Name: 만들기, 테스트 및 성인 뇌의 조직 조각에 칼륨 이온 선택적 Microelectrodes를 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 배우세요 성인 해마 뇌 조각에서 칼륨 이온 농도 역학을 정량적으로 측정하는 칼륨 이온 선택적 마이크로전극 제작 및 교정 방법을. 이 기술은 중추신경계 칼륨 항상성의 세포 및 분자 메커니즘 연구에 필수적입니다.

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Khakh 실험실은 NIH MH104069에 의해 지원 되었다. Mody 실험실 NIH NS030549에 의해 지원 되었다. J.C.O.는 NIH T32 신경 칩 훈련 Grant(NS058280) 감사합니다.

모든 동물 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 헬스 가이드의 국립 연구소에 따라 실시 했다 고 장관의 동물 연구 위원회, 로스 앤젤레스가 주 대학에 의해 승인 했다. 모든 마우스 음식과 물을 사용할 수 있는 광고 libitum 12 h 빛 어두운 환경에 함께 보관 되어 있었다. 모든 동물 명백한 행동 변경 없이 건강 한, 이전 연구에 관여 되지 않은 되었고 빛 주기 동안 희생 했다. 실험 데이터는 성인 쥐 (모든 실험에 대 한 오래 된 6-8 주)에서 수집 했다.
1. 선택적 microelectrodes K+ 의 준비
<ol><li>붕 규 산 유리의 Silanization<ol>
<li>포장에서 충분 한 유리 모세 혈관을 제거 하 고 50 mL 원뿔 관으로 장소. HCl 밤새 또는 최소 6 시간에 대 한 부드러운 동요와 1 M HCl 세척 전극에 원뿔 튜브 위로 채우십시오.</li>
		<li>짧게 70% 에탄올과 모세 혈관을 헹 구 고 6-8 시간 동안 100-120 ° C에서 완전 하 게 건조. 더 사용 하기 전에 최대 4 주 동안 무수 칼슘 황산 염 방 습 제로 용기에 씻어 모 세관을 저장 합니다.</li>
		<li>Silanization, 이전 microelectrode 끌어당기는 사람을 사용 하 여 좋은 팁을 모 세관을 당겨. 우리가 사용 하는 microelectrodes는 직경에서 대략 2-5 미크론. 항상 취급 하십시오 장갑, 세척 된 모세 혈관 피부에서 기름 silanization를 방해할 수 있습니다.</li>
		<li>전극 팁 파손을 방지 하기 위해 바닥에서 상승는 되도록 유리 용기에 microelectrodes를 놓습니다. Microelectrodes 멸 테이프 또는 유사한 접착 테이프를 사용 하 여 컨테이너를 수정 합니다.</li>
		<li>약 0.5 mL 5 %dichlorodimethylsilane (DDS) silanization 솔루션의 질소 대체 방법을 사용 하 여 컨테이너에서 제거 ( 그림 2참조). 질소 가스는 풍선을 풍선에 주사기 또는 튜브와 바늘 연결. 더 긴 바늘을 통해 별도 주사기에 DDS를 그리는 동안 DDS 컨테이너에 바늘을 삽입 합니다.</li>
		<li>펫의 팁에 dropwise silanization 솔루션을 적용 하 고 즉시 커버. 들고 silanization 솔루션 microelectrodes 미리 따뜻하게 (170-180 ° C) 실험실 오븐에 10-12 시간 또는 200-220 ° C에서 30 분에 대 한 컨테이너를 놓습니다</li>
		<li>부 화 후 오븐을 해제 하 고 오븐에서 제거 하십시오. 그것은 매우 뜨거운는 인큐베이터에서 접시를 제거할 때는 주의 해야 합니다. 냉각 유리를 수 있도록 10-15 분간 실 온에서 벤치에 접시를 놓습니다.</li>
		<li>microelectrodes (테이프를 잘라 면도날 또는 메스 블레이드 사용) 접시에서 제거 건조제 채워진된 밀폐 용기에 그들을 배치. 수 분의 자유로운 유지 하는 Silanized microelectrodes silanization 다음 최대 1 주일까지 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전극을 못쓰게<ol>
<li>재고 솔루션 K+ ionophore 칵테일의 준비: 5 %w / v valinomycin, 93 %v / v 1, 2-디 메 틸-3-니트로 벤젠, 2 %w / v 칼륨 tetrakis(4-chlorophenyl) 붕 산 염11. 이 솔루션은 희미 한 노란 색상입니다. 실내 온도에 밀폐, 불투명 용기에 계속. 제대로 저장 된 경우이 솔루션에 게 몇 개월 지난 수 있습니다.</li>
		<li>10 mM HEPES pH 7.4에서 300 mM NaCl 버퍼링의 재고 솔루션을 준비 합니다. 28 G microfil 팁 주사기에 연결을 사용 하 여 버퍼링된 NaCl와 전극 클램프 및 백필으로 수정. 준수는 염 microelectrode 팁의 끝에 도달 했습니다. microelectrode의 전류 흐름을 방해할 수 있는 큰 거품의 무료 되는지 확인 합니다.</li>
		<li>약 10-20 µ m 폭, 메스 또는 면도칼의 무딘 사이드를 사용 하 여 전극의 팁을 휴식.</li>
