Name: Photoactivatable 니코틴의 레이저 플래시 Photolysis를 통해 마우스 뇌 조각에서 Nicotinic 아 세 틸 콜린 수용 체 기능을 프로 빙 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 배우세요 포토활성화 니코틴을 이용한 레이저 플래시 광분해 기술로 마우스 뇌 조각에서 니코틴성 아세틸콜린 수용체 기능을 정밀하게 연구하는 방법입니다. 이 기술은 콜린성 신경생물학 연구에 활용됩니다.

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저자 감사 다음 북서부 주 수 사관 들의 실험실 구성원: Ryan Drenan, D. 제임스 Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy, 그리고 Anis 계약자. 이 작품은 미국 국립 보건원 (NIH) (보조금 DA035942와 R.M.D. DA040626), PhRMA 재단 (친목 M.C.A.), 그리고 HHMI에 의해 지원 되었다.

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<li>Koppensteiner, P., Melani, R., Ninan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cooperative+Mechanism+Involving+Ca%282%2B%29-Permeable+AMPA+Receptors+and+Retrograde+Activation+of+GABAB+Receptors+in+Interpeduncular+Nucleus+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Cooperative Mechanism Involving Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors and Retrograde Activation of GABAB Receptors in Interpeduncular Nucleus Plasticity.</a> Cell Reports. 20 (5), 1111-1122 (2017).</li>
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<li>Ting, J. T., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering+strategies+for+developing+next+generation+BAC+transgenic+tools+for+optogenetics+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Recombineering strategies for developing next generation BAC transgenic tools for optogenetics and beyond.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 111(2014).</li>
<li>Crittenden, J. R., Lacey, C. J., Lee, T., Bowden, H. A., Graybiel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+drug-induced+repetitive+behaviors+and+striatal+overexpression+of+VAChT+in+ChAT-ChR2-EYFP+BAC+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Severe drug-induced repetitive behaviors and striatal overexpression of VAChT in ChAT-ChR2-EYFP BAC transgenic mice.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8, 57(2014).</li>
<li>Kolisnyk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChAT-ChR2-EYFP+mice+have+enhanced+motor+endurance+but+show+deficits+in+attention+and+several+additional+cognitive+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ChAT-ChR2-EYFP mice have enhanced motor endurance but show deficits in attention and several additional cognitive domains.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (25), 10427-10438 (2013).</li>
<li>Nagy, P. M., Aubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+vesicular+acetylcholine+transporter+enhances+dendritic+complexity+of+adult-born+hippocampal+neurons+and+improves+acquisition+of+spatial+memory+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter enhances dendritic complexity of adult-born hippocampal neurons and improves acquisition of spatial memory during aging.</a> Neurobiology of Aging. 36 (5), 1881-1889 (2015).</li>
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</ol>

D.L.W. 관련 나노 형광 현미경 검사 법에 대 한 유료 컨설턴트 역할을 합니다.

PA Nic 응용 프로그램/전달 방법의 선택이 지역화 된 사진-자극 기법에서 가장 중요 한 단계입니다. 두 가지 방법, 목욕 응용 프로그램 및 로컬 관류, 각 고유한 장점과 한계를 제공 합니다. 선택은 셀 유형의 관심 nAChR 기능 식 수준에 의해 크게 영향을. 그것은 종종 목욕 응용 프로그램 데이터 해석을 용이 하 게 기록 된 셀을 둘러싼 유니폼 프로브 농도 대 한 허용 기능 식 수준 높은 때 목욕 응용 프로그램을 사용 하는 것이 좋습니다. 목욕 응용 프로그램 또한 전체 과정을 쉽게 조직에 두 번째 관류 피 펫에 대 한 필요성을 제거 합니다. 그러나, 비싼 목욕 응용 실험 당 더 많은 비용이 화합물.
일반적으로, 문제 해결 이해 왜 아무 nAChR 활성화 본된 다음 플래시 photolysis 하려고 포함 됩니다. PA Nic와 이전 공부 하지는 셀 형식으로 작업할 때 탐정 ACh의 로컬 퍼프-응용 프로그램을 수행 해야 또는 여부를 충분 한 수용 체는 기능적으로 결정 하는 니코틴 표현5. 시스템 photolysis 응답을 감지 할 수 확인 하려면 제어 실험 중간 habenula 신경 수용 체30의 표현에서 행해져야 한다. 이 두뇌 지역에서 PA Nic 목욕 응용 프로그램은 가능, 유효성 검사 실험 하는 것이 좋습니다. 이러한 유효성 검사 실험을 수행한 후만 하나 이동 한다 unstudied 셀 형식. PA-Nic의 농도 증가, 플래시 강도 또는 펄스 기간 증가를 보증 수 있습니다 실험적인 시스템을 검증 하는 경우 응답 남아 매우 작은 또는 탐지 nAChR 긍정적인 allosteric 변조기 nAChR 향상을 추가합니다 활동6또는 이들의 어떤 조합.
