Name: 주변 후 각 조직에 대 한 개발 준비 분자와 초파리 의 Immunohistochemical 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 배우세요 Drosophila 후각 조직의 발달 단계별 분리 및 분석 방법을 통해 유전자 발현 동역학을 연구하세요. 이 기술은 신경과학 및 발달생물학 연구에 필수적인 분자 프로파일링을 가능하게 합니다.

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이 연구는 즐겼다 C. 볼 칸 (뎁-1457690)에 국립 과학 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

다음 프로토콜은 듀크 대학 연구 윤리 위원회에 의해 설립 된 윤리 지침과 일치.
1. 조직 준비와 초파리 melanogaster 번데기의 개발 준비
<ol><li>첫째, 얼마나 많은 파리 해 부 할 것입니다 확인 합니다. RT-PCR 및 RNAseq, prepupal, 8 h APF, 40 h APF, 및 성인 단계에서 필요한는 개인에서 100-200 더듬이 디스크와 안테나를 수집 합니다. Immunohistochemistry, 10-20 개인을 해 부.</li>
	<li>해 부 패드와 집게, 물티슈를 사용 하 여 70%를 포함 하 여 모든 물자를 청소 EtOH. 해 부 물자는 RNA 추출에 사용할 수, RNase neutralizers와 모든 것을 깨끗이 nuclease 무료 사용 하는 모든 솔루션을 경우 diethyl pyrocarbonate (DEPC) 물 처리. 참고:이 프로토콜은 해에 대 한 유리 대신 실리콘 해 부 패드 사용합니다. 실리콘 패드 초 미세 집게를 친절 하 고 신속 하 고 높은 품질의 해를 홍보.</li>
	<li>0 h APF/prepupal 단계에서 번데기를 수집 합니다.<ol>
<li>가장 정확한 준비 되도록 30 분 1 시간 간격에서 애벌레를 모니터링 합니다. 참고: 적당히 붐비는 병에서 방황 하 고 세 번째 탈피 애벌레 몇 시간 pupate 가능성이 것입니다.</li>
		<li>일단 애벌레 움직이지 되 고 매우 가벼운 (거의 흰색) 색된 번데기 케이스에 의해 포위 된다는 작은 2-페 트리 접시에 촉촉한 필터 종이 그들을 전송.</li>
		<li>1-2 h, 때때로 모니터링, 확인, 및 prepupae 전송에 대 한 계속. 참고: 또는 모든 pupae의 병을 취소 하 고 2 시간에 대 한 개발에 애벌레를 허용. 모든 pupae 수집 후 2 h 0-2 h APF 범위 안에 있을 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>즉시 prepupal 더듬이 디스크 0 h APF 무대에 대 한 해 부 3.1 단계로 이동 합니다. prepupa 세 수 하는 경우, 접시에 그들을 수집, 접시 커버와 건조, 억제 하기 위해 가장자리 주위 파라핀 영화 놓고 25 ° c.에 페 트리 접시를 놓고 참고: 번데기 이제 일수로 하 세 수 있습니다.</li>
	<li>2 h 범위에서 수집 하는 번데기에 대 한 번데기 하지 할 수 있도록 원하는 나이 보다는 더 적은 2 시간에 대 한 prepupae을 나이 없 더군요.</li>
	<li>아주 작고 연약한 조직으로 초 미세 집게 (Dumont 55)를 사용 합니다.</li>
</ol>2. 조직 준비 및 다른 초파리 종에서 번데기의 개발 준비
<ol><li>다른 초파리 종의 번데기 개발의 길이 확인 하려면 샘플 최적의 온도에서 prepupae은 관찰 날짜를 기록, 신선한 유리병으로 그들을 정렬 놓고 성인 기에 prepupa에서 일 수를 기록 합니다.</li>
	<li>시간 번데기 개발에 대 한 비-melanogaster 종 melanogaster의 비율을 기록 합니다. Melanogaster 준비에 대 한 비-melanogaster 종 나이에 시간 수를 사용 하는 시간의 수에 의해 개발 시간의 비율을 곱하면 됩니다.</li>
</ol>3. D. melanogaster 번데기 더듬이 디스크의 해 부
참고: 모든 노화 시간 및 해 부 프로토콜 설명에 대 한 초파리 melanogaster. 위에서 설명한 대로 다른 모든 종족에 대 한 종의 발달 시간 포인트에 따라 노화 프로토콜의 필요 있을 것입니다.
<ol><li>번데기 더듬이 디스크 해에 대 한 50-100 0-2 h 또는 주걱을 사용 하 여 6-8 h 오래 된 번데기를 수집 하 고 해 부 패드에 그들을 배치.</li>
	<li>무료 1.5 mL microfuge 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 튜브와 튜브를 얼음 위에 RNase에 RNA 격리 솔루션의 150 µ L 플라스틱.</li>
	<li>1 x PBS (인산 염 버퍼 식 염 수, nuclease 무료)의 150-200 µ L에 번데기를 해 부. 해 부 패드에 PBS (방울 당 150-200 µ L)의 여러 방울을 배치 합니다.</li>
	<li>해 부 패드에서 PBS 방울 x 1 중에서 해 부 수를 0-2 h 또는 세 6-8 h 번데기 (한 번데기 드롭 당)을 놓습니다. 한 손에 집게를 사용 하 여 신체를 안정.</li>
	<li>0-2 h pupae를 사용 하 여 다른 손에 잡고 집게에는 prepupa의 가장 앞쪽 부분 (입 고리)를 세 고 두뇌와 앞쪽 번데기 케이스에 부착 된 imaginal 디스크를 밖으로 당겨.</li>
