만들기, 테스트 및 성인 뇌의 조직 조각에 칼륨 이온 선택적 Microelectrodes를 사용 하 여

이 기술의 전반적인 목표는 단극 칼륨 이온 선택성 미세 전극을 만들고, 보정하고, 사용하는 것입니다. 이러한 전극을 사용하면 성인 뇌 절편에서 유발된 칼륨 이온 농도 역학을 정량적으로 평가할 수 있습니다. 이 방법은 중추 신경계에서 칼륨 이온 항상성을 위한 세포 및 분자 메커니즘을 확인하는 것과 같은 생리학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 쉽고 간단한 제조 방법일 뿐만 아니라 미세 전극 센서가 칼륨 이온 농도 측정을 위한 황금 표준을 나타낸다는 것입니다. 실란화를 위해 붕규산 유리 모세관을 준비하려면 50ml 원뿔형 튜브에 넣습니다. 원뿔형 튜브에 1몰 염산을 채우고 유리 모세관을 염산으로 하룻밤 동안 최소 6시간 동안 부드럽게 교반하여 배양합니다.

그 후, 70% 에탄올로 모세혈관을 간단히 헹군 다음 섭씨 100도에서 120도에서 6시간에서 8시간 동안 완전히 건조시킵니다. 세척된 모세혈관을 무수 황산칼슘 건조제가 담긴 용기에 최대 4주 동안 보관한 후 더 사용하십시오. 실란화(silanization)하기 전에 미세 전극 풀러(microelectrode puller)를 사용하여 모세혈관을 미세한 끝으로 당깁니다.

그런 다음 오토클레이브 테이프를 사용하여 미세 전극을 유리 용기에 넣어 전극이 바닥에서 올라가도록 하여 팁 파손을 방지합니다. 다음으로, 질소 대체 방법을 사용하여 용기에서 약 0.5ml의 5%DDS 실란화 용액을 제거합니다. 풍선에 질소 가스를 채우고 주사기 또는 튜브와 바늘을 풍선에 부착합니다.

그런 다음 바늘을 DDS 용기에 삽입하고 더 긴 바늘을 통해 DDS를 별도의 주사기에 그립니다. 그런 다음 실란화 용액을 피펫 끝에 적방울 방향으로 바르고 즉시 용기를 덮습니다. 실란화 용액이 든 미세전극을 담고 있는 용기를 예열된 실험실 오븐에 넣고 섭씨 170-180도에서 10-12시간 동안 또는 섭씨 200-220도에서 30분 동안 놓습니다.

배양 후 오븐에서 플레이트를 꺼냅니다. 접시를 실온의 벤치에 10-15분 동안 놓아 유리 그릇을 식힙니다. 플레이트에서 미세 전극을 제거하고 건조제로 채워진 밀폐 용기에 넣습니다.

수분이 없는 상태로 유지되는 실란화 미세전극은 실란화 후 최대 1주일 동안 사용할 수 있습니다. 전극을 프라이밍하려면 이오노포름 칼륨 칵테일의 원액을 준비하고 실온의 밀폐된 불투명한 용기에 보관하십시오. 다음으로, pH 7.4에서 10 밀리 몰 HEPES 완충 300 밀리 몰 염화나트륨의 원액을 준비합니다.

클램프에 전극을 고정하십시오. 그런 다음 무딘 도구를 사용하여 전극 끝을 약 10-20마이크로미터 너비로 긁어낸 다음 주사기에 연결된 28 게이지 MicroFil 팁을 사용하여 HEPES 완충 염화나트륨으로 전극을 다시 채웁니다. 식염수가 미세 전극 팁의 끝에 도달했는지 관찰하고 미세 전극에 전류의 흐름을 방해할 수 있는 큰 기포가 없는지 확인하십시오.

마이크로피펫을 사용하여 미세전극 끝 근처에 이오노포칼륨을 한 방울 떨어뜨립니다. 전극이 적절하게 실란화되면 물방울이 파손된 팁에 흡수됩니다. 전극에 이오노포칼륨을 약 1mm까지 채우고 티슈를 사용하여 초과분을 제거합니다.

미세 전극을 보정하려면 실험을 시작하기 전에 최소 20분 동안 모든 보정과 95% 산소/5% 이산화탄소로 버퍼 용액을 슬라이스합니다. 분당 3밀리리터의 속도로 4.5밀리몰의 칼륨 이온 함유 ACSF를 수조에 관류하기 시작합니다. 포타슘 이온 선택성 전극을 매니퓰레이터의 전극 헤드스테이지에 부착된 전극 홀더에 놓습니다.

그런 다음 전극의 끝을 수조 관류액에 삽입하십시오. 은/염화은 접지 전극이 동일한 용액에 담겨 있고 흐름이 일정한지 확인하십시오. 교정 용액을 단계적으로 적용하고 전극 팁 전체에서 잠재적인 변화(밀리볼트)를 기록합니다.

다음 솔루션으로 전환하기 전에 전극 팁의 전위가 안정적인 값에 도달할 때까지 기다리십시오. 그런 다음 전극 팁에 대한 교정 용액의 적용에 따른 정상 상태 전압 변화를 측정합니다. 전극 전압 응답의 기울기가 52 이상이고 칼륨 농도의 10배 변화당 59밀리볼트 이하인지 확인합니다.

