Name: 꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 학습하세요 Caenorhabditis elegans 생식 핵, 단백질 분포, 골격 구조의 자동 3D 재구성 방법을. 공초점 현미경 이미징과 표면 분석 도구를 활용하여 분석 시간을 단축하고 인간 오류를 최소화합니다.

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우리는 그들의 기술 지원에 대 한 모나 쉬 Microimaging 감사합니다. 일부 변종 꼬마 유전학 센터, 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 NIH 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다. 이 작품 모나 쉬 대학 의학 발견 친목, NHMRC 프로젝트 그랜트 (GNT1105374), NHMRC 수석 연구 친교 (GNT1137645)와 veski 혁신 친교에 의해 지원 되었다: 로저 Pocock VIF 23.

1. 준비 및 웜 농업
참고: 모든 제품 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
<ol><li>OP50 대장균 문화: Lysogeny 국물 (파운드) (1% tryptone 0.5% 효 모, 0.5 %NaCl, pH 7.0) 항생제 없이 37 ° C에서 하룻밤에 OP50 박테리아 문화.</li>
	<li>선 충 류 성장 미디어 (NGM) 판 (1.5 g의 NaCl, 한 천, 펩, 1 M CaCl2, 에탄올, 1 M MgSO4 의 1 mL에에서 5 mg/mL 콜레스테롤의 1 mL의 1 mL의 1.25 g의 8.5 g OP50 박테리아의 400 µ L 씨 고 1 M KPO4 버퍼의 25 mL)와 공기 건조 48 h에 대 한 박테리아.</li>
	<li>시드 NGM 접시에 벌레를 선택 하 고 15 ° C 또는 20 ° C에서 품 어<ol>
<li>성인 자웅 동체 생식의 분석을 위해 잘 먹이 L4 벌레 세균 잔디를 선택 하 고 20 ° c.에서 밤새 품 어</li>
		<li>광고에 나온 것에 정자 수를 점수, 12 h 20 ° C에서 L4 벌레 벌레 L4/성인 탈피에 도달할 때까지 품 어. 동기화 하려면 L4 단계에 벌레, 표 백제 솔루션 (1 M NaOH와 1:1 비율에서 표 백제) 계란의 많은 성인 벌레를 수확 하 여 계란을 준비 합니다. 계란 해치 고 L4 동물 실험에 대 한 선택 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>슬라이드에서 폴 리-L-리 신 솔루션의 25 µ L를 놓고 피 펫 팁을 사용 하 여 솔루션 잘, 확산 테 플 론 현미경 슬라이드를 준비 합니다. 초과 폴 리-L-리 신 종이 타월로 제거 후 건조 한 공기를 품 어 15-20 분 동안 65 ° C에서 슬라이드 슬라이드 수 있습니다.</li>
</ol>2. 생식 해 부와 얼룩6,13
<ol><li>10 µ L 22 × 22mm coverslip에 0.01 %tetramisole (마 취)의 자리 고 그것으로 한-하루 오래 된 성인 벌레를 선택 합니다.</li>
	<li>(5 mL) 주사기 및 바늘 (24 "x 1")를 사용 하 여 진정 된다 그것으로 꼬리에 벌레를 해 부하 고는 생식 손상 되지 않은 확인 합니다. 주: 해 부 웜은 웜 및 웜 움직임에 부정적인 압력은 생식의 방출 원조를 마비 완전히 된다 전에 밖으로 실행 되어야 한다. 정자, 득점을 위한 해야 합니다 주의 spermatheca 손상 않기로 바늘에 의해 해 부 동안. spermatheca 후 절 개 포인트를 제외 하 고 바늘으로는 생식을 만지지 마십시오. 생식 구획에 휴식 또는 어떤 방전은 생식에서 관찰, 경우는 생식 분석을 위해 사용할 수 없습니다 한다.</li>
	<li>폴 리-L-리 신 코팅된 슬라이드, 슬라이드에 해 부 생식 유지에 거꾸로 coverslip를 놓습니다.</li>
	<li>1 분 빠르게 바늘을 사용 하 여 슬라이드에 germlines와 함께 하는 coverslip 제거 위해 액체 질소에 coverslip, 다음 장소 슬라이드의 모서리에 종이 타워를 배치 하 여는 coverslip에서 과잉 액체를 제거 합니다.</li>