	<li>8 h APF pupae에 대 한 먼저 부드럽게 껍질 번데기, 시체를 둘러싸는 막 자루 내 머리를 노출의 가장 앞쪽 분기에서 번데기 케이스에서. 참고: 몸,이 단계에서 처럼 보인다 악화 애벌레.</li>
	<li>목 관절에서 머리를 제거 합니다. 참고: 이렇게 하면 더듬이 디스크 손실 되지 것입니다이 단계에는 주로 뇌의 시 돌출부에 연결 되어.</li>
	<li>두뇌와 imaginal 디스크 조직을 다른 1x PBS 방울 집게 또는 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 전송.</li>
	<li>광 엽에서 뇌에 연결 된 눈 더듬이 디스크를 식별 합니다. 집게를 사용 하 여, 두뇌와 번데기 케이스에서 눈 더듬이 디스크를 분리 합니다. PBS 방울 집게 또는 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 x 새 1에 그것을 전송. 참고: prepupal 눈 더듬이 디스크는 평평한 조직 이다. 그러나, 8 h pupae로 눈 디스크는 회전 컵 더듬이 디스크는 중앙 뇌 앞쪽에 앉아.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 눈과 더듬이 디스크 사이의 연결의 사이트에서 조직을 잘라. 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 부드럽게 RNA 격리 솔루션 시 약으로 해 부 조직을 전송. 가능한 금액 pipetting으로 전송 하는 액체의 양을 최소화 합니다.</li>
	<li>모든 pupae 해 부 될 때까지 반복 합니다.</li>
</ol>4. D. melanogaster 중반-번데기 및 성인 안테나의 해 부
참고: 40 h APF, 대부분의 변 태 완료 되 면, 그리고 성인 구조, 명백한 되고있다 하지만 여전히 흰색 하 고 표현할 수 있다. 이 개발 시간이 시점에서 성인 안테나는 그것의 마지막 모양 아직 여전히 투명은 고 몇을 제외한 후 각 수용 체의 대부분 식 시작 하지 않았습니다.
<ol><li>번데기 더듬이 해에 대 한 1 단계에서 설명한 대로 50-100 prepupae를 수집 하 고 40 h 25 ° c.에 대 한 그들을 나이</li>
	<li>피펫으로 150 µ L RNase 무료 1.5 mL microcentrifuge에 RNA 격리 솔루션의 200 µ L 피펫으로 사용 하 여 튜브와 튜브를 얼음 위에.</li>
	<li>해 부 패드에서 PBS 방울 x 1의 하나로 해 부에 번데기를 놓습니다. 한 손에 집게를 사용 하 여 신체를 안정. 번데기는 시체를 둘러싸는 막 자루 내 머리를 노출의 가장 앞쪽 분기에서 번데기 케이스 벗기다 집게를 사용 하 여 다른 손에서 부드럽게.</li>
	<li>집게를 사용 하 여, 조심 스럽게 잘라 번데기 시체의 나머지 부분에서 머리 집게의 1 세트를 가진 시체를 벗는 머리 목에 집게의 또 다른 세트와 함께 공동 하 여. 부드럽게 PBS 방울 집게를 사용 하 여 다른 1x로 머리를 전송 합니다. 머리 (뇌, 등)를 분명 막 개발 초파리 머리를 포위 하는 데 사용의 내용을 밖으로 청소를 위아래로 플라스틱. 참고: 40-50 h APF, 안테나 막의 앞쪽 대부분 섹션에 연결 됩니다. 그들은 머리의 내용을 pipetting으로 지워집니다 때 해 부에 대 한 명백한 될 것입니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 막에서 번데기 안테나를 분리 합니다. 3에서 안테나의 2nd 세그먼트를 분리rd 3rd 세그먼트만 후 각 수용 체 신경 세포를 들어설 예정으로 단편 관절에서 슬라이스를 집게를 사용 하 여.</li>
	<li>20 µ L 피 펫을 사용 하 여 부드럽게 RNA 격리 솔루션 시 약으로 해 부 조직을 전송. 가능한 금액 pipetting으로 전송 하는 액체의 양을 최소화 합니다. 모든 pupae 해 부 될 때까지 반복 합니다.</li>
	<li>성인 더듬이 해 약 50 성인 수집 및 주 후 일수로 대 한 그들을 나이. 참고: 후 각 수용 체 유전자의 표현과 다른 유전자 일수로 후 주 피크. 어른은 생물학으로 관련 유전자 검출 임계값 이상 상승 낮은 풍부 증명서를 위해 1 주일에 대 한 세.</li>
	<li>RNA 추출에 대 한 그들은 CO2 패드에 아직도 살아 있는 동안 파리의 해 부. RNase 억제제와 CO2 패드를 취급 합니다. Confocal 영상에 대 한 해 부 해 부 패드 PBS 또는 PBS + 0.2% x 1에서에 파리 트리톤.</li>
	<li>첫째, 성인 절 개 범위에서 CO2 역 패드에 잘 넣어. 신체를 안정 시키기 위해 한 손에 집게를 사용 하 여 CO2 역 패드, 다른 한편에서 포 셉을 사용 하 여 두 번째에서 세 번째 더듬이 세그먼트 밖으로 부드럽게 당겨/핀치에.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 액체에 직접 안테나를 배치 하는 RNA 격리 솔루션에 안테나를 전송 합니다. 모든 성인 해 부 될 때까지 반복 합니다. 주: 안테나 RNA 격리 솔루션에 잠긴 것을 확인 하십시오. 안테나는 튜브의 측면에 갇혀 될 수 있습니다. 이 RNA 품질 및 수량 감소는 RNA의 증가 저하가 될 수 있습니다.</li>