때때로, uncaging은 너무 커서, 간접 전압의 결과로 상당한 nAChR 활성화 문이 나+ 채널 활성화와 가난한 공간 클램프 인해 클램프되지 내부 전류. 이러한 아티팩트는 완전히 무명 nAChR 안쪽으로 전류와 데이터 해석 불가능 하 게, 기록 피 펫에 QX-314 (2 mM)의 포함에 의해 제거할 수 있습니다. 그들은 또한 PA-Nic의 농도 감소 시켜 또는 플래시 강도 또는 펄스 기간을 줄여 제거 될 수 있습니다. 모든 보이는 빛 사진 자극 실험에서 자극을 피하기 위해 의도 하지 않은 자극/photolysis 위 또는 원하는 초점 비행기 아래 사이트를 선택할 때 배려를 행사 해야 합니다. 또한 고 때 해당 레이저 전원 해야 합니다 항상 수 적정 생리 적인 응답을 재현 하. 그것은 특히 z 축 photostimulation의 위/아래 초점 자리 활성화는 ligands 수 있습니다 여전히 확산 하 고 연구는 생물 학적 시스템 (예:, 수용 체)와 상호 작용으로 갇힌된 ligands, 작업할 때 알고 있어야 하는 것이 중요.
PA Nic 레이저 플래시 photolysis 수 없습니다 모든 수사에 대 한 적절 한 몇 가지 제한이 존재. 첫 번째는 적절 한 설정의 상대적으로 높은 비용입니다. 그대로 뇌 조각으로 작업할 때 dendrites 필요 2 광자 현미경 같은 정교한 시각화 시스템 처럼 작은 직경 구조 근처 uncaging. Ti:sapphire, 공연 2 광자 현미경에 대 한 가변 적외선 펄스 레이저의 높은 비용 이외는 듀얼 검 류 계 시스템 독립적으로 위치 하지 두 개의 레이저 광선 더 시스템 비용을 증가 시킵니다. 조사는 충분 한 전문성과 시간을 구성, 문제 해결, 이러한 시스템을 유지 하는 경우 집에서 만든 시스템을 사용 하 여 전체 시스템 비용을 줄일 수 있습니다. 종종 두 번째 제한 포함 낮은 nAChR 기능 식, 부분적으로 위에서 언급 한 단계를 취 함으로써 완화 될 수 있습니다, 하지만이 성공 하지 못할 수 있습니다. 일반적으로, 하나 agonists의 퍼프-응용 프로그램을 다음 ligand 활성화 전류를 측정할 수 없다, 만약 PA Nic 플래시 photolysis 전압 클램프 아래 하지 허용 결과 얻을 수 있습니다. 세 번째 제한 포함 본질적인 형광 PA 상태가 PA-Nic의 ~ 405 nm 빛을 흡수 하 고 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 알 렉 사 4885비슷한 범위에서 방출. PA Nic 농도 ~ 1 mM를 초과 하는 경우이 형광 속성 동시에 신경 구조를 시각화 도전 할 수 있습니다. 이 줄이기 위해 쉽게 관류 피 펫에서 PA-Nic의 흐름을 제어할 수 중요 하다. 정기적으로, PA Nic 흐름 멀리 확산 형광 분자를 허용 하도록 중단 됐다. 이 다시 uncaging 광속의 자리 위치를 확인 하기 위한 신경의 이미징 허용. 4 잠재적인 제한 언급 하는 photolysis에 대 한 405 nm 빛의 사용을 포함. 405와 같은 짧은 파장 nm 두뇌 분할 같은 복잡 한 조직에 더 산란 하는 경향이 있다. 따라서, 주어진된 플래시 강도 및 기간에 uncaging 응답 진폭 및 감퇴 속도 론 수 수 차동 영향을 조각 내 uncaging 초점의 깊이. NAChRs의 생물 학적 측면에 대 한 결론으로이 중요 한 경고를 해야한다.
