CRISPR 가이드 RNA 포유류 시스템 복제
October 2nd, 2018
여기, 간단 하 고, 효율적인, 그리고 sgRNA 복제의 비용 효율적인 방법 설명입니다.
이 방법은 CRISPR 촉진 실험을 위한 가이드 RNA 발현 플라스미드의 생성을 용이하게 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 복제가 단일 단계에서 수행될 수 있고 쌍가이드 RNA가 단일 가이드 RNA 발현 플라스미드를 사용하여 생성될 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜을 시작하려면 1X TE 버퍼에서 100 마이크로몰러의 최종 농도로 리오필화된 프라이머를 희석시다.
Aliquot는 PCR 스트립 캡 튜브에 동일한 양의 전방 및 역 프라이머를 넣습니다. 혼합 소용돌이. 다음으로, 15초 동안 100배 G에서 가이드 RNA 올리고뉴클레오티드 혼합물을 회전시한다.
결찰을 설정하기 전에 실온에서 5 분 동안 반응을 배양합니다. 선택한 PSB700 가이드 발현 벡터의 1~5마이크로그램을 벡터 1마이크로그램당 BSNB1의 0.5 마이크로리터를 사용하여 BSNB1에 추가합니다. 총 부피가 40 마이크로리터가 될 때까지 증류수를 추가하고 섭씨 55도에서 1시간 동안 소화를 수행합니다.
1.5% 낮은 녹는 아가로즈 젤에 소화 제품을 실행합니다. 크기약 9킬로베이스에 해당하는 소화벡터 백본 밴드를 잘라냅니다. 이 젤 슬라이스를 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오.
상용 젤 정화 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 아가로즈 젤에서 DNA를 추출하십시오. 그런 다음 DNA를 TE 버퍼의 10-15 마이크로리터로 희석하여 농축 된 엘루트를 얻습니다. 결찰을 수행할 준비가 되면 유리병에 증류수 15마이크로리터를 추가합니다.
이전에 아닐 가이드 RNA 올리고뉴클레오티드의 마이크로리터 1개, BSNB1 소화 PSB700 가이드 발현 벡터의 마이크로리터 1개, 10XT4 DNA 리개서 반응 버퍼2마이크로리터를 첨가한다. 그런 다음 이 솔루션을 소용돌이로 섞습니다. DNA 리구아제와 소용돌이의 마이크로리터 1개를 다시 추가합니다.
15초 동안 100배 G로 솔루션을 회전시합니다. 밤새 실온에서 반응을 배양하여 BSNB1 소화 벡터를 단독으로 포함하는 삽입 음성 제어 반응을 포함시키는 데 있어 RNA 올리고테 삽입을 삽입한다. 먼저 E.coli를 영하 80도의 저장에서 제거하고 얼음 위에서 5~10분 동안 해동하십시오.
유능한 대장균의 8 마이크로 리터에 준비 된 반응 혼합물의 0.5 마이크로 리터를 추가합니다. 혼합물을 얼음에 30분 간 보관하십시오. 45초 동안 섭씨 42도에서 혼합물을 열충격.
그런 다음 혼합물을 얼음 위에 2 분 동안 놓습니다. 로터리 셰이커를 사용하여 NEB DH5a 또는 NEB 마구간에 나열된 조건을 사용하여 SOC 미디어의 250 마이크로리터에서 문화를 회복하십시오. 그 후, 적절한 항생제 내성 리소겐국물 판에 배양의 80 마이크로리터를 플레이트.
NEB DH5a의 경우 섭씨 37도 또는 NEB 마구간의 섭씨 30도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 먼저 푸시온 GC 특수 PCR 프로토콜을 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 필요한 조각을 만듭니다. 이 PCR 제품을 1% 아가로즈 젤로 실행하고 약 490개의 베이스 쌍에서 한 밴드가 보이는지 확인합니다.
젤 추출 키트를 사용하여 이 PCR 제품을 잘라 추출하십시오. 그런 다음 준비된 1X 마스터 믹스를 PCR 튜브로 알리쿼트합니다. 멀티 채널 파이펫을 사용하여 마이크로리터 당 40 펨토몰농도로 PCR 제품의 마이크로리터 1개를 추가합니다.
PSB700 벡터의 한 마이크로리터에서 마이크로리터 당 40 펨토몰농도를 추가합니다. 가이드 RNA 올리고뉴클레오티드 대신 1개의 마이크로리터를 사용하여 인서식 제어를 포함하지 않는다. 텍스트 프로토콜에 설명된 Golden Gate 프로토콜을 사용하여 벡터를 소화하고 한 반응에서 삽입을 리게이트합니다.
초기 황금 문 반응 후 각 반응에 BSNB1 효소의 추가 0.5 마이크로 리터를 추가합니다. 1 시간 동안 섭씨 55도에서 반응을 계속하십시오. 황금 문 반응이 완료되면 이전에 설명된 대장균 변환 과정으로 진행한다.