	<li>직접 RNA 추출을 진행 하거나 장기 저장을 위한-80 ° C에서 튜브를 놓습니다.</li>
</ol>5. RNA 격리 해 부 조직에서
<ol><li>-80 ° C 저장소에서 모든 샘플을 제거 하 고 얼음에 녹여.</li>
	<li>짧게 스핀 (5-6 s, ~ 6000 x g) 튜브의 하단에 있는 자료를 수집 하는 각 샘플.</li>
	<li>10는 압력가 플라스틱 유 봉과 전기 모터를 사용 하 여 각 샘플을 갈아 얼음에 s.</li>
	<li>5.2와 5.3 4 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>RNA 추출 상용 키트를 사용 하 고 최적의 생산량에 대 한 제조 업체의 프로토콜을 다음을 수행 합니다.</li>
	<li>QRT-PCR 상용 시 약 및 제조 업체의 프로토콜에 따라 관심의 유전자에 대 한 특정 뇌관을 사용 하 여 수행 합니다.<ol>
<li>다음과 같은 조건을 사용 하 여 모든 PCR 반응을 수행: 10 분 동안 95 ° C 변성 뒤 15 95 ° C의 40 주기 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 그리고 60 ° C 30에 대 한 s. 참고: 딥 및 dpr 유전자를 위해 뇌관 쌍 표 1에 나열 된 및 Hueston CE 외 에 후 각 수용 체 유전자를 위한 뇌관 나열 8.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 번데기 더듬이 디스크와 Immunohistochemistry에 대 한 안테나의 고정
참고: 시간이 같은 금액에 대 한 조직 고정 되도록 10-20 개인 배치 조직 수정 했다. 샘플 조직의 무결성을 최대화 하기 위해 정착 액에 그들을 전송 하기 전에 PBT (세제 PBS)에 체류 하는 시간을 최소화 합니다.
<ol><li>수집 해 부 더듬이 디스크 또는 0.2%의 200 µ L을 포함 하는 200 µ L PCR 튜브에 번데기 안테나 조직의 무결성을 유지 하 고 200 µ L PCR의 벽에 튀어나와에서 샘플을 피하기 위해 얼음에 PBT 튜브는 불완전 한 고정으로 이어질 것입니다 합니다. 참고: 번데기 안테나 및 더듬이 디스크 어려울 수 있습니다 그들은 꽤 반투명으로 보고입니다. 그것은 조직의 모든 손실을 방지 하기 위해 모든 세척 단계에 대 한 절 개 범위를 사용 하는 것이 좋습니다. 또는, 96-잘 Terasaki 플레이트 고정에 대 한 사용 하 고 최고의 조직을 추적 얼룩 있을 수 있습니다.</li>
	<li>4%의 약 200 µ L에 번데기에서 수정 해 부 더듬이 디스크와 더듬이 샘플 PFA (Paraformaldehyde) 실 온에서 30 분. 이 고 후속 단계를 제대로 믹스 솔루션에서 샘플을 nutator에 샘플 튜브를 유지. 6.7 단계로 진행입니다.</li>
	<li>성인 안테나에 대 한 전체 머리를 처음 해 부하 고 4%의 약 200 µ L에서 수정 PFA (paraformaldehyde) 실 온에서 1 h.</li>
	<li>씻어 0.2%의 200 µ L 3 x PBT 10 분. 인큐베이션 기간 동안에 nutator 샘플을 유지.</li>
	<li>고정 헤드에서 두 번째 더듬이 세그먼트의 미세한 절 개에 대 한 해 부 현미경을 다시 이동 합니다. 집게를 사용 하 여 머리를 안정, 두 번째에서 세 번째 더듬이 세그먼트 밖으로 부드럽게 당겨/핀치.</li>
	<li>4%의 약 200 µ L로 해 부 제 3 더듬이 세그먼트를 전송 PFA (paraformaldehyde) 실 온에서 30 분 동안 그들을 수정 하 고.</li>
	<li>씻어 0.2%의 200 µ L 3 x PBT 10 분. 인큐베이션 기간 동안에 nutator 샘플을 유지.</li>
	<li>4 ° C에서 샘플을 저장 하거나 전체 마운트 immunohistochemistry 직접 계속. 참고: 얼룩의 효율성 항 체 사용 되 고 변경할 수 있습니다. 이 메서드는 풍부한 단백질 태그 덜 적합 또는 약한 항 체 이어야 한다. 그러나, 때때로, 그것은 프로토콜 (정체성 또는 정착 액의 금액 또는 고정 시간)의 최적화가 필요할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜은 실험실 초파리 에 걸쳐이 프로그램의 비교 분석으로 초파리 의 후 각 조직 개발에서 유전과 transcriptional 프로그램을 식별 하는 데 관심이 대 한 유용한 리소스 종입니다. 다른 발달 단계에서 시스템 수준 transcriptional 프로필 미래 연구를 위한 뇌관으로 필요한 경우 특히 유용 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜 단계 및 개발에 사용 될 터미널 차별화를 모방 하는 사전에서 후 각 시스템 개발의 4 가지 핵심 단계에서 샘플을 얻기 위해 초파리 에서 후 각 조직 분리 하는 방법을 보여 줍니다. 분자 및 면역 조직학 연구입니다. 초파리 해 부 더듬이 디스크와 다른 번데기 단계에서 안테나 양적 RT-PCR에 의해 RNA-seq 하 여 시스템 수준에서 또는 개별 유전자의 수준에 후 각 시스템 개발 중 유전자 식 프로필을 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 샘플 조직-특정 유전자 발현의 vivo에서 패턴을 식별 하 immun...