		<li>사용 하는 micropipette, K+ ionophore는 microelectrode의 끝 근처의 작은 물방울 (~0.1 µ l)를 적용 합니다. 만약 전극은 제대로 silanized 드롭릿에 깨진된 팁으로 흡수 될 것 이다. 채우기 1-2 m m K+ ionophore와 제거 초과 전극 휴지를 사용합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 선택적 Microelectrodes K+ 의 교정
<ol><li>교정 솔루션의 준비<ol>
<li>KCl과 NaCl을 대체 하 여 동등한 osmolarity 인공 뇌 척추 액체 (실제)에서 KCl의 다양 한 농도의 솔루션을 준비 합니다. 우리는 0.1, 1, 4.5, 10, 100 m m K+ 실제, 전극의 교정에 대 한 사용. 이러한 교정 솔루션에 대 한 조리법은 표 1에 나열 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">화학</td>
			<td>MW</td>
			<td rowspan="2">마지막 m m</td>
			<td rowspan="2">0.1 m m [K +]</td>
			<td rowspan="2">1 m m [K +]</td>
			<td rowspan="2">4.5 m m [K +]</td>
			<td rowspan="2">10 m m [K +]</td>
			<td rowspan="2">100 m m [K +]</td>
		</tr>
<tr>
<td>(g / mol)</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>58.44</td>
			<td>다릅니다.</td>
			<td>1.51 g</td>
			<td>1.50 g</td>
			<td>1.44 g</td>
			<td>1.4 g</td>
			<td>0.345 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>1 M 주식</td>
			<td>다릅니다.</td>
			<td>20 µ l</td>
			<td>200 µ l</td>
			<td>900 µ l</td>
			<td>2 ml</td>
			<td>20 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>1 M 주식</td>
			<td>2</td>
			<td colspan="5">400 µ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>1 M 주식</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="5">200 µ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2포4
</td>
			<td>119.98</td>
			<td>1.2</td>
			<td colspan="5">0.29 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>84.01</td>
			<td>26</td>
			<td colspan="5">0.437 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-포도 당</td>
			<td>180.16</td>
			<td>10</td>
			<td colspan="5">0.360 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>물</td>
			<td colspan="7">q.s. 200 ml</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. 칼륨 교정 솔루션
<ol start="2"><li>Microelectrode 교정<ol>
<li>실험을 시작 하기 전에 적어도 20 분 동안 95% O2/5% CO2 와 모든 솔루션을 거품. 4.5 m m [K+] 목욕 perfusing 시작 분 당 3 mL의 속도로 실제. K+ 선택적인 전극을 조작자에 전극 headstage에 연결 된 전극 홀더 넣으십시오. 이 headstage는 적절 한 앰프에 연결 된다. 목욕 perfusate에는 전극의 끝을 삽입 합니다.</li>
		<li>Ag/AgCl 접지 전극은 동일한 솔루션에서 목욕을 하 고 흐름은 꾸준한 확인 하십시오. Stepwise 방식에서 교정 솔루션을 적용 하 고 전극 팁에 걸쳐 mV에 잠재적인 변화를 기록 합니다. 다음 솔루션으로 전환 하기 전에 안정적인 값에 도달 하는 전극 팁에서 잠재력을 기다립니다</li>
		<li>전극 끝에 교정 솔루션의 응용 프로그램에 대 한 응답에서 안정 상태 전압 변화를 측정 합니다. 전극 응답의 사면은 적어도 52와 58 보다 더 큰 확인 mV 로그 변경 [k+] 당.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 급성 Hippocampal 뇌 조각의 준비
<ol><li>조각 솔루션의 준비<ol>
<li>500 mL 자당 준비 절단 솔루션 구성: 194 m m 자당, 30 m NaCl, 4.5 m KCl, 10mm D-포도 당, 1mm MgCl2m m, 1.2 m m NaH2포4, 26mm NaHCO3, 290-300 mOsm, 5% CO2와 95% O2 포화.</li>