이 연구에서는, 단일 가이드 RNA 발현 벡터는 두 가지 방법을 사용하여 성공적으로 생성된다. 첫 번째 방법에서, 벡터 백본은 일련의 짧은 올리고뉴클레오티드에서 미리 소화되고 리게된다. 두 번째 방법은 황금 문 복제를 사용하여 동시에 단일 반응으로 소화하고 리게이트했습니다.
쌍가이드 RNA 발현 벡터는 각각 자체 독립 프로모터에 의해 구동되며 사용자 지정 PCR 단편을 복제하여 성공적으로 생성됩니다. 이러한 방법 중 하나에 대한 성공적인 복제는 삽입 제어 플레이트에 비해 적절한 삽입 DNA로 변환을 위해 훨씬 더 많은 식민지의 출현을 초래할 것이다. 이 절차를 시도하는 동안 복제 단계에 삽입 컨트롤을 포함하지 않는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라, 후성 유전체 공학 같은 다른 방법은 크로마틴 서명유전자 발현에 어떤 효과 같은 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다.
개요
이 문서는 CRISPR 실험을 위한 단일 가이드 RNA (sgRNA) 발현 플라스미드를 복제하는 간단하고 효율적이며 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 이 기술은 일회성 복제와 쌍을 이루는 가이드 RNA의 생성을 허용합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 분자 생물학
- 유전 공학
- CRISPR 기술
배경
- 가이드 RNA 발현 플라스미드는 CRISPR 응용을 위해 필수적입니다.
- 전통적인 복제 방법은 시간이 많이 소요되고 복잡할 수 있습니다.
- 이 방법은 가이드 RNA 벡터를 생성하는 과정을 단순화합니다.
- DNA 단편의 동시 소화와 결합을 가능하게 합니다.
연구 목적
- sgRNA 복제를 위한 간소화된 프로토콜을 제공합니다.
- 쌍을 이루는 가이드 RNA 생성의 효율성을 시연합니다.
- 유전자 편집 및 후성 게놈 공학의 추가 응용을 촉진합니다.
사용된 방법
- 가이드 RNA 올리고뉴클레오티드 및 발현 벡터 준비.
- 제한 효소를 사용한 플라스미드의 소화.
- T4 DNA 리가제를 사용한 DNA 단편의 결합.
- 리가제 혼합물을 사용한 유능한 E. coli의 형질전환.
주요 결과
- 두 가지 방법을 사용하여 sgRNA 발현 벡터를 성공적으로 생성했습니다.
- 적절한 삽입 DNA와 함께 콜로니 형성이 증가했습니다.
- Golden Gate 복제 방법의 효율성을 입증했습니다.
- 실험에서 삽입 없는 대조군을 포함하는 중요성을 강조했습니다.
결론
- 이 방법은 sgRNA 복제를 위한 신뢰할 수 있는 접근법을 제공합니다.
- CRISPR 기반 실험의 효율성을 향상시킬 수 있습니다.
- 미래 응용에는 크로마틴 서명 및 유전자 발현에 대한 연구가 포함될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Efficient guide RNA cloning is foundational for CRISPR-based target validation and functional genomics in mammalian systems. This streamlined protocol enables rapid generation of single or paired guide RNA vectors, supporting iterative hypothesis testing and mechanistic de-risking in early discovery. Its cost-effectiveness and minimal equipment requirements facilitate broad adoption across R&D teams, accelerating portfolio progression.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid construction of guide RNA vectors for gene function interrogation.
- Supports mechanistic de-risking by facilitating targeted genome editing experiments.
- Improves predictive confidence in target validation through efficient CRISPR reagent generation.
- Allows flexible design of single or paired guide RNAs for pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Prepares validated CRISPR constructs for downstream phenotypic or functional screening.
- Standardizes cloning steps to ensure reproducibility and quantitative output consistency.
- Facilitates assay readiness by enabling quick turnaround of custom guide RNA vectors.
- Supports reliable compound evaluation in gene-edited cellular models.
Translational & Preclinical Research
- Provides continuity from discovery to preclinical studies by enabling precise genome modifications.
- Aligns with translational biomarker strategies through targeted gene perturbation.
- Reduces risk in advancing candidates by clarifying gene function in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
This guide RNA cloning protocol fits at the interface of early discovery and lead identification, enabling rapid hypothesis testing and functional genomics prior to preclinical model development.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis-driven gene editing for pathway and target validation.
- Screening: Delivers reproducible, validated CRISPR constructs for assay development and screening campaigns.
- Analytics: Provides clear readouts via colony formation and control comparisons to assess cloning success.
- Translational Research: Supports continuity by enabling gene editing in mammalian systems relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, reusable workflow for guide RNA cloning across multiple projects and targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Streamlines cloning with minimal specialized equipment, enhancing reproducibility and scalability for small-scale needs.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and capital-efficient resource allocation in early discovery.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by clarifying target biology before preclinical investment.
Implementation Considerations
- Requires standard molecular biology expertise and access to Sanger sequencing for validation.
- Utilizes common laboratory instrumentation and reagents, with no need for specialized equipment.
- Demands cross-team standardization of cloning and validation steps for reproducibility.
- Adaptable to various organisms if compatible guide RNA vectors are available.
- Not suitable for high-throughput library generation; alternative synthesis methods are needed for large-scale applications.