발달 신경 생물학, 시스템 신경 과학으로 신경 생리학, 행동 연구, 그리고 행동 진화1,2,3, 초파리 의 후 각 시스템은 널리 사용 되는 시스템 4. 초파리 의 후 각 조직 집 수압 및 온도 감각 신경1,,56외 휘발성 화학 신호를 감지 하는 후 각 수용 체 신경 (ORNs). 이 원고의 전반적인 목표는 무대 초파리 종의 번데기 및 성인 후 각 조직 개발 해 부 하는 방법을 보여 줍니다. 이 기술에 대 한 근거 또한 vivo에서 조직 기술 라벨 샘플 RNAseq 등 정량적 RT-PCR, 주변 후 각 시스템의 분자 및 발달 분석에 대 한 다른 번데기 단계에서 생성 하는 . 이 기술은 특정 세포 유형에 대 한 모든 유전자 변형 시 약 하지 않은 비-초파리 melanogaster 종 개발 성인 후 각 시스템에 transcriptional 프로필의 역학을 식별 하기 위해 특히 유용할 수 있습니다. 표시 하 고 분석입니다. 이 원고, 더듬이 디스크와 번데기 및 성인 초파리 종에서 안테나를 해 부하는 방법을 보여 줍니다. 첫째, 우리 개발 준비 및 종의 노화에 대 한 puparium 형성 (APF, 흰색 pupae 또는 prepupae)의 0 h 초파리 를 식별 하는 방법을 보여 줍니다. 다음, 우리에 게 보여 더듬이 디스크와 제 3 더듬이 세그먼트; 해 부 특히, 눈 디스크 및 RNAseq 또는 RT PCRs에 필요한 조직 순도 대 한 두 번째 더듬이 세그먼트에서 그들을 분리 하는 방법. 미리 무늬 더듬이 디스크 (prepupae)에 해당 하는 단계 D. melanogaster 약이 프로토콜에서 설명에서 일어나는 더듬이에서 선택 디스크 (8 h APF), ORNs (40 h APF)에 대 한 터미널 차별화의 시작 하 고 성인 안테나입니다. 마지막으로, 우리 성인 안테나 메서드를 사용 하 여 고립에서 그리고 vivo에서 immunohistochemistry 양적 RT-PCR에 대 한 예제는 줄. 이 메서드는 RNA/DNA 분석 및 immunohistochemistry 초파리 종에서 주변 후 각 조직 개발에 대 한 샘플을 생성 하기 위해 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>10X 인산염 완충 식염수</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>RNase free water</td></tr><tr><td>CO2 tank</td><td>Air Gas</td><td>CD R200</td><td></td></tr><tr><td>Two sharp tysections (Dumont #55)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>RNA 분리 솔루션</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr> 얼음 <tr><td></td> P20 및 P200 마이크로피펫 및 팁<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>이 들어 있는 작은 양동</td>이 1.7mL 마이크로퓨지 튜브 최상의 결과를 위해 뉴클레아제를 무료로 구매 0.2mL PCR 튜브 파라포름알데히드 분말 Polysciences 380 10% Triton X-100 Teknova T1105 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>1X PBS</td>2" 페트리 접시</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>에 0.2% v/v로 희석 <tr><td>55mm 여과지</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td>물에 적셔 번데기를 촉촉하게 유지하기 위해 페트리 접시에 넣</td></tr>으십시오 <tr><td>25 C 인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>탈이온화 H2O</td><td></td><td></td><td>뉴클레아제를 구입하거나 DEPC</td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td>로 치료하십시오. <td>Dow Corning</td><td></td><td>Terizaki 플레이트 커버에서 해부 패드를 만드는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>뚜껑이 있는 MicroWell Mini Tray Nunc</td><td></td><td>438733</td><td>Lids는 실리콘 해부 패드를 만드는 데 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP 항체</td><td>MBL international corpor</td><td>PM005</td><td>primary antibody</td></tr><tr><td>Mouse anti RAT CD2</td><td>AbD seroTec</td><td>MCA154RHDL</td><td>primary antibody</td></tr><tr><td>ADL195 (anti lamin, mouse)</td><td>Dev studies hydoma ban</td><td>ADL195-s</td><td>primary antibody</td></tr><tr><td>알렉사 플루오&reg; 488 염소 항토끼 IgG (H+L)</td><td>invitrogen</td><td>A11008</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>Cy3 염소 항마우스 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-166-003</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>Triton X-100, 단백질 등급 세제, 10% 용액, 멸균 여과</td><td>CALBIOCHEM</td><td>648463</td><td>세제</td></tr><tr><td>Lab Rotator</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td>Rotator</td></tr><tr><td>Nuclease Free Water</td><td>Growcells.com</td><td>NUPW-0125</td><td>워터</td></tr><tr><td>라이트-듀티 티슈 와이퍼</td><td>VWR</td><td>82003-822</td><td>청소용 해부 용품</td></tr><tr><td>Superscript II</td><td>invitrogen</td><td>18064014</td><td>Reverse Transcriptase&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAshredder (50)</td><td>RNA 추출</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td></tr><tr><td>Oligo(dT)12-18 Primer</td><td>RT</td><td>life technologies</td><td></td></tr><tr><td>18418012 RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)</td><td>RNA 추출</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td></tr><tr><td>FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)</td><td>qPCR</td><td>Roche</td><td>04913850001</td></tr><tr><td>FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER&nbsp;</td><td>qPCR</td><td>Roche</td><td>06402712001</td></tr><tr><td>LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96</td><td>qPCR</td><td>Roche</td><td></td></tr><tr><td>04729692001 NEBNext 고충실도 2X PCR 마스터 믹스</td><td>qPCR</td><td>NEB</td><td>M0541S</td></tr></tbody></table>

