 된 플라이 미디어를 전자 레인지에서 약 1 분 동안 녹입니다.

일단 녹으면 배지를 약 30-60초 동안 냉각시킨 다음 플라이 미디어 10밀리리터당 100% 에탄올에 100마이크로리터의 100밀리몰 TR을 추가합니다. TR 배지가 들어 있는 바이알이 준비되면 수집된 수컷과 암컷을 각 바이알에 넣습니다. 유리병을 섭씨 22도에서 25도의 어두운 곳에 놓아 파리가 짝짓기를 하고 알을 낳을 수 있도록 4-5일 동안 기다렸다가 세 번째 별 유충이 보일 때까지 기다립니다.

이 시점에서 성충 파리를 처분할 수 있습니다. 이제 전기생리학 리그 설정을 진행할 준비가 되었습니다. 해부 스코프 접안렌즈를 방열판이 있는 파란색 LED 광원에 부착합니다.

포스트와 cl을 사용amp 접안렌즈와 LED 광원에 마그네틱베이스를 부착합니다. 전기생리학 장비의 공기 테이블에 마그네틱베이스를 놓습니다. 그런 다음 광원을 제어 회로에 연결한 다음 제어 회로를 외부 전압 소스에 연결합니다.

우리는 광고 기기로 만든 전력 실험실 전기 생리학 데이터 수집 시스템의 전압 출력을 사용합니다. 전압 소스에 연결되면 제어 회로에 1-5 볼트 펄스를 제공하여 청색광을 활성화하고 청색 광선이 유충 해부가 차지하는 영역에 집중 될 때까지 자기베이스와 광원을 조정합니다. 적절한 조정을 한 후 유충 해부로 넘어갈 준비가 되었습니다.

해부를 시작하려면 0.1mm 핀 6개를 소가를 깐 접시 바닥에 꽂습니다. 식품 매체에서 별 유충의 세 번째 유충을 제거하고 플라스틱 페트리 접시에 넣으십시오. 유충을 식염수로 헹구어 유충에 붙어 있는 음식을 제거하십시오.

그런 다음 뽑은 핀 근처의 해부 접시에 유충을 넣고 접시에 식염수를 반쯤 채웠습니다. 이제 동물의 등 표면을 따라 달리는 두 개의 은색 튜브를 볼 수 있도록 유충의 방향을 지정하십시오. 이 은관이 기관입니다.

기관 튜브 사이의 꼬리에 큰 핀을 직접 삽입합니다. 애벌레를 잡고 머리에 두 번째 큰 핀을 꽂습니다. 핀을 삽입할 때 본체를 세로로 펴야 합니다.

가위를 사용하여 꼬리 근처를 작게 절개합니다. 몸의 길이만큼 절개를 계속하십시오. 복부 신경 및/또는 체벽 근육이 절단되지 않도록 가위 끝이 올라갔는지 확인하십시오.

동물의 네 모서리에 4개의 핀을 놓습니다. 이제 중간 부분을 엽니다. 동물을 필레하기 위해 해부 접시에 핀을 놓습니다.

또한 집게와 가위를 사용하여 가르칠 수 있도록 준비물을 고정합니다. 동물, 소화 기관, 기관 및 지방체를 제거하십시오. 식염수로 준비물을 헹굽니다.

헹굼 후 마이크로 가위를 사용하여 준비의 전두엽과 복부 신경절을 찾습니다. 전두엽 바로 뒤에 있는 복부 신경절을 조심스럽게 자릅니다. 해부가 완료되면 블루라이트 자극과 근육 기록을 진행합니다.

근육 기록을 수행하려면 10-20메가옴 저항 전극을 당깁니다. 전자 전극 풀러를 사용하여 당겨진 전극에 3개의 몰 KCL을 채웁니다. 채워진 전극을 전극 홀더에 놓습니다.

이제 유충 준비를 장비의 해부 현미경 아래에 놓습니다. 절개된 프렙이 광선의 중앙에 오도록 파란색 조명을 조정합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 유충의 체벽 분절에서 근육 6 또는 M 6을 확인하고, 전극을 M six에 조심스럽게 삽입하고 빠른 과분극 근육을 관찰합니다.

휴지 멤브레인 전위는 음의 30 밀리 볼트에서 음의 70 밀리 볼트 사이 여야합니다. 전극이 제대로 삽입되면 제어 회로에 20-100밀리초의 전압 펄스를 제공합니다. 제어 회로에 공급되는 전압을 점진적으로 증가시킵니다.

근육 세포에서 exci junction potentials를 관찰하십시오. 다음은 짧은 광 펄스에 의해 유발되는 exci junction potential을 보여주는 대표적인 결과입니다. 여기에 표시된 exci 접합 전위 진폭은 둘 다 먹는 것으로 알려진 두 개의 운동 뉴런에서 합산된 진폭입니다.

남 6. 강도가 낮거나 빛의 지속 시간이 짧으면 단일 운동 뉴런에서 더 작은 진폭의 흥분성 접합 전위가 노출될 수 있습니다. 우리는 방금 안과 신경근 접합부에서 시냅스 전위의 두 가지 매개 자극이 없는 채널 로드를 수행하는 방법을 보여주었습니다.

이 절차를 수행할 때 해부 중 프렙의 체벽을 손상시키지 않도록 하는 것이 중요합니다. 또한 프렙이 해부 직후에 과도하게 흥분할 수 있지만 시간이 지남에 따라 조용해지고 좋은 녹음이 가능하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 근육을 찌를 때 근육의 첫 번째 층 아래로 체벽으로 들어가지 않도록 주의하십시오.

전극이 체벽에 붙어 있을 때. 때때로 과분극 전위를 얻을 수 있지만 실제로는 근육 세포에 있지 않습니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.