주변 후 각 조직에 대 한 개발 준비 분자와 초파리 의 Immunohistochemical 분석

여기, 우리는 무대와 초파리 종에서 후 각 조직 개발 해 부 프로토콜을 제시. 있으 나 해 부 조직 immunohistochemistry 또는 제자리에서 같은 비보에 분석 뿐만 아니라 양적 RT-PCR (반전 전사-연쇄 반응) 또는 시퀀싱 (RNAseq), RNA와 같은 분자 분석에 대 한 나중에 사용할 수 있습니다. 교 잡입니다.

초파리 종에서 발달 중인 동공 및 성인 주변 후각 조직을 병기 분석하고 해부하는 전반적인 목표는 말초 후각 조직의 분자 및 발달 분석을 위한 샘플을 생성하는 것입니다. 이 방법은 발달 중인 말초 후각 조직에서 특정 유전자의 발현 역학 수준 및 패턴과 같은 후각 시스템 발달 및 진화 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법을 통해 우리는 초파리 종의 발달 중인 말초 후각 시스템에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

또한 말초 미각 및 시각 시스템과 같은 다른 감각 시스템에도 적용될 수 있습니다. RNA 염기서열분석 실험의 경우, 4개의 서로 다른 발달 단계를 위해 100-200개의 안테나 디스크 또는 안테나를 수집할 계획을 세웁니다. 면역조직화학을 위해 10-20마리의 파리를 해부할 계획을 세웁니다.

70% 에탄올을 사용하여 해부와 관련된 모든 재료를 청소합니다. 그런 다음 RNase 중화제로 재료를 추가로 청소합니다. 그리고 모든 용액은 뉴클레아제가 없거나 DEPC 처리된 물을 사용하여 만듭니다.

번데기를 수집하려면 30분 간격으로 유충을 모니터링하십시오. 그리고 0시 APF 번데기 단계에서 번데기를 수집합니다. 유충은 움직이지 않고 매우 가볍고 거의 흰색에 가까운 번데기 케이스로 둘러싸여 있습니다.

이 단계에서 유충을 촉촉한 여과지가 있는 작은 2인치 페트리 접시로 옮깁니다. 0시간 APF 단계 해부의 경우 즉시 번데기 전 더듬이 디스크를 채취하십시오. 그렇지 않으면 접시를 파라핀 필름으로 덮고 동물이 관심 발달 단계에 이를 때까지 섭씨 25도에서 발달하도록 합니다.

다른 초파리 종의 번데기 발달을 단계화하려면 0시간 prepupal 유충을 수집하여 새로운 바이알로 분류합니다. 그런 다음 prepupa에서 성인이 될 때까지의 일수를 기록하십시오. 그리고 이번에는 melanogaster의 타임라인으로 확장하기만 하면 됩니다.

시작하려면 RNase가 없는 1.5mm 튜브에서 150마이크로리터의 RNA 분리 용액을 냉각합니다. 다음으로, 박리 패드에 PBS의 여러 방울을 떨어뜨립니다. PBS의 각 방울에 해부할 번데기 한 마리를 놓습니다.

0시간에서 2시간 동안 번데기의 경우 집게를 사용하여 입 고리를 잡고 이러한 구조를 당겨 뇌와 상상 디스크를 찢고 노출시킵니다. 8시간 된 번데기의 경우 먼저 번데기의 가장 앞쪽 부분에서 번데기를 부드럽게 벗겨내어 발달 중인 머리를 노출시킵니다. 그런 다음 목 관절에서 머리를 분리합니다.

더듬이 디스크는 이 발달 단계에서 머리에 있습니다. 이제 더듬이 디스크를 포함하는 조직을 PBS의 다른 방울로 옮깁니다. 다음으로, 시신경에서 뇌와 연결된 눈 더듬이 디스크를 확인합니다.

집게를 사용하여 눈 더듬이 디스크를 분리하고 새 물방울로 옮깁니다. 8시간 된 번데기에서 안구 디스크는 더듬이 디스크를 컵으로 만들고 둘 다 뇌 앞쪽에 있습니다. 다음 물방울에서 집게를 사용하여 눈과 더듬이 디스크를 나눕니다.