		<li>준비의 구성 기록 솔루션 (실제)의 1-2 리터: 124 mM NaCl, 4.5 m m KCl, 1 mM MgCl2, 10 m m D-포도 당, 2 mM CaCl2, 1.2 m m NaH2포4및 26 m m NaHCO3; (버블링) 후 pH 7.3-7.4, 290-300 mOsm, 5% CO2와 95% O2 포화. 솔루션을 기록 뇌 조각 홀더 챔버를 포함 하는 비 커를 32-34 ° c.에 그것을 유지합니다 비 자금 얼음 물으로 vibratome 챔버를 채우십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>급성 슬라이스 준비<ol>
<li>깊이 2-3 mL isoflurane에 미리 충전 된 벨 항아리에 그것을 배치 하 여 마우스를 anesthetize. 발가락 핀치 반사에 대 한 확인 하 고 응답 하지 않는 경우 신속 하 게 목을 벨 동물 프로토콜에서 요구 하는으로 한 쌍의 날카로운가 위 또는 단두대를 사용 하 여.</li>
		<li>2-3 cm 절 개 잘라 중간 선 따라 두 피를 두개골의 꼬리 부분에서가 위를 사용 하 여 확인 합니다. 수동으로 제거 두 피, 하는 동안 두 개의 1 cm 가로 절 측면을 따라 구멍 매그넘에서 두개골의 확인 합니다. 그럼, 좋은 위를 사용 하 여 잘라 절 개 코에 두개골의 뒤에서 중간에 따라 두개골의 길이.</li>
		<li>중간 선 근처 삽입 미세 집게를 사용 하 여 두 부분에 베인된 두개골을 철회. 두개골에서 쥐의 뇌를 추출 하 고 블레이드를 사용 하 여 제거 하는 소 뇌 및 후 각 전구, 두뇌의 rostral 꼬리 부분에 각각 있습니다. 이러한 큰 균열, 피 질에서 그들을 구분 하 여 확인할 수 있습니다.</li>
		<li>슈퍼 접착제를 사용 하 여 vibratome 트레이에 두뇌 블록을 탑재 합니다. Vibratome 트레이를 차가운 얼음 절단 솔루션을 채우십시오.</li>
		<li>300 µ m 두께에서 코로나 비행기에 조직 섹션을 잘라. 보통 6 코로나 hippocampal 조각은 수집할 수 있습니다.</li>
		<li>각 섹션을 자른 후 즉시 전송 조각 슬라이스 잡고 비 커 32-34 ° c 예 열 섹션을 포함 하는 비 커를 제거 하기 전에 20 분 동안이 온도에 섹션을 계속 하 고 녹음 전에 적어도 20-30 분 동안 실내 온도에 배치.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 전기 Evoked K+ 역학의 측정
<ol><li>조각 준비 설정<ol>
<li>부드럽게 뇌 조각 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 목욕에 놓고 부드럽게 나일론 문자열 플래티넘 하프와 장소에서 개최 합니다.</li>
		<li>바이 폴라 자극 전극의 팁 서로 평행한 조각의 평면 수준 확인 합니다. 천천히, 6-7 초 동안 삽입 전극 CA3 지층 radiatum에 약 40-50 µ m 깊은 Schaffer collaterals를 자극. 코로나 섹션에서 CA3 식별할 수 있습니다 약 hippocampal genu에과 립 세포 층에 해 마 적절 한 측면의 부분으로 중간과 복 부 피라미드 세포 층에 떨어지는 지층 radiatum와 함께.</li>
		<li>조심 스럽게 삽입 K+-깊은 약 3 4 초 동안 전극을 천천히 낮추어 CA1 지층 radiatum 약 50 µ m으로 선택적인 전극. Stimulations 슬라이스를 적용 하기 전에 전극에 걸쳐 안정 가능성을 허용:이 보통 5 ~ 10 분 정도 걸립니다. 조각 전시 자발적인 경우 extracellular k+ 변경 삭제 그리고 새로운 조각으로이 과정을 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>측정 갖는 K+ 출시<ol>
<li>수동으로 디지털 응답을 녹음 하면서는 자극에 방 아 쇠를 우울 하 여 전기 자극 (8 펄스)의 열차를 적용 합니다. 10 Hz와 1 ms 펄스 폭, 10 µ A 자극 진폭에서 시작에서 자극을 적용 합니다.</li>
		<li>최대 K+ 응답 진폭 감지 될 때까지 2의 요인에 의해 증가 자극 진폭을 적용 합니다. 표시 되지 않으면 어떤 응답 단위로 100 µ m의 자극 사이트에 가까이 K+ 전극의 위치를 이동 하는 경우</li>
		<li>절반 최대한 응답을 생성 하는 자극 진폭을 결정 합니다. 우리의 경험에서는, 이것은 준비 품질, 동물, 그리고 자극 전극 및 K+ 선택적인 전극 사이의 거리의 나이에 따라 40-160 µ A 사이.</li>
		<li>동일한 조각에서 사용 하 여 자극 진폭 절반 최대한 응답을 생성 하는 진폭 보다 한 단계 (예: 반 최대한 응답을 생성 하는 80 µ A 경우 사용 40 µ A) 펄스의 수를 증가의 자극 기차를 적용. 처음, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 펄스의 열차 사용 했습니다.</li>
		<li>K+ 신호 전기 자극된 Schaffer 민간인 목욕의 활동 전위 발생에 의해 중재는 것인지 10 분 동안 0.5 µ M TTX 실제에 적용 하 고 자극 프로토콜을 반복 합니다. 갖는 무반응을 관찰 한다.</li>
		<li>마친 후 슬라이스 실험, 전극은 전극 교정 솔루션에서 다시 보정 하 여 자사의 responsivity를 유지 하 고 있다 고 응답 보장 초기 교정에서 10% 이상 벗어나지는 확인</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

