에서 전기 생리 학적 기록 Drosophila 낮은 휘발성의 냄새에 반응하는 Trichoid Sensilla

이 기술의 전반적인 목표는 전기 생리학적 기록을 위해 후각 수용체 뉴런과 초파리에 낮은 휘발성의 냄새 물질을 효과적으로 제시하는 것입니다. 이 뉴런은 트리코이드 센실라(trichoid sensilla)에 보관되어 있으며 긴 사슬 피부 페로몬에 반응합니다. 이 방법은 개선된 냄새 전달 기술을 제공하여 곤충 페로몬 통신 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 휘발성이 낮아 이전에는 접근할 수 없었던 냄새 물질을 생체 내 기록 중에 효과적으로 제시할 수 있다는 것입니다. 특히, 페로몬은 구애하는 수컷과 표적 암컷 사이의 범위를 시뮬레이션하는 근거리에서 나타납니다. AT4 기록을 위한 냄새 전달 카트리지 구성 요소의 준비는 200마이크로리터 피펫 팁의 좁은 끝에서 0.9cm를 제거하는 것으로 시작됩니다.

그런 다음 두 번째 피펫 끝에서 좁은 끝에서 1.7cm, 넓은 끝에서 1.5cm를 제거하여 1.8cm 길이를 만듭니다. 그런 다음 집게를 사용하여 1.8cm 섹션 끝에 1/8인치 직경의 여과지 디스크를 놓습니다. 공기가 통과할 수 있는 작은 구멍을 남겨 두십시오.

그런 다음 준비물을 겨냥하기 위해 아래쪽으로 기울어진 작은 부분과 함께 피펫 섹션을 고정합니다. 이제 P10을 사용하여 원하는 희석액으로 냄새 첨가물을 여과지에 도포합니다. 그런 다음 용매를 증발시키기 위해 로드된 카트리지를 진공 데시케이터에 한 시간 동안 그대로 두십시오.

먼저 플라이 준비 슬라이드를 조립합니다. 유리 슬라이드에서 모델링 클레이가 있는 유리 커버 슬립을 부착하여 슬라이드와 커버 슬립 사이에 약 3도의 각도를 만듭니다. 그런 다음 커버 슬립의 안쪽 가장자리와 커버 슬립 바로 아래의 슬라이드의 두 위치에 양면 테이프를 부착합니다.

항상 새 테이프를 사용하십시오. 이제 흡인기 튜브에서 관심 있는 파리를 수집하십시오. 그런 다음 200마이크로리터 피펫 팁을 튜브 끝에 끼우고 불면서 동시에 튜브를 튕겨 플라이를 피펫 팁 끝으로 밀어 넣습니다.

그런 다음 면도날을 사용하여 파리의 몸통 바로 아래에 있는 끝을 자릅니다. 이제 팁의 넓은 끝 부분에 성형 점토를 조심스럽게 로드하여 파리의 머리를 더 작은 구멍으로 밀어 넣습니다. 양쪽 더듬이가 모두 노출되면 점토로 포장하는 것을 중지하십시오.

이제 집게를 사용하여 슬라이드에 프렙을 배치합니다. 테이프로 감긴 커버 슬립 표면에 안테나의 측면이 닿도록 clipeus를 수평을 향하도록 배치합니다. 그런 다음 arista에 고정 로드를 놓아 안테나를 테이프에 고정합니다.

다음으로, 프렙을 리그의 스테이지에 놓습니다. 트리코이드가 안테나의 세 번째 세그먼트의 원위 측면 가장자리를 따라 보이는지 확인합니다. sensilla는 배경에 대해 명확하게 윤곽이 나타나야 합니다.

약 2cm 거리에서 별도의 튜브를 통해 전달되는 일정한 가습 공기 흐름 아래에서 프렙을 유지하십시오. 녹음을 하려면 빠르고 부드러운 동작으로 참조 전극을 클립에 삽입합니다. 혈림프와 접촉할 큐티클 바로 아래에 놓습니다.

다음으로, 목표 감각과 동일한 시야에 들어갈 때까지 기록 전극을 천천히 내립니다. 그런 다음 녹음 전극을 sensillar 베이스에 삽입합니다. 계속하기 전에 AT4-A 및 AT4-C 뉴런에서 식별 가능한 스파이크와 함께 높은 신호 대 잡음비가 있는지 확인하십시오.

AT4-A 뉴런은 20헤르츠보다 빠르게 발사되어서는 안 됩니다. 이제 카트리지를 냄새 전달 튜브에 연결합니다. 용매 제어부터 시작하여 가장 높은 냄새 농도를 향해 진행합니다.

이 경우 팔미톨레산 카트리지가 부착됩니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 카트리지를 머리에 조준하면서 프렙 쪽으로 조종합니다. 카트리지 팁이 약 4mm 거리에서 안테나를 직접 가리키도록 배치합니다.

카트리지는 슬라이드에서 약 1mm 위에 있어야 합니다. 준비와 관련하여 카트리지를 정확하게 배치하는 것은 이 절차에서 가장 중요한 단계입니다. 일관된 신경 반응은 임상시험 전반에 걸쳐 카트리지의 재현 가능한 위치에 따라 달라집니다.

카트리지는 전극과 슬라이드에 의해 밀접하게 경계에 있을 수 있습니다. 이상적으로는 두 전극 중 하나에서 최소 4mm 떨어져 있어야 합니다. 자극을 위해 냄새 흐름 컨트롤러를 500밀리초 버스트로 설정하고 분당 500밀리리터 유속을 사용합니다.

각 자극 버스트에 대해 10초 동안 전기 활동을 기록합니다. 냄새 첨가제를 살포한 후에는 다음으로 높은 농도가 포함된 카트리지로 교체하기 전에 카트리지를 조심스럽게 집어넣으십시오. 하루 동안의 모든 녹음을 한 후 녹음 전극을 증류수로 철저히 헹굽니다.

생후 7일 된 수컷 베를린 야생형 파리에 대해 기술된 방법을 사용하여 트랜스 및 시스 팔미톨레산의 상대적 효능을 비교했습니다. 트랜스-팔미톨레산(Trans-palmitoleic)은 Or47b 후각 수용체 뉴런의 강력한 자극제였다. 각 파리에서 하나의 뉴런만 기록되었습니다.

냄새 카트리지가 열리는 시점부터 파리의 머리까지 거리는 신경 반응에 상당한 영향을 미쳤습니다. 4mm 높이에서는 팔미톨레산에 반응하여 더 많은 스파이크가 발사되었습니다. 11mm 거리에서는 O47b 뉴런에 의한 관찰 가능한 반응이 거의 없었다.

팔미톨레산의 근거리 제시는 냄새 물질로서의 효과를 연구하는 데 매우 중요했습니다. 이 비디오를 시청한 후 in vivo single sensillum 기록 중에 팔미톨레산 또는 기타 저휘발성 냄새 물질을 초파리 후각 수용체 뉴런에 제시하는 방법을 명확하게 이해할 수 있기를 바랍니다. 이 기술을 마스터하면 약 20분 안에 단일 플라이에서 전체 투여량 곡선을 기록할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 곤충 후각 분야의 연구자들이 페로몬 감지를 위한 신경 생리학 및 신호 전달 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.