주변 후 각 조직에 대 한 개발 준비 분자와 초파리 의 immunohistochemical 분석

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

초파리 의 후 각 시스템 발달 신경 생물학, 시스템 신경 과학으로 신경 생리학, 행동과 행동 진화에 널리 사용 되는 시스템이입니다. 초파리 의 후 각 조직 집 수압 및 온도 감각 신경 이외에 휘발성 화학 신호를 감지 하는 후 각 수용 체 신경 (ORNs). 이 프로토콜에서 우리는 성인 초파리 종의 주변 후 각 조직 개발의 해 부를 설명 합니다. 우리는 처음 무대 초파리 애벌레, 중순에 번데기 단계와 성인에서 안테나의 해 부에 의해 따라 초기 번데기 단계에서 더듬이 디스크의 해 부를 이어서 나이 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 또한 어디 준비 qRT-PCR, RNAseq, 또는 immunohistochemistry RNA 추출 등 분자 기법에 활용할 수 있는 방법을 보여줍니다. 이러한 방법은 적용할 수 있습니다 또한 다른 초파리 종 종의 번데기 개발 시간, 결정 하 고 각 단계는 적절 한 노화에 대 한 계산 됩니다.

해 부 개발 후 각 조직의 RNA 추출 뒤에 RT-PCR 유전자 발현을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또는 immunohistochemistry 프로토콜을 통해 식이 패턴, 그리고 하위 세포질 유전자의 지역화를 확인 하기 위해 취할 수 있습니다. 관심입니다. 이 섹션에서 우리는 어느 프로토콜에서 대표적인 결과 제시. 그림 1 은 대표적인 양적 RT-PCR 야생-타입 성인 안테나에 세포 표면 수용 체와 후 각 수용 체 유전자의 전사를 보여주는. 그림 2 는 6-8 h 고 Rn EGFP 유전자 변형에 12 h APF 더듬이 디스크 stainings를 사용 하 여 안티-GFP (1:1000)와 안티 lamin 항 체 (1: 100) (그림 2A 와 2B</strong...

여기, 우리는 무대와 초파리 종에서 후 각 조직 개발 해 부 프로토콜을 제시. 있으 나 해 부 조직 immunohistochemistry 또는 제자리에서 같은 비보에 분석 뿐만 아니라 양적 RT-PCR (반전 전사-연쇄 반응) 또는 시퀀싱 (RNAseq), RNA와 같은 분자 분석에 대 한 나중에 사용할 수 있습니다. 교 잡입니다.