우리가 여기에 설명 하는 방법 성인 쥐에서 급성 hippocampal 조각에서 Schaffer collaterals의 전기 자극에 대 한 응답에서 K+ 역학 평가 허용 했다. 준비 K+ 이온 선택적 microelectrodes의 우리의 방법은 앞서 설명한 절차12,13,,1415와 비슷합니다. 그러나,이 메서드는 장점이 대체 전극 구성 이라는 점에서 신속 하 고 단순한 K+ 선택적인 microelectrodes를 준비 하. 적절 한 교정 후 이러한 전극 튼튼하게 전기 자극, 동안 조각에 K+ 역학 측정을 발견 했다 그리고 이러한 응답 TTX에 의해 차단 되었습니다. 이 실험에서는 10 Hz에서 80-160 uA의 stimul...

칼륨 이온 농도 두뇌에 긴밀 하 게 규제 하 고 그들의 동요는 모든 세포의 휴식 막 잠재력에 강력한 영향을 발휘. 이러한 중요 한 공헌에 비추어 생물학의 중요 한 목표는 시체1 의 다른 장기에서 세포 외 공간에서 단단히 K+ 의 농도 조절 하는 데 사용 되는 셀룰러 및 생물 메커니즘을 결정 하는 , 2. 이러한 연구에 중요 한 요구는 K+ 농도 정확 하 게 측정 하는 능력. 건강 하 고 병에 걸린 상태에서 뇌의 칼륨 항상성에 공헌 하는 많은 구성 요소 식별된3,,45, 있다 지만 더 진행 되었습니다 둔화의 특성 상 전문 이온 선택적 microelectrodes 칼륨 측정에 대 한 준비. Microelectrode 센서 K+ 농도 생체 외에서조직 조각에서 vivo에서 측정 하기 위한 금 표준을 나타냅니다.
그러나 모니터링 K+ 에 대 한 새로운 접근법 개발이 K의 생물학 관련 범위+ 농도 검색 하지 않습니다 또는 하지 완전히 홀더 되었습니다 생물 학적 시스템에 있지만 광학 센서를 사용 하 여 초기 결과 유망한6,,78나타납니다. 광학 센서에 비해, microelectrodes는 근본적으로 이온, 포인트 소스 측정 전극 배열9공간 해상도 향상 시킬 수 있지만. 이 문서는 K+ 역학을 모니터링 하기 위한 단일 질주 microelectrode 센서에 초점을 맞추고.
이 작품에서는, 우리는 선택적 microelectrodes, 높게 선택적인 허용 하는 valinomycin 기반 칼륨 ionophore를 사용 하 여 (104 배 K+ + 나 선택도를) K+ 수 있도록 상세한 단계적 절차 보고 K+ 막10이상 운동입니다. 자연스럽 게 발생 polypeptide, valinomycin K+ 침투성 숨 구멍으로 작동 하 고 그것의 전기 화학 기온 변화도 아래로 K+ 의 흐름을 용이 하 게 한다. 우리는 또한 전극, 보정 하는 방법을 설명 저장 하 고 그들을 사용 하는 방법 및 마지막으로 성인 쥐에서 급성 hippocampal 두뇌 조각에서 K+ 농도 역학을 측정 하기 위해 그들을 배포 하는 방법. Extracellular K+ 역학 규제를 제안 하는 특정 이온 채널 부족 유전자 변형된 생쥐와 같은 전극의 사용 K의 주위 농도 제어 하는 신경 시스템에서 사용 하는 셀룰러 메커니즘을 계시 해야 한다 + extracellular 환경에.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>DSK</td><td>Microslicer Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>마우스: C57BL/6NTac 근친 마우스</td><td>Taconic</td><td>Stock#B6</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>전극 풀러</td><td>셔</td>터 <td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl 접지 펠릿</td><td>WPI</td><td>EP2</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP10.3</td><td>분자 장치</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>사용자 정의 microfil 28G 팁</td><td>세계 정밀 기기</td><td>CMF28G</td><td></td></tr><tr><td>텅스텐 막대</td><td>AM 시스템</td><td>716000</td><td></td></tr><tr><td>바이폴라 자극 전극</td><td>FHC</td><td>MX21XEW(T01)</td><td></td></tr> <tr><td>자극 아이솔레이터</td><td>세계 정밀 기기</td><td>A365</td><td></td></tr><tr><td>잔디 S88 자극기</td><td>잔디 악기 회사</td><td>S88</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 피펫</td><td>세계 정밀 기기</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>A to D 보드</td><td>Digidata 1322A</td><td>축삭 기기</td><td></td></tr><tr><td>신호 증폭기</td><td>멀티 클램프 700A 또는 700B</td><td>축삭 기기</td><td></td></tr><tr><td>헤드 스테이지</td><td>CV-7B Cat 1</td><td>축삭 기기</td><td></td></tr><tr><td>패치 컴퓨터</td><td>Dell</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>시그마</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성</td><td>시그마</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>D-포도</td><td>당 시그마</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>시그마</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>발리노마이신</td><td>시그마</td><td>V0627-10mg</td><td></td></tr><tr><td>1,2-디메틸-3-니트로벤젠</td><td>시그마</td><td>40870-25ml</td><td></td></tr><tr><td>테트라키스 칼륨(4-클로로페닐)보레이트</td><td>시그마</td><td>60591-100mg</td><td></td></tr><tr><td>헵탄의 5% 디메틸디클로로실란</td><td>시그마</td><td>85126-5ml</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>케이맨 Chemical Company</td><td>14964</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>시그마</td><td>H1758-500mL</td><td></td></tr><tr><td>수크로오스</td><td>시그마</td><td>S9378-5kg</td><td></td></tr><tr><td>피펫 미세 조작기</td><td>셔터</td><td>MP-285 / ROE-200 / MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>대물 렌즈</td><td>Olympus</td><td>PlanAPO 10xW</td><td></td></tr></tbody></table>