	<li>슬라이드는 챔버에 30-60 s-20 ° C 메탄올으로 전송 다음 갓된 고정 솔루션 (버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 포함 0.08 M HEPES pH 6.9, 1.6 m m MgSO4, 0.8 m m 에틸렌 글리콜-bis(beta-aminoethyl x 1에서에서 30 분 동안 품 어 에테르)-N, N, N', N'-tetraacetic (EGTA), 산과 3.7 %paraformaldehyde) 실내 온도에.</li>
	<li>1 x PBS, pH 7.4 포함 된 챔버에 배치 하 여 슬라이드를 씻어 0.1 %10 분에 대 한 트윈-20이 단계를 반복이 한 번.</li>
	<li>차단 솔루션 차단 30 µ L로 germlines (염소 혈 청의 1700 µ L에서 염소 혈 청의 900 µ L을 추가 하 여 준비의 30 %h 조2O를 증 류와 10 x PBS의 300 µ L) 30 분 동안 실내 온도에 플라스틱 상자에 젖은 종이 수건을 배치 하 여 준비 하는 습 한 실에.</li>
	<li>REC-8 항 체 솔루션 각 샘플 비율 1:300에 30% 염소 혈 청에서 준비의 50 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에서 밤새 품 어</li>
	<li>슬라이드를 씻어 0.1 %1 x PBS를 포함 하는 챔버에 배치 하 여 10 분에 대 한 트윈-20 단계를 한 번 반복 하 고 슬라이드의 모서리에 종이 타월을 배치 하 여 과잉 액체를 제거.</li>
	<li>30% 정상 염소 혈 청에서 녹색 fluorophore (488 nm 방출 파장) 활용된 2 차 항 체 (1:1000), phalloidin (말라 얼룩, 1:4000), 및 (DNA 얼룩, 1:4000) DAPI를 diluting 하 여 이차 항 체 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>슬라이드에 이차 항 체 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 1 h에 품 어.</li>
	<li>슬라이드를 씻어 두 번 0.1 %1 x PBS를 포함 하는 챔버에 배치 하 여 10 분에 대 한 트윈-20 초과 액체 닦아.</li>
	<li>고정 슬라이드에 시 약 30 µ L을 추가 하 고 1.5 µ m coverslip x 12 m m2 위에 놓고 하룻밤 4 ° C에서 슬라이드를 건조.</li>
</ol>3. confocal 현미경 검사 법
<ol><li>Confocal 현미경, 레이저, 공명 스캐너 및 confocal 현미경 소프트웨어 설정. 63 X 목표 위에 슬라이드 홀더에 얼룩진된 germlines와 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>생식, 포커스는 생식 상단 찾아서 confocal 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 표시 합니다. 비슷하게는 생식의 하단에 집중 하 고 총 생식 두께 설정 표시.</li>
	<li>0.5 µ m. 마크 완전 한 생식 그리고 시작 인수까지 각 슬라이스의 두께 정의 하 여 전체 생식 이미지. 각 슬라이스 8 번 스캔 하 고 이미지 품질을 개선 하기 위해 값을 평균. 공명 스캐너 이미징 동안 표백 방지 하려면 빠른 검색 허용 됩니다. 만약 현미경 공명 스캐너, 표백을 피하기 위해 4 검사의 수를 줄일 수는 없습니다.</li>
</ol>4. 게시물 이미징 분석 핵의 수와 분포
참고: 소프트웨어 도구와 사용 하는 버튼의 스크린샷을 위한 보충 그림 1 을 참조 하십시오.
<ol><li>8.4.1 Imaris 또는 소프트웨어의 이미지를 가져옵니다.</li>
	<li>각 지역에서 핵 형태를 식별 하 여 mitotic 지역, 전이 영역, meiotic 지역, oocyte 지역, 그리고 spermatheca는 생식의 정의.</li>
	<li>소프트웨어의 표면 기능 버튼 (보충 그림 1A)를 사용 하 여 관심 영역을 선택 합니다.</li>
	<li>자동 표면 생성 마법사를 취소 하 고 수동으로 3 차원 스택에서 이미지의 첫 번째 및 마지막 조각에서 관심 영역을 그립니다.</li>