주변 후 각 조직에 대 한 개발 준비 분자와 초파리 의 Immunohistochemical 분석

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

초파리 종에서 발달 중인 동공 및 성인 주변 후각 조직을 병기 분석하고 해부하는 전반적인 목표는 말초 후각 조직의 분자 및 발달 분석을 위한 샘플을 생성하는 것입니다. 이 방법은 발달 중인 말초 후각 조직에서 특정 유전자의 발현 역학 수준 및 패턴과 같은 후각 시스템 발달 및 진화 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법을 통해 우리는 초파리 종의 발달 중인 말초 후각 시스템에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.또한 말초 미각 및 시각 시스템과 같은 다른 감각 시스템에도 적용될 수 있습니다. RNA 염기서열분석 실험의 경우, 4개의 서로 다른 발달 단계를 위해 100-200개의 안테나 디스크 또는 안테나를 수집할 계획을 세웁니다. 면역조직화학을 위해 10-20마리의 파리를 해부할 계획을 세웁니다.70% 에탄올을 사용하여 해부와 관련된 모든 재료를 청소합니다. 그런 다음 RNase 중화제로 재료를 추가로 청소합니다. 그리고 모든 용액은 뉴클레아제가 없거나 DEPC 처리된 물을 사용하여 만듭니다.번데기를 수집하려면 30분 간격으로 유충을 모니터링하십시오. 그리고 0시 APF 번데기 단계에서 번데기를 수집합니다. 유충은 움직이지 않고 매우 가볍고 거의 흰색에 가까운 번데기 케이스로 둘러싸여 있습니다.이 단계에서 유충을 촉촉한 여과지가 있는 작은 2인치 페트리 접시로 옮깁니다. 0시간 APF 단계 해부의 경우 즉시 번데기 전 더듬이 디스크를 채취하십시오. 그렇지 않으면 접시를 파라핀 필름으로 덮고 동물이 관심 발달 단계에 이를 때까지 섭씨 25도에서 발달하도록 합니다.다른 초파리 종의 번데기 발달을 단계화하려면 0시간 prepupal 유충을 수집하여 새로운 바이알로 분류합니다. 그런 다음 prepupa에서 성인이 될 때까지의 일수를 기록하십시오. 그리고 이번에는 melanogaster의 타임라인으로 확장하기만 하면 됩니다.시작하려면 RNase가 없는 1.5mm 튜브에서 150마이크로리터의 RNA 분리 용액을 냉각합니다. 다음으로, 박리 패드에 PBS의 여러 방울을 떨어뜨립니다. PBS의 각 방울에 해부할 번데기 한 마리를 놓습니다.0시간에서 2시간 동안 번데기의 경우 집게를 사용하여 입 고리를 잡고 이러한 구조를 당겨 뇌와 상상 디스크를 찢고 노출시킵니다. 8시간 된 번데기의 경우 먼저 번데기의 가장 앞쪽 부분에서 번데기를 부드럽게 벗겨내어 발달 중인 머리를 노출시킵니다. 그런 다음 목 관절에서 머리를 분리합니다.더듬이 디스크는 이 발달 단계에서 머리에 있습니다. 이제 더듬이 디스크를 포함하는 조직을 PBS의 다른 방울로 옮깁니다. 다음으로, 시신경에서 뇌와 연결된 눈 더듬이 디스크를 확인합니다.집게를 사용하여 눈 더듬이 디스크를 분리하고 새 물방울로 옮깁니다. 8시간 된 번데기에서 안구 디스크는 더듬이 디스크를 컵으로 만들고 둘 다 뇌 앞쪽에 있습니다. 다음 물방울에서 집게를 사용하여 눈과 더듬이 디스크를 나눕니다.그런 다음 P20 피펫 팁을 사용하여 최소한의 액체로 절개된 조직을 부드럽게 수집합니다. 디스크를 RNA 분리 용액 시약에 넣고 최소 100개가 수집될 때까지 더듬이 디스크를 계속 해부합니다. 번데기가 형성된 지 40시간이 지나면 성체 안테나는 최종 형태를 취하지만 여전히 투명합니다.이 단계에서 최소 50개의 prepupae가 RNA 염기서열 수집에 필요합니다. 먼저 150마이크로리터의 냉각 RNA 분리 용액을 준비합니다. 