이 지역화 된 레이저 플래시 photolysis 기술은 최근 nAChR 신경 생물학에 대 한 새로운 정보를 밝히기 위해 사용 되었습니다. 예를 들어 만성 니코틴 노출 perisomatic 및 중간 habenula 뉴런5수지상 nAChR 기능을 향상 시킵니다. 그것은 또한 복 부 tegmental 지역 조미료 신경 그들의 perisomatic에 수지상 세포 구획6기능 nAChRs 익스프레스 처음으로 보여줄 수 있도록 사용 되었다. 이 기술을 사용 하는 많은 잠재적인 미래 그리고 접근에는 있는 대뇌 피 질의 각 추 모양 신경31 등 대뇌 피 질32, 수 표현 nAChRs가33 다른 주요 신경 종류에 적용할 수 있습니다. , 그리고 해 마19. 이 기술은 또한34 다른 신경 구획을 특정 수용 체 하위 지역화를 편집 하는 약리학 또는 nAChR 유전자와 결합 수 있었다. 접근 포함 하 되이 제한 되지 않고, 그 PA Nic5와 병렬로 개발 다른 coumarin 갇힌 화합물에 쉽게 적용할 수 있습니다. 마지막으로, 펜 실바 니 아-Nic 플래시 photolysis 5 월 1 일에서에서 사용할 수 깨어/행동 동물 소설 행동 약리학 패러다임에 니코틴의 행동을 연구.

해 신호 attentional 제어, 지 운동, 및 보상1,2를 포함 하 여 수많은 두뇌 프로세스를 조절 한다. 아 세 틸 콜린 (ACh) 전송 향상 약물 인지3해 시스템에 대 한 중요 한 역할을 암시 하는 Alzheimer의 질병과 관련 된 인지 장애를 치료 하는 데 사용 됩니다. 해 수용 체와 건강 및 질병 상태에서 회로의 향상 된 이해는 여러 가지 신경 질병/장애에 대 한 더 나은 치료 접근으로 이어질 수 있습니다.
Nicotinic ACh 수용 체 (nAChRs) 양이온 또는 응답으로 생 ACh exogenous 니코틴 담배 제품에서 유출 하는 ligand 문을 단 이온 채널의 가족입니다. 설명4첫 신경 전달 물질 수용 체 가운데 그들이 사실을 감안할 때, nAChR 약리학 및 위치 근육 섬유에 근육 형 수용 체에 대 한 파악 이다. 대조적으로, 비교적 작은 약리학 및 두뇌에서 네이티브 nAChRs의 subcellular 배포에 대 한 알려져 있다. 지식에이 격차는 최근 세포 이미징 및 electrophysiological 기록5중 뇌 조직에서 nAChRs의 공간적으로 제한 하 고 급속 한 활성화에 대 한 있도록 새로운 화학 프로브를 개발 하 여 해결 됩니다. 여기,이 접근에 관련 된 주요 방법론 단계 설명, 신경 구조와 nAChR 함수를 연결 하는 기능 향상의 전반적인 목표와 함께 합니다.
Photoactivatable 니코틴 (PA-Nic; 화학 이름: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-아미노] coumarin-4-yl] 메 틸 니코틴) photolyzed ~ 405 nm 레이저 섬광 효율적으로 니코틴5,6출시 될 수 있습니다. Uncaging, 이전 펜 실바 니 아-Nic 솔루션에서 안정적 이며 전시 아니 형편이 약리학 또는 광화학 기능5. Photolysis, 후 출시 된 니코틴은 예상 대로 nAChRs 활성화 되며 uncaging 부산물 약리학 불활성5. 연속파 레이저는 출력 전력 photolysis 광원으로 사용 > 1 mW 샘플에서 측정. 지역화, 타겟된 사진-자극은 및 결합 된 2 광자 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (2PLSM), 세포 막으로 찾을 수 있는이 방법의 두 가지 주요 장점을 완벽 하 게 실현: photolysis 속도 공간 정밀도.
대부분의 측면에서 PA Nic의 photolysis 뇌 조각 내 수용 체에 ligands nAChR 제공의 다른 방법에 우량 하다. 이러한 접근 등 목욕 응용 프로그램7 지역 마약 배달 통해 호흡기 피 펫8입니다. 전 접근-적용된 약물의 장기 효과 강조 하는 경향이, 반면 후자의 접근 시련과 셀에 걸쳐 응답 속도에 변화에서 겪을 수 있다. 이 다른 접근의 둘 다 적절 하 게 동일한 신경 세포에서 다른 세포 위치에 수용 체 활동을 구분할 수 있습니다. 하지만 ACh의 릴리스 Optogenetically 활성화 네이티브 nAChRs9,,1011의 조사를 위해 사용 되는 매핑 subcellular nAChR 위치에 대 한 유용한 입증 되지 않은. 게다가,이 접근을 이용 하 여 대부분 연구 비정상적인 해 전송12,,1314, 와 ChR2을 표현 세균성 인공적인 염색체 유전자 변형 마우스에 의존 해야 15 , 16 , 17.