해마 조각을 준비하려면 두개골의 꼬리 부분에서 2-3cm 절개를 만들어 정중선을 따라 두피를 자릅니다. 두피를 수동으로 집어넣으면서 두개골 측면을 따라 대공에서 1cm 너비로 두 개의 절개를 만듭니다. 그런 다음 가는 가위를 사용하여 두개골 뒤쪽에서 코까지 정중선을 따라 절개합니다.

다음으로, 정중선 근처에 가는 집게를 삽입하고 절개된 두개골을 두 부분으로 집어넣습니다. 두개골에서 쥐의 뇌를 추출하고 칼날을 사용하여 뇌의 꼬리 부분과 꼬리 부분에 각각 위치한 소뇌, 전전두엽 피질 및 후각구를 제거합니다. 그런 다음 Super Glue를 사용하여 뇌 블록을 비브라톰 트레이에 장착합니다.

비브라톰 트레이에 얼음처럼 차가운 절단 용액을 채웁니다. 그런 다음 코로나 평원의 조직 절편을 300마이크로미터 두께로 자릅니다. 일반적으로 4-6개의 관상 해마 절편을 채취할 수 있습니다.

각 섹션을 자른 후 즉시 섭씨 32-34도로 예열된 슬라이스 보관 비커로 슬라이스를 옮깁니다. 기록하기 전에 최소 20-30분 동안 섹션이 있는 비커를 실온으로 옮기기 전에 섹션을 이 온도로 유지하십시오. 칼륨 이온 역학을 측정하려면 파스퇴르 피펫을 사용하여 뇌 조각을 욕조에 부드럽게 넣고 나일론 현이 있는 백금 하프로 부드럽게 제자리에 고정합니다.

바이폴라 자극 전극의 끝이 서로 거의 평행하고 슬라이스의 평지와 수평인지 확인하십시오. 5-7초 동안 약 40-50마이크로미터 깊이의 CA3 방사선층에 전극을 천천히 삽입하여 Schaffer 담보를 자극합니다. 그런 다음 약 3-4초에 걸쳐 전극을 천천히 내려 CA1 방사층에 약 50마이크로미터 깊이까지 칼륨 이온 선택성 전극을 조심스럽게 삽입합니다.

슬라이스에 자극을 가하기 전에 전극 전체에 걸쳐 전위가 안정화되도록 하며, 이는 일반적으로 5-10분이 소요됩니다. 슬라이스가 세포 외 칼륨 이온 농도에서 과도한 자발적 변화를 보이면 폐기하고 새 슬라이스로 프로세스를 반복합니다. 유발된 칼륨 이온 방출을 측정하려면 자극 아이솔레이터를 통해 전기 자극 트레인을 적용하면서 반응을 디지털 방식으로 기록합니다.

10마이크로암페어 자극 진폭에서 시작하여 펄스당 10헤르츠와 1밀리초로 자극을 가합니다. 최대 칼륨 반응 진폭이 감지될 때까지 자극 진폭을 2배씩 증가시킵니다. 반응이 관찰되지 않으면 칼륨 이온 선택성 전극의 위치를 100마이크로미터 단위로 자극 부위에 더 가깝게 이동합니다.

칼륨 이온 농도 변화가 전기적으로 활성화된 Shaffer 담보의 활동전위 발화에 의해 매개되는지 확인하기 위해 ACSF에 0.5마이크로몰 TTX를 10분 동안 도포하고 자극 프로토콜을 반복합니다. 유발된 반응은 관찰되어서는 안 됩니다. 되메워진 HEPES 완충 식염수와 칼륨 이오노포어로 전극을 프라이밍한 후, Nernst 방정식에 의해 예측된 방식으로 0.1 - 100밀리몰 보정 범위에서 수조 칼륨 이온 농도의 단계적 변화에 대한 빠른 반응과 수조 칼륨 이온 변화에 대한 선형 반응을 전극에 대해 테스트할 수 있습니다.

정상 상태 전위는 선의 기울기를 결정하기 위해 수조 칼륨 이온 농도에 대해 플롯 할 수 있으며, 이는 약 V 58.2 밀리 볼트이어야하며 칼륨 이온 농도의 10 배 변화당 52 밀리 볼트 이상이어야합니다. 칼륨 선택성 전극의 반응성을 추가로 테스트하고 칼륨의 5.5밀리몰 증가에 대한 반응을 약 85밀리초의 상승 및 감쇠 시간 상수로 관찰했습니다. 자극 및 칼륨 이온 선택성 전극이 조직에 배치되고 기록이 안정적인 기준선에 도달하면 전류 진폭이 증가하는 펄스를 적용할 수 있습니다.

이 활동의 파형은 기하급수적인 붕괴율로 칼륨의 급격한 증가로 나타나며, 이는 TTX 적용으로 폐지됩니다. 일단 숙달되면 이 기술은 주의깊고 정확하게 수행되면 약 3-4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 정확한 녹음이 가능하도록 전극 팁을 가능한 한 작게 유지하되 낮은 노이즈를 허용할 수 있을 만큼 충분히 크게 유지해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.