	<li>만들기 화면을 클릭 합니다. 참고: 소프트웨어를 자동으로 첫 번째 및 마지막 스택 간의 스택을 개발할 것입니다.</li>
	<li>DAPI 제외 하 고 모든 채널 마스크 채널 버튼 (보충 그림 1B-C)를 클릭 하 여 마스크.</li>
	<li>자리 기능 버튼 (보충 그림 1A)를 사용 하 여 핵 크기 매개 변수를 정의 합니다. Mitotic 지역에 대 한 Z 직경 정의 하면서 2 µ m의 XY 직경을 정의 합니다. 전환 영역에 대 한로 1.5 µ m. (보충 그림 1D) 2 µ m의 XY 직경 및 Z 직경을 정의 합니다. 참고: 확대 및 현미경의 사양에 따라 직경을 해결 합니다. 현재 프로토콜에 대 한 사용 하는 목적은 63 X 되었고 추가 이미징 동안 1.70 배 확대를 제공. 목표 변경, 예를 들어 40 X, 직경 적절 하 게 변경 한다. 올바른 매개 변수를 설정 하려면 wildtype germlines와 문제 해결을 수행 합니다. 야생 유형 생식 팔의 mitotic 지역은 약 250 핵 있다. 지름이이 값을 달성 하도록 수정 한다. 적어도 15 germlines를 사용 하 여 직경에 대 한 최적의 값을 확인 하. 이와 비슷한 방식은 전환 영역 (150-170 핵)와 meiotic 지역 (600-700 핵) 보정을 위해 사용 되어야 한다.</li>
	<li>최소 임계값 (보충 그림 1E)를 정의 하 여 관광 명소의 검색을 제한 합니다. DAPI를 사용 하 여 첫 번째 자리는 생식 외부 표시 될 때까지 최소 3 차원 렌더링 임계값을 늘려 최소 임계값을 설정 하는 야생 타입 germlines 스테인드.</li>
	<li>이미지를 저장 하 고 소프트웨어에 의해 자동으로 생성 하는 테이블에서 핵의 수를 얻을. TIF 파일로 이미지를 내보냅니다.</li>
</ol>5. 게시물 점수 정자 염색체 수에 대 한 분석 영상
<ol><li>관심 영역으로는 spermatheca를 선택 하 여 3 차원 렌더링을 수행 합니다. 각 정자를 감지, 0.75-사이 반점 직경 정의 1.0 µ m x 및 Y 축, Z 지름은 정의 되지 않은 유지 하는 동안. 관광 명소 기능 버튼을 사용 하 여 보충 그림 1에서 보듯이.</li>
	<li>백그라운드 체크 함으로써 배경 빼기 빼기 상자 및 배경 보정 값 (보충 그림 1D) 소프트웨어에 의해 계산을 사용 하 여. 참고: Imaris 소프트웨어 추천 강도 높은 포인트 먼저, 따라서 배경 효과 최소한의 상당한 차이가 관심 영역 및 배경으로. 두 번째 방법은 이다 배경에 대 한 배경 보정을 수동으로 정의 적절 한 값을 지정할 수 있습니다. 수동 배경 교정 독립적인 샘플의 강도 비교를 요구 하는 경우 적절 한 될 것입니다.</li>
	<li>Spermatheca (보충 그림 1E)에서 모든 DAPI 스테인드 정자를 검출 하기 위하여 3 차원 렌더링 임계값을 조정 합니다.</li>
	<li>염색체, 계산에 대 한 정의 자리 직경 < x 0.75 µ m 및 Y-축 3 차원 모델을 개발 하기 전에.</li>
	<li>이미지를 저장 하 고 TIF 파일로 내보내기.</li>
</ol>6. 포스트는 생식의 Cytoskeletal 재건에 대 한 분석 영상
<ol><li>생식에 관심 영역을 식별 하 고 phalloidin 제외 하 고 모든 채널을 채널 마스크 버튼을 클릭 하 여 마스크.</li>
	<li>표면 기능 버튼 (보충 그림 1)를 사용 하 여 0.25 µ m의 표면 세부 정보를 정의 합니다. 참고:이 모든 0.25 µ m으로 3 차원 모델 렌더링 됩니다 의미 합니다. 표면 디테일 3 차원 표면 모델 마다 0.25 µ m에 대 한 생성 하는 것입니다 어디는 생식의 모든 지역에 대 한 일정 수 있습니다. 그러나, oocyte 지역에 대 한 표면 세부 수 수 증가 0.35-0.5 µ m이이 지역에서 잘 정의 된 걸 섬유의 존재 때문.</li>
	<li>백그라운드 체크 함으로써 배경 빼기 빼기 상자 및 배경 보정 값 (보충 그림 1D) 소프트웨어에 의해 계산을 사용 하 여.</li>
	<li>분석 (보충 그림 1E)을 필요로 하는 구조에 따라 3 차원 렌더링 임계값을 조정 합니다.</li>
	<li>개발 된 3 차원 이미지를 저장 하 고는 TIF 파일로 내보내기.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 관심의 충돌을 선언합니다.