해부 패드에서 번데기를 PBS 방울에 넣습니다.그런 다음 한 쌍의 집게로 몸을 안정시키고 가장 앞쪽에서 번데기를 부드럽게 벗겨 머리를 드러냅니다. 그런 다음 목 관절에서 머리를 조심스럽게 제거합니다. 이제 머리를 PBS의 깨끗한 물방울로 부드럽게 옮깁니다.머리를 둘러싼 멤브레인을 제거하기 위해 PBS에서 머리를 위아래로 피펫으로 낳습니다. 이 청소를 통해 안테나가 보이게 됩니다. 이제 분절 조인트에서 두 번째와 세 번째 세그먼트 사이의 멤브레인에서 안테나를 분리합니다.세 번째 분절에는 더듬이 후각 수용체가 포함되어 있습니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 절개된 조직을 RNA 분리 용액으로 부드럽게 옮기면 전달되는 액체의 양을 최소화할 수 있습니다. RNA 추출의 경우, CO2 패드에서 마취된 성인을 해부합니다.먼저 CO2 패드와 겸자를 RNase 억제제로 처리합니다. 그런 다음 성인을 마취하고 해부 현미경으로 패드를 봅니다. 두 쌍의 집게를 사용하여 몸을 안정시키고 두 번째 더듬이 분절에서 세 번째 더듬이 분절을 부드럽게 당기거나 꼬집어 조직을 수집합니다.겸자를 액체에 담그고 풀어서 안테나를 RNA 분리 용액 튜브로 옮깁니다. 안테나는 물에 잠겨야 합니다. 안테나가 측벽에 달라붙으면 RNA가 조기에 분해됩니다.충분한 더듬이를 채취한 후 RNA 추출을 진행합니다. 또는 수집 튜브를 섭씨 80도에서 무기한 보관하십시오. 안테나가 면역조직화학을 위한 것이라면 Triton의 유무에 관계없이 PBS에 파리가 잠긴 상태에서 해부 패드에서 이 해부를 수행합니다.절개된 발달 후각 조직은 RNA 추출에 사용한 후 RT-PCR을 사용하여 유전자 발현을 평가할 수 있습니다. 예를 들어, 표면 수용체 전사체(facial receptor transcripts) 및 후각 수용체 전사체(olfactory receptor transcripts)의 발현은 이러한 방식으로 연구될 수 있다. 또는 조직을 면역조직화학에 사용하여 관심 유전자의 발현 패턴과 세포 내 국소화를 결정할 수 있습니다.예를 들어, Rn-EGFP 형질전환 파리는 항-GFP 및 항-라미닌 항체로 염색할 수 있습니다. 분석에 따르면 번데기 형성 후 40시간이 지나면 Or67d 유전자가 안테나의 특정 세포에서 활성화되어 GAL4-UAS 시스템에서 GFP의 발현을 주도합니다. 일단 숙달되면 제대로 수행되면 1시간 안에 해부를 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 각 초파리 종의 번데기 발달 기간에 따라 시간과 적절하게 예정된 따기, 노화 및 해부를 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 qRT-PCR, 면역조직화학과 같은 다른 방법뿐만 아니라 기타 생체 내 염색 및 전사 프로파일링 기술을 수행하여 개발 조직 내 시스템 수준에서 전사 패턴 및 프로파일에 관한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 진화 및 감각 시스템 발달 분야의 연구자들이 초파리 종의 다른 감각 시스템에서 전사 역학 및 새로운 유전자 발견을 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.날카로운 집게, 일부 RNA 추출 용액 및 포름알데히드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 항상 소근육 운동 기술, 높은 주의력 및 적절한 실험복 착용을 개발하기 위해 해부에 대한 이전 연습과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