만들기, 테스트 및 성인 뇌의 조직 조각에 칼륨 이온 선택적 microelectrodes를 사용 하 여

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

칼륨 이온이 세포의 휴식 막 잠재력에 크게 기여 하 고, 따라서, extracellular K+ 농도 세포 흥분의 중요 한 레 귤 레이 터 이다. 활동 전위의 기반이 되는 전압 종속 이온 채널에 대 한 폐쇄, 오픈 및 비활성 상태 사이 평형 이동 하 여 휴식 막 잠재력과 세포 흥분 extracellular K+ 영향의 농도 변경 개시와 전도 따라서, 그것은 extracellular K+ 역학 건강 및 질병 상태를 직접 측정 하는 중요 한입니다. 여기, 우리가 확인 하 고, 보정 하 고 monopolar K+를 사용 하는 방법 설명-선택 microelectrodes. 우리는 전기 evoked K+ 농도 역학 측정 hippocampal 뇌 조각에 그들을 배포. 이러한 전극의 사리 분별이 사용 신 경계에 extracellular K+ 농도 제어 하는 세포와 생물 메커니즘을 평가 하는 데 필요한 도구 키트의 중요 한 부분 이다.

Extracellular K+의 선택적 측정을 위해 우리는 깨끗 한 붕 규 산 유리 펫 (그림 1A)의 silanization 통해 소수 레이어와 코팅 이온 선택적 microelectrodes 준비. 이 코팅 전극의 끝에 휴식 하 고 전극 팁 (그림 1B)에 좁은 개방을 통해 K+ 플럭스만을 허용 하는 valinomycin를 포함 하는 K+ ionophore를 수 있습니다. 못쓰게 백필 염와 K+ ionophore 전극, 후 전극 시험 될 수 있다 그들의 신속 하 고 선형 변화에 대응 stepwise 목욕 K+ 농도 (그림 3A)와 그들의 응답에 대 한 목욕 K+ 염 분에 교정 범위 (<stron...

칼륨 이온은 세포의 휴식 막 잠재력에 기여 하 고 extracellular K+ 농도 세포 흥분의 중요 한 레 귤 레이 터 이다. 우리가 확인 하 고, 보정 하 고 monopolar K+를 사용 하는 방법을 설명-선택 microelectrodes. 같은 전극을 사용 하 여 성인 hippocampal 조각 전기 evoked K+ 농도 역학 측정 수 있습니다.