이 프로토콜의 목표는 정확도 개선 하 고 생식 분석에 필요한 시간을 줄일 것입니다. 준비 후에 표준 해 부 germlines의, 생식 핵의 3 차원 모델 렌더링 계산에 의해 준비 된다. 공간에 생식 핵 분포의 관찰 하면서 3 차원 렌더링은 생식의 특정 지역에서 핵의 수를 계산 합니다. 우리의 방법의 중요 한 측면 핵의 크기와 모양 매개 변수의 정확한 정의 이다. 이 얼룩이 지 고 사용 확대의 선명도에 따라 이미지를. 우리는 게시 된 데이터를 수동으로 분석1에 비교 하 여 방법의 정확성을 확인 했다. 더욱 우리의 방법의 정확도 확인, 우리 다른 조건 하에서 여러 돌연변이 사용 하 고 게시 된 문학으로 결과 확인. 그것은 또한 미묘 하 고 강한 고기-감지 하는 방법의 능력을 확인 cpb-3 및 glp-1 돌연변이, 각각. 또한,이 방법은 핵 크기와 형태는 생식 또는 심지어 긴장 사이 변화에 적응력을 보여줍니다. 이 속성은 또한 id 및 염색체와 정자 등 생식...

포유류와 경로 신호의 보존은 C. 선 충 여러 생물 학적 과정1,2를 공부 하는 우수한 모델. 우리의 실험실 사용 하 여 선 충 C. 생식 줄기 세포 개발, apoptosis, 유전자 발현 연구. 생식은 3 차원 구조, 많은 학문은 2 차원 3 차원 분석의 시간과 노동 집약적인 특성상. 2 차원 분석 vivo에서 이벤트는 생식에 허위로 수 있습니다 매우 높습니다. C. 선 충 성인 남녀 추 니 두 생식 팔, 각각의 집 체세포 원심 끝 셀 (DTC)는 미 분화 상태3,4원심 세균 세포를 유지 하는. 이 세균 세포 차별화 영향력, 탈출 DTC에서 이동 하는 시작 되 고 해지고 oocytes 정자로는 생식의 근 위 끝에 도달. 이 과정 동안, 생식 세포 핵 유사 분열, 감수 분열5,6에 전환 하기 전에 받아야. 정자 생산 후 oocytes는 성인 기 동안 생산 개발의 애벌레 단계 4 (L4)에 의해 완료 된다. 정자는 어디 그들은 비 옥 하 게 배아를 생성 하기 위해 oocytes spermatheca에 저장 됩니다.
핵의 수, apoptotic 이벤트, 염색체 역학, 고 단백질 식 및 지역화7 수에 변화 결과로 C. 선 충 에서 생식 개발에 영향을 미칠 수 있는 여러 유전과 환경 요인이 있다 ,,89,,1011. 이러한 이벤트의 분석 핵 형태와 분포에 따라 차별화의 각 단계의 식별을 해야 합니다. 큰 샘플 크기와 수동으로 이러한 매개 변수를 정확 하 게 분석 이며 노동 집약적인 시간이 걸리는. 이러한 단점을 우회 하 고 분석의 일관성 있도록, 우리 세 핵, 핵 배포, 단백질 표정, 선 충 C. 생식의 3 차원 검사를 위한 자동화 된 방법을 개발 및 cytoskeletal 구조입니다. 3 차원 렌더링 confocal 현미경 검사 법을 결합 하 여 세균 세포 분화의 단계 각의 식별에 대 한 크기와 모양 매개 변수를 생성 했습니다. 또한,이 메서드는 생식 세포 핵과 정자의 세 플러스 각 oocyte에서 염색체 수의 득점 수 있습니다.
1 개의 중요 한 구조는 생식 생식 구획, 에이즈 세포질 스트리밍 및 생식 핵12보호 안정성을 제공 하는 골격 이다. 전산 렌더링을 사용 하 여, 우리는 생식 세포 골격의 3 차원 재구성을 수행 하 고 뚜렷한 cytoskeletal는 생식 기능을 식별. 여기, 우리가 어떻게 계산 분석 confocal 이미징 수 있도록 포괄적인 분석 C. 선 충 생식의 결합을 설명 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다.
C. 선 충 의 생식 (그림 1)의 3 차원 분석을 위한 빠른 방법을 제안 한다. 3 차원 분석을 사용 하 여, 그것은 셀 (그림 2), 생식 세포 골격 ( 의 개조의 자동화 (그림 2 및 그림 3), 생식 핵의 3 차원 분포 계산 공부 가능 그림 3), 단백질 (그림 4), 그리고 점수는 spermatheca에 정자와 oocytes (그림 5)에서 염색체의 수의. 메서드는 생식의 쉽고 정확한 정량화를 가능 하 게 뿐만 아니라 생리 적으로 관련 된 고기를 식별.

