위드 필드와 공촛점 현미경과 Murine 림프절의 조각에서 T 세포의 생체내 이미징 전

이 절차의 전반적인 목표는 광시야 및 컨포칼 현미경으로 림프절 절편에서 형광 T 세포를 이미지화하는 것입니다. 이는 먼저 마우스 림프절을 제거하고 이를 저융점 에어로에 삽입하여 수행됩니다. 그런 다음 노드를 비브라토로 320미크론 두께의 섹션으로 자릅니다.

다음으로 형광으로 염색된 T 세포를 림프절 절편 위에 도말합니다. 마지막으로, 슬라이스에 침투한 T 세포는 광시야 및 컨포칼 현미경으로 시각화됩니다. 궁극적으로, T 세포가 어떻게 림프절로 동원되는지, 그리고 림프 조직 내에서 어떤 종류의 운동성 행동을 보이는지를 보여주는 스틸 및 비디오 이미지를 얻을 수 있습니다. 그래.

두 개의 현미경 검사 및 손상되지 않은 장기와 같은 기존 금속의 이러한 기술의 주요 장점은 기존의 백색 필드 현미경을 사용하여 T 세포를 3차원 시스템으로 시각화할 수 있다는 것입니다. 그리고 더욱, 조직 문제점에 경미한 준비, 허가 및 접근은 4%의 낮은 융점을 준비하는 것으로 시작한다. 발생액은 PBS에서 발생액을 희석하고 생성된 혼합물이 완전히 용해된 후 전자레인지에 돌림으로써

사용할 때까지 용액을 섭씨 37도로 유지하십시오. 다음으로 플라스틱 접시에 RPMI를 채웁니다. 배양 배지를 완성하고 내경이 4mm인 스테인리스 스틸 와셔를 접시에 넣습니다.

다른 접시에 얼음처럼 차가운 PBS를 채운 다음 약 1.1ml의 RPMI를 추가합니다. 6개의 웰 조직 배양 플레이트에 웰당 완전한 배양 배지를 제공합니다. 6개의 웰 플레이트의 각 웰에 유기형 필터를 삽입하고 섭씨 4도의 플레이트를 놓습니다.

안락사된 마우스에서 주변 조직에서 말초 림프절을 조심스럽게 제거합니다. 림프절은 매우 부드러우므로 조심스럽게 절개하십시오. 조직에서 지방을 모두 제거하는 것은 세포에 매우 독성이 있기 때문에 매우 중요하다.

얼음 석탄 PBS가 들어 있는 플라스틱 접시에 림프절을 놓습니다. 이제 4%aro 젤을 35mm 플라스틱 접시에 붓고 마디를 젤에 섬세하게 옮깁니다. 그런 다음 아로를 얼음 위에 5분 동안 올려 놓고 아로가 굳은 후 접시에서 블록을 제거하고 한천을 다듬어 각 림프절 주위에 약 3-5mm의 젤을 남깁니다.

그런 다음 무독성 접착제를 사용하여 포함된 노드를 viome의 표본 디스크에 부착합니다. 바이옴 탈착식 트레이에 표본 디스크를 설치하고 트레이에 얼음처럼 차가운 PBS를 채웁니다. 느린 범위에서 viome 속도를 설정하고 중간 범위 섹션에서 진동 주파수를 설정하고 320 미크론 두께의 한천 내장 조직을 설정합니다.

첫 번째 절편은 표재성 조직만 포함되어 있으므로 버리고, 가는 집게를 사용하여 림프절 절편을 유기형 배양 삽입물로 절단할 때 조심스럽게 옮깁니다. 각 개별 조각에 스테인리스 스틸 와셔를 놓고 와셔가 림프절 조직을 덮지 않고 주변에 있는지 확인합니다. 그런 다음 섭씨 37도의 온도에서 림프절 절편이 있는 배양 플레이트를 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 배양합니다.

이 단계를 위해 T 세포를 준비하는 동안, Matthew와 Callaghan이 이전에 발표한 JoVE 논문에서 입증된 바와 같이 MIL 10 max 정제를 사용하여 CD 4 positive bead selection을 통해 분리한 IL 7 보충 T 세포를 하룻밤 배양하여 사용합니다. HBSS에서 TCELL을 섭씨 20도에서 중력의 300배로 5분 동안 세척합니다. 새로운 HBSS에 10 곱하기 10에서 밀리리터당 6개의 세포로 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 HBSS 튜브에 하나의 마이크로몰 세포 추적기 녹색 C-M-F-D-A를 추가하고 이 용액을 세포 용액과 결합하여 최종 염료 농도 0.5가 되도록 합니다. 마이크로몰은 섭씨 37도에서 5분 동안 세포 현탁액을 배양합니다. 그런 다음 300배 G와 섭씨 20도에서 5분 동안 완전한 RPMI 배지로 세포를 두 번 세척한 후, Reeses는 표지된 T 세포를 10 곱하기 10의 최종 농도로 밀리리터당 6개의 세포로 구부립니다.