만들기, 테스트 및 성인 뇌의 조직 조각에 칼륨 이온 선택적 Microelectrodes를 사용 하 여

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

이 기술의 전반적인 목표는 단극 칼륨 이온 선택성 미세 전극을 만들고, 보정하고, 사용하는 것입니다. 이러한 전극을 사용하면 성인 뇌 절편에서 유발된 칼륨 이온 농도 역학을 정량적으로 평가할 수 있습니다. 이 방법은 중추 신경계에서 칼륨 이온 항상성을 위한 세포 및 분자 메커니즘을 확인하는 것과 같은 생리학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 쉽고 간단한 제조 방법일 뿐만 아니라 미세 전극 센서가 칼륨 이온 농도 측정을 위한 황금 표준을 나타낸다는 것입니다. 실란화를 위해 붕규산 유리 모세관을 준비하려면 50ml 원뿔형 튜브에 넣습니다. 원뿔형 튜브에 1몰 염산을 채우고 유리 모세관을 염산으로 하룻밤 동안 최소 6시간 동안 부드럽게 교반하여 배양합니다.그 후, 70% 에탄올로 모세혈관을 간단히 헹군 다음 섭씨 100도에서 120도에서 6시간에서 8시간 동안 완전히 건조시킵니다. 세척된 모세혈관을 무수 황산칼슘 건조제가 담긴 용기에 최대 4주 동안 보관한 후 더 사용하십시오. 실란화(silanization)하기 전에 미세 전극 풀러(microelectrode puller)를 사용하여 모세혈관을 미세한 끝으로 당깁니다.그런 다음 오토클레이브 테이프를 사용하여 미세 전극을 유리 용기에 넣어 전극이 바닥에서 올라가도록 하여 팁 파손을 방지합니다. 다음으로, 질소 대체 방법을 사용하여 용기에서 약 0.5ml의 5%DDS 실란화 용액을 제거합니다. 풍선에 질소 가스를 채우고 주사기 또는 튜브와 바늘을 풍선에 부착합니다.그런 다음 바늘을 DDS 용기에 삽입하고 더 긴 바늘을 통해 DDS를 별도의 주사기에 그립니다. 그런 다음 실란화 용액을 피펫 끝에 적방울 방향으로 바르고 즉시 용기를 덮습니다. 실란화 용액이 든 미세전극을 담고 있는 용기를 예열된 실험실 오븐에 넣고 섭씨 170-180도에서 10-12시간 동안 또는 섭씨 200-220도에서 30분 동안 놓습니다.배양 후 오븐에서 플레이트를 꺼냅니다. 접시를 실온의 벤치에 10-15분 동안 놓아 유리 그릇을 식힙니다. 플레이트에서 미세 전극을 제거하고 건조제로 채워진 밀폐 용기에 넣습니다.수분이 없는 상태로 유지되는 실란화 미세전극은 실란화 후 최대 1주일 동안 사용할 수 있습니다. 전극을 프라이밍하려면 이오노포름 칼륨 칵테일의 원액을 준비하고 실온의 밀폐된 불투명한 용기에 보관하십시오. 다음으로, pH 7.4에서 10 밀리 몰 HEPES 완충 300 밀리 몰 염화나트륨의 원액을 준비합니다.클램프에 전극을 고정하십시오. 그런 다음 무딘 도구를 사용하여 전극 끝을 약 10-20마이크로미터 너비로 긁어낸 다음 주사기에 연결된 28 게이지 MicroFil 팁을 사용하여 HEPES 완충 염화나트륨으로 전극을 다시 채웁니다. 식염수가 미세 전극 팁의 끝에 도달했는지 관찰하고 미세 전극에 전류의 흐름을 방해할 수 있는 큰 기포가 없는지 확인하십시오.마이크로피펫을 사용하여 미세전극 끝 근처에 이오노포칼륨을 한 방울 떨어뜨립니다. 전극이 적절하게 실란화되면 물방울이 파손된 팁에 흡수됩니다. 전극에 이오노포칼륨을 약 1mm까지 채우고 티슈를 사용하여 초과분을 제거합니다.미세 전극을 보정하려면 실험을 시작하기 전에 최소 20분 동안 모든 보정과 95% 산소/5% 이산화탄소로 버퍼 용액을 슬라이스합니다. 분당 3밀리리터의 속도로 4.5밀리몰의 칼륨 이온 함유 ACSF를 수조에 관류하기 시작합니다. 포타슘 이온 선택성 전극을 매니퓰레이터의 전극 헤드스테이지에 부착된 전극 홀더에 놓습니다.그런 다음 전극의 끝을 수조 관류액에 삽입하십시오. 은/염화은 접지 전극이 동일한 용액에 담겨 있고 흐름이 일정한지 확인하십시오. 교정 용액을 단계적으로 적용하고 전극 팁 전체에서 잠재적인 변화(밀리볼트)를 기록합니다.다음 솔루션으로 전환하기 전에 전극 팁의 전위가 안정적인 값에 도달할 때까지 기다리십시오. 그런 다음 전극 팁에 대한 교정 용액의 적용에 따른 정상 상태 전압 변화를 측정합니다. 전극 전압 응답의 기울기가 52 이상이고 칼륨 농도의 10배 변화당 59밀리볼트 이하인지 확인합니다.