<table><tbody><tr><td>C. elegans 균주: 야생형 (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?( q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III&nbsp; </td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli 박테리아</td><td>수제</td><td></td><td></td></tr><tr><td>선충 성장 매체 (NGM) 플레이트</td><td>수제</td><td></td><td></td></tr><tr><td>다클론 토끼 anti-REC-8&nbsp;</td><td>SDIX</td><td>29470002</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 염소에서 생성된 복합 항체</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A-21236</td><td></td></tr> 세포골격 <tr><td>염료 팔로이딘;</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>A-12380</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>써모피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>테트라미솔&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES 버퍼, pH 7.4&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>G0887</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS pH 7.4&nbsp;</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>트윈-20&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1389</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>37% 파라포름알데히드 용액</td><td>Merck Millipore</td><td>1040031000</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield 고정 시약&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>에탄올&nbsp;</td><td>밀리포어&nbsp;</td><td></td><td></td>1009832511</tr><tr><td>메탄올</td><td>시그마 Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>20&deg; C & 25도; C인큐베이터&nbsp;</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr>의 <tr><td>광학 현미경</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr>의 <tr><td>컨포칼 현미경&nbsp; &nbsp;</td><td>모든 브랜드(Leica, Zeiss)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 슈트 8.4.1 이상 버전이 장착된 컴퓨터, 소프트웨어 및 Matlab 소프트웨어를 사용할 수 있는 정식 라이선스.</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phospho 버퍼링 식염수, pH 7.4</td><td>집에서 만든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>테플론 현미경 슬라이드&nbsp;</td><td>텍돈&nbsp;</td><td>&nbsp; 941-322-8288</td><td></td></tr></tbody></table>

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

꼬마 선 충 (C. 선 충) 생식 줄기 세포 개발, apoptosis, 및 염색체 역학을 포함 하 여 몇몇 생물학으로 중요 한 과정을 공부 하는 데 사용 됩니다. 동안에 생식은 우수한 모델, 분석은 종종 2 시간 및 3 차원 분석에 필요한 노동 차원. 이러한 연구에 주요 정보는 핵 및 단백질 분포는 생식 내 번호/위치. 여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 전산 접근을 사용 하 여 수는 생식의 각 지역에서 핵의 위치를 결정 하는 생식의 자동화 된 분석을 수행 하는 방법을 제시. 우리의 방법은 또한 다른 유전 배경의 단백질 식의 3 차원 검사를 가능 하 게 생식 단백질 분포를 분석 합니다. 또한, 우리의 연구는 특정 공간 발달 요구를 수용할 수 있는 생식의 고유 영역에서 cytoskeletal 건축에 변화를 보여줍니다. 마지막으로, 우리의 메서드는 각 생식의 spermatheca에 정자의 자동화 된 계산 수 있습니다. 함께 찍은, 우리의 메서드는 C. 선 충 생식의 신속 하 고 재현성 phenotypic 분석을 수 있습니다.

