활성 ERK의 공간 및 시간 분석 C. 엘레 생식선

이 실험의 전반적인 목표는 예쁜꼬마선충 생식선에서 생체 내에서 활성 ERK 수치를 분석하는 것입니다. 이 방법은 약물 처리 또는 유전자 교란이 RAS-ERK 경로에 미치는 영향 및 그에 따른 생식세포 발달과 같은 ERK 신호 전달 및 생식세포 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 ERK 신호 패턴과 강도를 in vivo에서 정량화할 수 있다는 것입니다.

원하는 발달 단계에서 100-150개의 웜을 선택하고 100마이크로리터의 M9 버퍼가 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 수집합니다. 그런 다음 마이크로 원심분리기 튜브에 900마이크로리터의 M9 버퍼를 더 채우고 실온에서 1분 동안 1000회 g으로 원심분리합니다. 해부 현미경으로 900마이크로리터의 M9 버퍼를 부드럽게 제거합니다.

그런 다음 세척을 두 번 더 반복하여 부착된 박테리아를 대부분 제거합니다. 다음으로, 넓은 쪽 구멍이 있는 200마이크로리터 마이크로피펫 팁을 사용하여 100마이크로리터의 M9 버퍼에 있는 웜을 평평한 바닥 유리 시계 접시로 옮깁니다. 그런 다음 0.1 몰 레바미솔 1-3마이크로리터를 접시에 넣고 부드럽게 휘젓습니다.

이제 두 개의 주사기에 두 개의 25 게이지 바늘을 연결하여 각 손에 하나의 해부 도구를 만듭니다. 해부 현미경으로 각 바늘을 각 벌레 아래와 위에 놓고 가위와 같은 동작을 사용하여 두 번째 인두구 근처의 각 벌레를 미세하게 자릅니다. 레바미솔이 효과를 유지할 수 있도록 모든 동물을 적어도 한 번, 모두 5분 이내에 자릅니다.

접시에 담긴 동물의 해부는 5분 이내에 완료하는 것이 매우 중요합니다. 돌출된 생식선이 보이지 않으면 해당 동물은 건너뛰십시오. 적절한 압출 생식선이 여기에 보입니다.

해부가 완료된 후 흄 후드 아래에 3% 파라포름알데히드 2ml를 유리 시계 접시에 직접 넣고 파라필름으로 덮습니다. 그런 다음 10분 정도 기다립니다. 그런 다음 9 인치 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 시계 유리에 3 밀리리터의 PBS-T를 넣고 피펫을 사용하여 용액을 혼합합니다.

그런 다음 새 유리 피펫을 사용하여 벌레가 들어있는 5 밀리리터의 액체를 추출하여 새로운 5 밀리리터 유리 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 1000g의 임상 원심분리기에서 튜브를 30초 동안 원심분리합니다. 이제 해부 현미경으로 절개된 조직을 방해하지 않고 상층액을 제거하고 폐기합니다.

그런 다음 PBS-T 분취액 5ml를 사용하여 세척 단계를 두 번 더 반복하고 소량의 용액에 웜을 넣고 마무리합니다. 그런 다음 유리 피펫을 사용하여 100 % 메탄올 2 밀리리터를 넣고 새로운 파스퇴르 피펫으로 조직을 위아래로 당겨 부드럽게 혼합합니다. 이제 튜브를 섭씨 영하 20도에서 최소 1시간 동안 배양합니다.

메탄올 처리 후 PBS-T 세척을 3회 수행하고 약 500마이크로리터의 PBS-T로 마무리합니다. 이제 새로운 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직을 새로운 1 밀리리터 유리관으로 옮기고 중력에 의해 침전되도록합니다. 5-10분 후에 새 피펫과 현미경을 사용하여 조직을 방해하지 않고 튜브에서 가능한 한 많은 세척물을 제거합니다.

블록을 시작하려면 차단 버퍼인 30% 일반 염소 혈청 100마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 튜브를 파라필름으로 덮고 한 시간 동안 실온에 두십시오. 한 시간 후 현미경을 사용하여 새 피펫으로 가능한 한 많은 액체를 제거하십시오.

다음으로, 30% NGS에서 400분의 1로 희석된 MAPKYT 항체 100마이크로리터를 만들어 조직에 첨가합니다. 그런 다음 파라필름으로 튜브를 밀봉하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음 날 튜브를 실온으로 데우고 PBS-T 800마이크로리터를 추가합니다.

그런 다음 샘플을 새 유리 피펫에 넣고 부드럽게 풀어 균일한 현탁액을 만듭니다. 조직이 바닥에 정착하면 상층액을 조심스럽게 제거하고 항상 새 피펫을 사용하고 소용돌이를 사용하지 않고 총 3회 세척을 반복합니다. 2차 항체는 1차 항체와 동일하게 적용되며, 여기서부터 이미지를 만들 수 있을 때까지 조직을 어둠 속에 유지하는 것만 추가로 고려합니다.

2차 항체로 배양한 후, 마지막 세척이 제거되면 희석된 DAPI 용액 800마이크로리터를 조직에 첨가합니다. 튜브 입구를 파라필름으로 덮고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 나중에 해부 현미경으로 새 피펫으로 DAPI 용액을 최대한 많이 제거합니다.

마지막 얼룩이나 세척을 제거한 후 튜브에 장착 용액 한 방울을 추가합니다. 이제 아가로스 패드로 장착 슬라이드를 준비합니다. 깨끗한 유리 슬라이드에 녹은 2% 아가로스 한 방울을 넣고 아가로스에 수직으로 그리고 그 위에 두 번째 깨끗한 슬라이드를 빠르게 놓습니다.

마지막으로 상단 현미경 슬라이드를 매우 부드럽게 제거합니다. 이제 절개 된 동물을 패드로 옮기고 현미경을 사용하여 패드에서 여분의 액체를 모두 제거하십시오. 마지막으로 기포를 형성하지 않고 24 x 50mm 커버 슬립을 적용합니다.

커버 슬립이 적용되면 추가 압력을 가하지 마십시오. 이로 인해 종종 신호가 손실됩니다. 야생형 성체 자웅동체 동물의 대표적인 이미지는 ERK의 디포스포릴화된 활성 형태가 일반적으로 중간 파키텐 영역, 구역 1 및 구역 2에서 가장 성숙한 난모세포에서 시각화되는 것으로 나타났습니다.

이 활성화 패턴의 섭동은 신호 경로의 변화를 반영합니다. 여성 생식세포는 정자를 지정하지 않으므로 Zone 2에서는 ERK의 활성화를 나타내지 않으며 Zone 1에서는 약한 활성화만 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 최대 이틀이 걸릴 수 있으며, 제대로 수행하면 첫날에는 1시간으로 가장 많은 시간이 소요됩니다.

이 절차에 따라 RNA 물고기와 같은 다른 방법을 사용하여 단백질 풍부도 정보 외에도 RNA 전사체 수준과 같은 항목을 정량화할 수 있습니다. 1995년에 개발된 후 이 기술은 생식세포 개발 분야의 연구자들이 생체 내에서 단백질 풍부도 수준을 분석하고 예쁜꼬마선충의 염색체 형태를 따를 수 있는 길을 열었습니다.