해마 조각을 준비하려면 두개골의 꼬리 부분에서 2-3cm 절개를 만들어 정중선을 따라 두피를 자릅니다. 두피를 수동으로 집어넣으면서 두개골 측면을 따라 대공에서 1cm 너비로 두 개의 절개를 만듭니다. 그런 다음 가는 가위를 사용하여 두개골 뒤쪽에서 코까지 정중선을 따라 절개합니다.다음으로, 정중선 근처에 가는 집게를 삽입하고 절개된 두개골을 두 부분으로 집어넣습니다. 두개골에서 쥐의 뇌를 추출하고 칼날을 사용하여 뇌의 꼬리 부분과 꼬리 부분에 각각 위치한 소뇌, 전전두엽 피질 및 후각구를 제거합니다. 그런 다음 Super Glue를 사용하여 뇌 블록을 비브라톰 트레이에 장착합니다.비브라톰 트레이에 얼음처럼 차가운 절단 용액을 채웁니다. 그런 다음 코로나 평원의 조직 절편을 300마이크로미터 두께로 자릅니다. 일반적으로 4-6개의 관상 해마 절편을 채취할 수 있습니다.각 섹션을 자른 후 즉시 섭씨 32-34도로 예열된 슬라이스 보관 비커로 슬라이스를 옮깁니다. 기록하기 전에 최소 20-30분 동안 섹션이 있는 비커를 실온으로 옮기기 전에 섹션을 이 온도로 유지하십시오. 칼륨 이온 역학을 측정하려면 파스퇴르 피펫을 사용하여 뇌 조각을 욕조에 부드럽게 넣고 나일론 현이 있는 백금 하프로 부드럽게 제자리에 고정합니다.바이폴라 자극 전극의 끝이 서로 거의 평행하고 슬라이스의 평지와 수평인지 확인하십시오. 5-7초 동안 약 40-50마이크로미터 깊이의 CA3 방사선층에 전극을 천천히 삽입하여 Schaffer 담보를 자극합니다. 그런 다음 약 3-4초에 걸쳐 전극을 천천히 내려 CA1 방사층에 약 50마이크로미터 깊이까지 칼륨 이온 선택성 전극을 조심스럽게 삽입합니다.슬라이스에 자극을 가하기 전에 전극 전체에 걸쳐 전위가 안정화되도록 하며, 이는 일반적으로 5-10분이 소요됩니다. 슬라이스가 세포 외 칼륨 이온 농도에서 과도한 자발적 변화를 보이면 폐기하고 새 슬라이스로 프로세스를 반복합니다. 유발된 칼륨 이온 방출을 측정하려면 자극 아이솔레이터를 통해 전기 자극 트레인을 적용하면서 반응을 디지털 방식으로 기록합니다.10마이크로암페어 자극 진폭에서 시작하여 펄스당 10헤르츠와 1밀리초로 자극을 가합니다. 최대 칼륨 반응 진폭이 감지될 때까지 자극 진폭을 2배씩 증가시킵니다. 반응이 관찰되지 않으면 칼륨 이온 선택성 전극의 위치를 100마이크로미터 단위로 자극 부위에 더 가깝게 이동합니다.칼륨 이온 농도 변화가 전기적으로 활성화된 Shaffer 담보의 활동전위 발화에 의해 매개되는지 확인하기 위해 ACSF에 0.5마이크로몰 TTX를 10분 동안 도포하고 자극 프로토콜을 반복합니다. 유발된 반응은 관찰되어서는 안 됩니다. 되메워진 HEPES 완충 식염수와 칼륨 이오노포어로 전극을 프라이밍한 후, Nernst 방정식에 의해 예측된 방식으로 0.1 - 100밀리몰 보정 범위에서 수조 칼륨 이온 농도의 단계적 변화에 대한 빠른 반응과 수조 칼륨 이온 변화에 대한 선형 반응을 전극에 대해 테스트할 수 있습니다.정상 상태 전위는 선의 기울기를 결정하기 위해 수조 칼륨 이온 농도에 대해 플롯 할 수 있으며, 이는 약 V 58.2 밀리 볼트이어야하며 칼륨 이온 농도의 10 배 변화당 52 밀리 볼트 이상이어야합니다. 칼륨 선택성 전극의 반응성을 추가로 테스트하고 칼륨의 5.5밀리몰 증가에 대한 반응을 약 85밀리초의 상승 및 감쇠 시간 상수로 관찰했습니다. 자극 및 칼륨 이온 선택성 전극이 조직에 배치되고 기록이 안정적인 기준선에 도달하면 전류 진폭이 증가하는 펄스를 적용할 수 있습니다.이 활동의 파형은 기하급수적인 붕괴율로 칼륨의 급격한 증가로 나타나며, 이는 TTX 적용으로 폐지됩니다. 일단 숙달되면 이 기술은 주의깊고 정확하게 수행되면 약 3-4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 정확한 녹음이 가능하도록 전극 팁을 가능한 한 작게 유지하되 낮은 노이즈를 허용할 수 있을 만큼 충분히 크게 유지해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이것은 피라미드 뉴런에서 전기 레코딩을 만드는 목적 organotypic 문화 neocortical 슬라이스 준비를 준비하고 유지하는 프로토콜입니다.