그림 1 3 차원 생식 분석에 필요한 시간을 나타냅니다. 20 ° C에서 incubated L4 광고에 나온 것 germlines를 분리 해 부 되었고 DAPI, phalloidin, 및 생식 단백질에 대 한 항 체와 스테인드. Germlines는 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데. 얼룩 그리고 confocal 현미경 검사 법 완전 한 생식 필요 수 핵의 위치를 계산, 단백질 분포를 식별, 분석 cytoskeletal 구조와 점수를 10-15 분 약 24 h. 전산 분석 필요는 정자의 수입니다. 완전 한 수동 분석 생식 당 2 시간 이상 필요 연산자 영향에 따라, 따라서, 자동화 된 우리의 높은 처리량 방법 분석 시간 단축 및 재현성을 향상 시킵니다.
자동 핵 생식 팔 집 약 1000-12...

우리 꼬마 선 충 의 생식. 의 3 차원 재구성 자동화 된 방법을 제시합니다 우리의 방법 수와 생식 및 분석 생식 단백질 분포 및 cytoskeletal 구조 내에서 각 핵의 위치를 결정합니다.

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

이 방법의 전반적인 목표는 Caenorhabditis elegans 생식세포 분석을 자동화하여 핵, 단백질 및 세포골격 분포를 연구하는 것입니다. 이 방법은 핵과 정자의 수, 핵 분포 및 생식세포의 세포골격 구조에 대한 C.Elegans 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 분석 시간을 단축하고 샘플 크기를 늘리며 수동 분석과 관련된 인적 오류를 제거한다는 것입니다.샘플을 이미지화하려면 염색된 생식세포가 있는 슬라이드를 컨포칼 현미경의 63X 대물렌즈 위에 있는 슬라이드 홀더에 놓고 생식세포를 찾습니다. 생식세포의 상단에 초점을 맞추고 컨포칼 현미경 소프트웨어로 표시합니다. 총 생식계열 두께가 설정되면 각 슬라이스의 두께를 최대 0.5마이크로미터까지 정의하고 전체 생식계열을 표시합니다.그런 다음 획득을 시작하여 각 슬라이스를 8번 스캔하고 값의 평균을 구하여 이미지 품질을 개선합니다. 모든 이미지를 얻었으면 이미지를 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램으로 가져오고 표면 기능 도구를 사용하여 유사 분열 영역을 선택합니다. 생식세포의 말단 끝 이미지가 나타납니다.자동 곡면 생성 마법사를 취소하고 3차원 스택에서 이미지의 첫 번째 및 마지막 슬라이스에 있는 유사분열 영역 주위에 관심 영역을 수동으로 그립니다. Create Surface를 클릭한 다음 Mask Channel을 클릭하여 DAPI 채널을 제외한 모든 채널을 마스킹합니다. spot function 도구를 사용하여 XY 지름이 2마이크로미터이고 Z 지름이 정의되지 않은 유사분열 영역의 크기 매개변수를 정의합니다.배경 빼기를 클릭하여 배경을 뺍니다. 최소 임계값을 정의하려면 첫 번째 지점이 생식세포 외부에 나타날 때까지 DAPI 염색 야생형 생식계열에서 최소 3D 렌더링 임계값을 늘리고 각 영역에 대한 3D 모델을 생성합니다. 이미지를 저장한 후 테이블을 클릭하여 소프트웨어에 의해 자동으로 생성된 핵 수를 보고 이미지를 TIFF 파일로 내보냅니다.변환 영역의 경우 앞에서 설명한 대로 표면을 만듭니다. 그런 다음 마스크 채널을 클릭하여 DAPI 채널을 제외한 모든 채널을 마스킹합니다. 스폿 기능을 사용하여 2마이크로미터의 XY 지름과 1.5마이크로미터의 Z 지름을 정의하고 배경 빼기를 클릭하여 배경을 뺍니다.최소 임계값을 정의하려면 첫 번째 지점이 생식세포 외부에 나타날 때까지 DAPI 염색 야생형 생식계열에서 최소