완전한 배양 배지인 신선한 RPMI에서 인큐베이터에서 림프절 절편을 회수합니다. 티슈를 건드리지 않고 피펫으로 와셔 중앙에 들어있는 여분의 매체를 제거하십시오. 피펫 끝으로 10-20마이크로리터의 라벨이 지정된 T-세포를 세탁기 중앙에 부드럽게 분사합니다.

세포 현탁액의 방울이 제자리에 유지되는지 확인하십시오. 림프구가 조직으로 이동할 수 있도록 최소 30분 동안 절편과 T 세포를 배양합니다. 이미징을 시작하려면 현미경의 온도 조절 챔버를 섭씨 37도로 설정하십시오.

림프절 절편을 지속적으로 관류할 수 있도록 융합 시스템을 산소화된 페놀 레드 RPMI로 채우고, 이때 산소가 공급된 RPMI로 작은 플라스틱 접시를 따뜻하게 합니다. 여기에 표시된 시스템에서 관류된 매체는 중력에 의해 한쪽에서 이미징 챔버로 들어갑니다. 매체는 폐기물 수거에 연결된 펌프로 흡인됩니다.

플라스크는 미세한 겸자로 인큐베이터에서 T 세포 침투 림프절 조각을 회수합니다. 미묘. 6웰 플레이트에서 림프절 슬라이스를 제거합니다. 슬라이스를 산소가 공급된 예열된 RPMI 배지에 몇 초 동안 담궈 조직에 침투하지 않은 형광 세포를 씻어냅니다.

그런 다음 갓 씻은 슬라이스를 이미징 챔버에 거꾸로 놓습니다. 나일론 실은 유리에서 조각을 들어 올리고 산소가 함유된 용액이 조직으로 확산될 수 있도록 합니다. 이는 림프절에서의 T세포 이동이 산소에 크게 의존하기 때문에 필요합니다.

그런 다음 슬라이스 위에 스테인리스 스틸 와셔를 놓아 슬라이스를 고정하여 넓은 시야를 캡처합니다. 10배 건조된 대물렌즈를 사용하여 이미지를 수집합니다. 갓 씻은 림프절 슬라이스를 플라스틱 접시에 앞면이 위로 향하게 하여 옮깁니다.

준비물에 와셔를 놓아 고정시킵니다. 이제 슬라이스를 이미지화할 준비가 되었습니다. 정립 컨포칼 현미경의 스테이지에 준비제를 설치하고 20배 대물렌즈로 초점을 맞춥니다.

그런 다음 이미징 세션을 시작하고 획득을 시작합니다. 씨-엠-에프-다. 녹색으로 표지된 T 세포는 여기에서 볼 수 있듯이 이미지 획득 30분 전에 림프절 절편에 추가되었습니다. 이 이미지는 광시야 현미경으로 캡처한 Z 방향으로 50미크론에 걸친 5개 이미지의 최대 투영입니다.

이 비디오에서는 동일한 그림을 명시야 이미지로 볼 수 있습니다. 림프절에 침투한 녹색 형광 T 세포가 9분 동안 광시야 현미경으로 이미지를 촬영한 절편. 애니메이션은 50미크론 Z 투영을 나타냅니다.

슬라이스 내에서 T 세포의 활발한 이동에 주목하십시오. 동일한 현미경 분야에서 개별 T 세포의 궤적은 파란색 저운동성 세포에서 빨간색 고운동성 세포로의 변위 증가를 나타내기 위해 색상으로 구분된 트레일로 여기에 표시됩니다. 트레일은 화성을 사용하여 계산되었습니다.

흰색 선은 노드의 가장자리를 나타내고 점선 타원은 추정 B 세포 영역을 나타냅니다. 여기서 림프절 절편에 첨가된 T 세포를 컨포칼 현미경으로 10분 동안 이미지화했습니다. 애니메이션은 50미크론 Z 투영을 나타냅니다.

예, 이 기술은 다른 유형의 조직에 적용할 수 있습니다. 그리고 흥미로운 것은 slice as a가 인간 종양에서 T-세포 이동과 국소화의 기저에 있는 메커니즘을 탐구할 수 있는 유일한 방법이라는 것입니다. 예를 들어.