네크로 텍스의 Organotypic 슬라이스 준비에서 전체 셀 녹음

우리는 GABA 활성화된 단일 채널 전류 (GABAA 채널, GABAA 수용체)와 그들이 뉴런의 시냅스 생성과 토닉 전류를 측정하는 패치 - 클램프 기법을 사용합니다. 채널의 활성화는 건강과 질병에의 연결을 흥분을...

랫 뇌 조각의 GABA 활성화된 단일 채널 및 토닉 해류

뉴런 먼저 electrophysiologically 특징입니다. 그런 다음 기록된 신경 세포의 세포질은 aspirated과 신경 전달 물질 합성 효소, 이온 채널, 수용체에 대한 mRNAs의 표현을 감지하기 위해 전사 - PCR 분석을 반대를 받게됩니다.

단일 셀 RT - PCR 기법을 사용 Nigral 뉴런의 전압 - 문이 칼륨 채널 mRNA의 표현을 프로파일

이 비디오는 쥐의 관상 해마 뇌 절편의 전기 자극에 대한 유발 칼륨 이온 농도 역학을 보여줍니다. 바이폴라 자극 전극은 해마의 CA3 영역의 방사선층에 삽입되고, 칼륨-이온 선택 전극은 CA1 방사선층에 배치됩니다. 전기 자극은 활동 전위를 일으켜 칼륨 이온 방출을 일으킵니다. 마지막으로, 억제 분자의 존재 하에서 유발된 칼륨 이온 반응의 부족은 칼륨 이온 농도 역학이 Schaffer 담보의 활동 전위 생성에 기인한다는 것을 확인합니다.

Coronal Hippocampal Slices에서 유발된 칼륨 이온 농도 역학 측정

이 동영상은 이온 선택성 및 이온 영동 미세전극을 사용하여 전기 신호를 측정하고 비교함으로써 뇌 절편의 세포 외 공간을 특성화하는 방법을 보여줍니다. 이 프로세스는 공간의 부피 분율과 비틀림 정도를 결정하는 데 도움이 됩니다.

Ion-Selective and Iontophoresis microelectrodes를 사용한 뇌 절편의 세포외 공간 특성화

우리는 흥분 독성 매개 성 뇌 손상에 관련된 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용될 수있는 뇌 슬라이스 모델을 개발 하였다. 이 기술은 실행 가능한 성숙한 뇌 조직을 생성하고, 부분적으로 손상 신경 회로, 세포 상호 작용과 시냅스 구획을 유지하면서, 실험에 필요한 동물의 수를 줄일 수 있습니다.

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

급성 뇌 절편에서 시냅스로 결합된 뉴런의 패치 클램프 기록 및 동시 세포 내 바이오사이틴 충전을 통해 구조적 및 기능적 특성의 상관 분석을 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목적은 뉴런 미세 회로에서 전기생리학적 기록의 필수 기술 단계와 후속 형태학적 분석을 설명하는 것입니다.

급성 뇌 조각에서 신경 세포의 미세 회로의 전기 생리 및 형태 학적 특성은 페어 패치 클램프 녹음을 사용하여

우리는 뇌 조직의 이온 농도 측정을 위한 두 가지 유형의 이온 선택성 미세 전극(이중 배럴 및 동심원)의 제조, 보정 및 특성을 보여줍니다. 그런 다음 이들은 쥐 해마 절편 준비에 사용되어 흥분 활동이 세포 외 칼륨과 나트륨 농도를 모두 변화시킨다는 것을 보여줍니다.

뇌 조직에서 측정 세포 외 이온의 신호에 대한 두 번 질주과 동심 미소 전극

이 프로토콜에서는 최적화 된 N의 구현을 보여 줍니다.-메 틸-D-glucamine (NMDG) 보호 복구 방법의 뇌 조각 준비. 단일 미디어 공식 안정적으로 다양 한 실험적인 응용 프로그램에 대 한 어떤 나이의 동물에서 건강 한 뇌 조각 얻을 하는 데 사용 됩니다.

최적화 된 N를 사용 하 여 급성 뇌 조각의 준비-메 틸-D-glucamine 보호 복구 방법

Microglia, 두뇌의 거주 면역 세포 그들의 환경의 수정에 형태학 변화 신속 하 게 응답. 이 프로토콜 2 광자 현미경을 사용 하 여 쥐의 급성 뇌 조각에서 세로토닌 또는 ATP microglial 프로세스의 매력을 공부 하는 방법을 설명 합니다.

Microglial 프로세스 매력 ATP 또는 급성 뇌 조각에 세로토닌의 2 광자 영상

성인 인간의 뇌에서 자유롭게 떠있는 슬라이스 문화를 준비하는 프로토콜이 제시된다. 상기 프로토콜은 멤브레인 인서트를 이용한 널리 사용되는 슬라이스 배양 방법의 변형이다. 그것은 간단 하 고, 비용 효율적인, 그리고 단기 측정 을 실행 하기 위한 권장 연령 관련 된 뇌 질환 뒤에 신경 변성의 메커니즘을 해명 하는 것을 목표로.

성인 인간의 뇌에서 단기 자유 부동 슬라이스 문화

배우세요 성인 해마 뇌 조각에서 칼륨 이온 농도 역학을 정량적으로 측정하는 칼륨 이온 선택적 마이크로전극 제작 및 교정 방법을. 이 기술은 중추신경계 칼륨 항상성의 세포 및 분자 메커니즘 연구에 필수적입니다.

만들기, 테스트 및 성인 뇌의 조직 조각에 칼륨 이온 선택적 Microelectrodes를 사용 하 여

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