computational-analysis-caenorhabditis-elegans-germline-to-study

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

여기에서는 예쁜꼬마선충의 발달 과정을 추적하고 정량화하는 방법을 보여줍니다. 제시된 방법은 쉽게 구현할 수 있는 오픈 소스 도구를 기반으로 합니다. 3D 세포 모양 모델을 재구성하는 방법, 세포 내 구조를 수동으로 추적하는 방법, 피질 수축 흐름을 분석하는 방법을 보여줍니다.

의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

우리는 해부 C.에서 활동 ERK의 공간과 시간 현지화에 대한 면역 형광 이미징 기반의 방법을 제시한다 간스의 생식선. 여기에 설명 된 프로토콜 C. 어떤 시그널링 시각화 또는 구조 단백질을 적용 할 수있다 엘레 생식선은 적절한 항체 시약을 사용할 제공했다.

활성 ERK의 공간 및 시간 분석<em&gt; C. 엘레</em&gt; 생식선

투명 한 선 충 C. 소장"vivo에서 조직 챔버를" 다세포 tubulogenesis 동안 단일 세포 및 subcellular 수준 apicobasal 막과 루멘 속 공부에 대 한 될 수 있습니다. 이 프로토콜 표준 라벨을 결합 하는 방법을, RNAi/손실의 기능 유전자 및 분자 수준에서이 프로세스를 해 부 현미경 접근에 설명 합니다.

C. 선 충 장 한 모델으로 루멘 Morphogenesis 세포를 단일 세포 수준에서 Vivo에서 편광 막 속: 항 체 얼룩이 지기, RNAi 손실의 기능 분석 및 이미징 라벨

이 연구는 자유롭게 사용할 수있는 이미지 처리 도구를 사용하여 C. elegans에서 시냅스 크기와 현지화, 근육 형태 및 미토콘드리아 모양의 정량적 측정을 설명합니다. 이 접근은 C. elegans에 있는 미래 연구 결과가 유전 돌연변이 결과로 조직과 세포기관 구조 변경의 넓이를 정량적으로 비교하는 것을 허용합니다.

예쁜꼬마선충의 세포구조와 세포세포형태를 연구하기 위한 정량적 접근법

이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

이 프로토콜은 C. elegans 생식선에서 의한 체르메게에서 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위한 근접 결찰 분석법의 사용을 입증한다.

근접 결찰 분석술을 사용하여 C. 예쁜꼬마선에서 리보뉴클레오 단백질 복합어셈블리의 시투 검출

이것은 항체 염색을 통해 면역형광을 위한 생식계열 샘플을 생성하거나 DNA를 시각화하기 위한 간단한 DAPI 염색을 위해 C. elegans 생식선 해부 후 동결 균열에 일반적으로 사용되는 방법입니다. 이 프로토콜은 연구실과 과정 기반 학부 연구 경험의 학부생에게 성공적이었습니다.

C. 엘레 간스 면역형광 및 DAPI 염색을 위한 생식선 해부 및 동결 균열

여기에서는 ImageJ와 같은 이미지 분석 소프트웨어에서 후속 사용을 위해 광시야 현미경 이미지에서 개별 웜의 자동 분할을 위해 개발한 딥 러닝 시스템인 SegElegans를 효과적으로 활용하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 온라인과 오프라인 모두에서 시스템을 사용할 수 있는 방법을 제공합니다.

SegElegans를 사용한 C. elegans 형광 이미지의 자동 분석

학습하세요 Caenorhabditis elegans 생식 핵, 단백질 분포, 골격 구조의 자동 3D 재구성 방법을. 공초점 현미경 이미징과 표면 분석 도구를 활용하여 분석 시간을 단축하고 인간 오류를 최소화합니다.

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

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