preparing-developing-peripheral-olfactory-tissue-for-molecular

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 기술은 immunohistochemistry 또는 electrophysiological 레코딩을위한 Drosophila 배아의 neuromusculature를 제공​​합니다. 그것은 신경근육학 개발 초기에 이벤트를 공부하거나 부화 수없는 돌연변이의 전기 생리학을 수행하는 데 유용합니다.

수확 및 준비 Drosophila</emElectrophysiological 녹화 및 기타 수속을위한> 태아

우리는 개최 준비하는 절차를...

전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 Drosophila 태아

성인의 준비 Drosophila</em씬 Sectioning 및 현미경 분석을위한> 눈

의 형태학의 분석 Drosophila</em유전 모자이크 사용하기> 애벌레 주변 감각 신경 세포의 Dendrites 및 Axons

이 비디오에서는 전기생리학 연구를 위해 살아있는 초파리 파리가 튜브에 장착되어 있습니다. 전극은 파리의 후각 수용체 뉴런과 함께 페로몬에 대한 특정 뉴런 반응을 기록하기 위해 감각의 기저부에 위치합니다.

휘발성 냄새 물질에 대한 반응으로 Drosophila Sensilla의 전기 생리학적 기록

여기에서는 후각 수용체 뉴런(ORN)의 다양화와 관련된 분자 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있도록 초파리 더듬이의 전체 마운트 면역 염색 과정을 설명합니다.

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

이 프로토콜의 전반적인 목표는 장쇄 사상 페로몬에 반응하는 Drosophila 후각 수용체 뉴런으로부터 단일 감각 기록을위한 낮은 휘발성의 냄새 물질을 제시하는 방법을 입증하는 것입니다.

에서 전기 생리 학적 기록<em&gt; Drosophila</em&gt; 낮은 휘발성의 냄새에 반응하는 Trichoid Sensilla

이 프로토콜 설명 해 부와 성인 초파리 melanogaster 의 immunostaining 뇌 조직. 특히,이 프로토콜은 신경 개발의 많은 측면을 기본 일반적인 원리를 밝히기 위해 정확 하 게 사용할 수 있는 예제 신경 하위 집합으로 초파리 버섯 몸과 포토 리셉터 뉴런의 사용을 강조 표시 합니다.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

이 문서는 초파리 번데기 망막 조직의 immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 추출에 대 한 처리에 대 한 프로토콜 함께 해 부에 대 한 수술 메서드를 제공 합니다.

Immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 격리에 대 한 초파리 번데기 망막의 해 부

이 프로토콜은 후각 회로 어셈블리의 연구를 위한 안테나-뇌 explant 시스템의 해부 절차, 배양 조건 및 라이브 이미징을 기술한다.

초파리의 후각 회로 어셈블리의 타임랩스 이미징 연구를위한 Explant 시스템

여기에서는 초파리 청소년 뇌에서 더듬이엽 시냅스 사구체의 후각 경험 의존적 리모델링을 유도하고 분석하는 방법을 설명합니다.

Experience-Dependent Remodeling of Juvenile Brain Olfactory Sensory Neuron Synaptic Connectivity in an Early-Life Critical Period(어린 뇌 후각 감각 뉴런 시냅스 연결성의 경험 의존적 리모델링)

배우세요 Drosophila 후각 조직의 발달 단계별 분리 및 분석 방법을 통해 유전자 발현 동역학을 연구하세요. 이 기술은 신경과학 및 발달생물학 연구에 필수적인 분자 프로파일링을 가능하게 합니다.

주변 후 각 조직에 대 한 개발 준비 분자와 초파리 의 Immunohistochemical 분석

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