꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

이 방법의 전반적인 목표는 Caenorhabditis elegans 생식세포 분석을 자동화하여 핵, 단백질 및 세포골격 분포를 연구하는 것입니다. 이 방법은 핵과 정자의 수, 핵 분포 및 생식세포의 세포골격 구조에 대한 C.Elegans 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 분석 시간을 단축하고 샘플 크기를 늘리며 수동 분석과 관련된 인적 오류를 제거한다는 것입니다.

샘플을 이미지화하려면 염색된 생식세포가 있는 슬라이드를 컨포칼 현미경의 63X 대물렌즈 위에 있는 슬라이드 홀더에 놓고 생식세포를 찾습니다. 생식세포의 상단에 초점을 맞추고 컨포칼 현미경 소프트웨어로 표시합니다. 총 생식계열 두께가 설정되면 각 슬라이스의 두께를 최대 0.5마이크로미터까지 정의하고 전체 생식계열을 표시합니다.

그런 다음 획득을 시작하여 각 슬라이스를 8번 스캔하고 값의 평균을 구하여 이미지 품질을 개선합니다. 모든 이미지를 얻었으면 이미지를 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램으로 가져오고 표면 기능 도구를 사용하여 유사 분열 영역을 선택합니다. 생식세포의 말단 끝 이미지가 나타납니다.

자동 곡면 생성 마법사를 취소하고 3차원 스택에서 이미지의 첫 번째 및 마지막 슬라이스에 있는 유사분열 영역 주위에 관심 영역을 수동으로 그립니다. Create Surface를 클릭한 다음 Mask Channel을 클릭하여 DAPI 채널을 제외한 모든 채널을 마스킹합니다. spot function 도구를 사용하여 XY 지름이 2마이크로미터이고 Z 지름이 정의되지 않은 유사분열 영역의 크기 매개변수를 정의합니다.

배경 빼기를 클릭하여 배경을 뺍니다. 최소 임계값을 정의하려면 첫 번째 지점이 생식세포 외부에 나타날 때까지 DAPI 염색 야생형 생식계열에서 최소 3D 렌더링 임계값을 늘리고 각 영역에 대한 3D 모델을 생성합니다. 이미지를 저장한 후 테이블을 클릭하여 소프트웨어에 의해 자동으로 생성된 핵 수를 보고 이미지를 TIFF 파일로 내보냅니다.

변환 영역의 경우 앞에서 설명한 대로 표면을 만듭니다. 그런 다음 마스크 채널을 클릭하여 DAPI 채널을 제외한 모든 채널을 마스킹합니다. 스폿 기능을 사용하여 2마이크로미터의 XY 지름과 1.5마이크로미터의 Z 지름을 정의하고 배경 빼기를 클릭하여 배경을 뺍니다.

최소 임계값을 정의하려면 첫 번째 지점이 생식세포 외부에 나타날 때까지 DAPI 염색 야생형 생식계열에서 최소 3D 렌더링 임계값을 늘리고 각 영역에 대한 3D 모델을 생성합니다. 이미지를 저장한 후 테이블을 클릭하여 소프트웨어에 의해 자동으로 생성된 핵 수를 보고 이미지를 TIFF 파일로 내보냅니다. 정자 수를 점수화하려면 핵 영역에 대해 설명된 대로 정자를 관심 영역으로 선택하고 스폿 기능 도구를 사용하여 정의되지 않은 Z 직경으로 0.75에서 1마이크로미터 사이의 XY 직경을 정의하여 각 정자를 감지합니다.

배경 빼기 상자를 선택하고 소프트웨어에서 계산한 배경 보정 값을 사용하여 배경을 뺍니다. 그런 다음 3D 렌더링 임계값을 조정하여 정자에서 DAPI로 염색된 모든 정자를 검출합니다. 난모세포의 염색체 계수를 위해 난모세포를 선택하고 XY 직경을 0.75마이크로미터 미만으로 정의하고 3D 모델을 개발하기 전에 임계값을 정의합니다.

그런 다음 내보낼 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다. 세포골격 생식세포 재건을 위해 생식세포에서 관심 있는 유사분열 영역을 식별하고 이전에 입증된 바와 같이 표면 마스크를 만듭니다. 마스크 채널을 클릭하여 팔로이딘 채널을 제외한 모든 채널을 마스킹하고 표면 기능 도구를 사용하여 0.25마이크로미터의 표면 디테일을 정의합니다.

배경을 뺀 후 3D 렌더링 임계값을 조정하여 현상된 3D 이미지를 TIFF 파일로 내보내기 위해 저장합니다. 핵 분포는 분화 단계에 따라 달라집니다. 예를 들어, 유사분열 영역(mitotic region)에서 내부 액틴(actin)은 핵이 조직되어 있는 고체 덩어리로 나타납니다.

야생형 생식세포에서 유사분열 영역에는 약 250개의 핵이 포함되어 있으며 나머지 생식세포에 비해 핵으로 단단히 채워져 있습니다. 그러나 핵이 원위 끝에서 멀어짐에 따라 생식세포의 둘레에 더 가깝게 나타나며, 분포의 변화는 전이 영역에서 시작하여 핵이 감수분열에서 전치기의 세 번째 단계에 들어갈 때 끝납니다. 전이 영역에서 생식계열 내부 액틴은 더 원통형 구조를 가정하고 pachytene에 도달함에 따라 속이 빈 원통이 됩니다.

액틴의 두 번째 층은 내부 층을 덮고 생식세포를 형성합니다. 실린더 액틴 구조 내의 이 실린더는 난모세포 영역을 향해 사라지며, 이 시점에서 액틴은 난모세포를 덮고 있는 두꺼운 섬유로 나타납니다. 정자(spermatheca)에서 액틴(actin)은 두꺼운 섬유 다발로 형성되기도 하지만, 이러한 섬유는 난모세포 영역보다 더 밀접하게 빽빽하게 채워져 있는 것으로 보입니다.

생식세포의 근위부 말단을 3차원으로 표현한 결과, 각 정자에는 평균 151개의 정자가 있음을 알 수 있다. 이 분석은 일단 숙달되면 생식세포당 10분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 실험에서 생식계열을 시각화하는 데 사용되는 대물렌즈의 배율에 따라 분석 매개변수를 정의해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 생식세포의 자동 분석을 수행하는 방법, 세포골격 구조를 연구하는 방법, 생식세포 내 핵의 수를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.