그런 다음 P20 피펫 팁을 사용하여 최소한의 액체로 절개된 조직을 부드럽게 수집합니다. 디스크를 RNA 분리 용액 시약에 넣고 최소 100개가 수집될 때까지 더듬이 디스크를 계속 해부합니다. 번데기가 형성된 지 40시간이 지나면 성체 안테나는 최종 형태를 취하지만 여전히 투명합니다.

이 단계에서 최소 50개의 prepupae가 RNA 염기서열 수집에 필요합니다. 먼저 150마이크로리터의 냉각 RNA 분리 용액을 준비합니다. 해부 패드에서 번데기를 PBS 방울에 넣습니다.

그런 다음 한 쌍의 집게로 몸을 안정시키고 가장 앞쪽에서 번데기를 부드럽게 벗겨 머리를 드러냅니다. 그런 다음 목 관절에서 머리를 조심스럽게 제거합니다. 이제 머리를 PBS의 깨끗한 물방울로 부드럽게 옮깁니다.

머리를 둘러싼 멤브레인을 제거하기 위해 PBS에서 머리를 위아래로 피펫으로 낳습니다. 이 청소를 통해 안테나가 보이게 됩니다. 이제 분절 조인트에서 두 번째와 세 번째 세그먼트 사이의 멤브레인에서 안테나를 분리합니다.

세 번째 분절에는 더듬이 후각 수용체가 포함되어 있습니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 절개된 조직을 RNA 분리 용액으로 부드럽게 옮기면 전달되는 액체의 양을 최소화할 수 있습니다. RNA 추출의 경우, CO2 패드에서 마취된 성인을 해부합니다.

먼저 CO2 패드와 겸자를 RNase 억제제로 처리합니다. 그런 다음 성인을 마취하고 해부 현미경으로 패드를 봅니다. 두 쌍의 집게를 사용하여 몸을 안정시키고 두 번째 더듬이 분절에서 세 번째 더듬이 분절을 부드럽게 당기거나 꼬집어 조직을 수집합니다.

겸자를 액체에 담그고 풀어서 안테나를 RNA 분리 용액 튜브로 옮깁니다. 안테나는 물에 잠겨야 합니다. 안테나가 측벽에 달라붙으면 RNA가 조기에 분해됩니다.

충분한 더듬이를 채취한 후 RNA 추출을 진행합니다. 또는 수집 튜브를 섭씨 80도에서 무기한 보관하십시오. 안테나가 면역조직화학을 위한 것이라면 Triton의 유무에 관계없이 PBS에 파리가 잠긴 상태에서 해부 패드에서 이 해부를 수행합니다.

절개된 발달 후각 조직은 RNA 추출에 사용한 후 RT-PCR을 사용하여 유전자 발현을 평가할 수 있습니다. 예를 들어, 표면 수용체 전사체(facial receptor transcripts) 및 후각 수용체 전사체(olfactory receptor transcripts)의 발현은 이러한 방식으로 연구될 수 있다. 또는 조직을 면역조직화학에 사용하여 관심 유전자의 발현 패턴과 세포 내 국소화를 결정할 수 있습니다.

예를 들어, Rn-EGFP 형질전환 파리는 항-GFP 및 항-라미닌 항체로 염색할 수 있습니다. 분석에 따르면 번데기 형성 후 40시간이 지나면 Or67d 유전자가 안테나의 특정 세포에서 활성화되어 GAL4-UAS 시스템에서 GFP의 발현을 주도합니다. 일단 숙달되면 제대로 수행되면 1시간 안에 해부를 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 각 초파리 종의 번데기 발달 기간에 따라 시간과 적절하게 예정된 따기, 노화 및 해부를 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 qRT-PCR, 면역조직화학과 같은 다른 방법뿐만 아니라 기타 생체 내 염색 및 전사 프로파일링 기술을 수행하여 개발 조직 내 시스템 수준에서 전사 패턴 및 프로파일에 관한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 진화 및 감각 시스템 발달 분야의 연구자들이 초파리 종의 다른 감각 시스템에서 전사 역학 및 새로운 유전자 발견을 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.

날카로운 집게, 일부 RNA 추출 용액 및 포름알데히드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 항상 소근육 운동 기술, 높은 주의력 및 적절한 실험복 착용을 개발하기 위해 해부에 대한 이전 연습과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.