PA Nic photolysis 해 수용 체를 공부만 광학 접근 아니다. 갇힌된 carbachol 기능 배양된 세포18 과 뇌 조각19, ACh 수용 체 활동을 매핑하는 데 사용 했다 하지만 PA 상태가의 개발 하는 동안 비교 연구를 위해 상용 되었다 루 테 늄 bis (bipyridine)-복잡 한 니코틴 (RuBi-니코틴) 니코틴 uncaging20에 대 한 허용 것으로 알려졌다 하지만 RuBi-니코틴 머리 비교에서 PA Nic에 열 등 한 입증의 상업적인 준비 연구5. 비-상업와 같은 비교 실험을 반복 하는 것이 유용할 수 있습니다 높은 RuBi 니코틴을 정화 하는 그것의 보이는 흡수 해 연구에 대 한 PA-Nic의 기능을 칭찬 수로. 마지막으로, nAChRs가 또한 되었습니다 광학 조작 사진 전환 ligands의 수용 체 유전자 변형21조합을 사용 하 여. 이 방식은 수정된 nAChR 장점 및 단점으로 볼의 대상으로 유전자의 기능/요구 사항으로 뇌 조직에 PA-Nic photolysis를 보완 합니다.
이 방법의 몇 가지 주요 요구 사항은 주목 해야 한다. 첫째, 적절 한 시각화 방법 신경 막 정확 하 게 찾이 필요 합니다. 배양된 세포, 공부를 할 때 기존의 피-형광 현미경 검사 법으로 이미징 충분 한 될 수 있지만 뇌 조각 또는 다른 두꺼운 조직 준비에 뉴런에서 녹음, 2PLSM 또는 confocal 현미경 검사 법은 요구 사항. 둘째, 적당 한 방법 photolysis 레이저 빔 위치 필요 합니다. 이 방법은 래스터 이미징 빔 및 포인트 photoactivation uncaging 레이저 빔22,,2324를 사용 하 여 검색을 위한 두 개의 독립적인 x-y 거울으로 듀얼 검 류 계 스캔 헤드를 활용 합니다. 다른, 더 많은 제한 된 솔루션 또는 래스터 스캔 이미징 빔 및 uncaging 광속, 또는 (2) 간단 하 게 되도록 셀 가져 시야의 센터에 uncaging 빔을 감독 (1) 단일-검 류 계 스캔 머리와 같은 가능 하다 플래시 photolysis을 위한이 위치. 셋째, 시스템은 필요 하나 실험 동안 생리 신호를 수집 하고자 하는 경우 동시 electrophysiological 기록. 위의 요구 사항 적합 한 모든 광학 이미징 기술, 최근 설명된5로 만나게 될 수 있습니다. 다음, 상세한 프로토콜은 포함 하는이 방법의 주요 단계를 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Instrument, Consumables, and Miscellaneous Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B</td><td>Molecular Devices Corp.</td> (스트롱기기, 소모품 및 기타 화학 물질)<td></td><td>패치 클램프 증폭기</td></tr><tr><td>공압 Picopump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>온도 컨트롤러</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>진동 블레이드 마이크로톰</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC 원심 필터</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>UFC30GV0S 내부 용액 필터</td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세 혈</td>관 <td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td>패치 및 로컬 응용 피펫</td></tr> <tr><td>(-) - 니코틴 수소 주석산 염</td><td>Glentham</td><td>GL9693</td><td>니코틴 염</td></tr><tr><td>7- 카르복시 메틸 아미노 -4- 메틸 쿠마린</td><td>Janelia Research Campus</td><td></td><td>PA-Nic 부산물</td></tr><tr><td>1-[7-[비스(카르복시메틸)-아미노]쿠마린-4-일]메틸-니코틴</td><td>Janelia Research Campus</td><td></td><td>PA-Nic</td></tr><tr><td>Euthasol (펜토바르비탈 나트륨 및 페니토인 나트륨)</td><td>Virbac</td><td>ANADA #200-071</td><td></td></tr><tr><td>Alexa FluorTM 488 Hydrazide</td><td>ThermoFisher</td><td>A10436</td><td>green fill dye</td></tr><tr><td>Alexa FluorTM 568 Hydrazide</td><td>ThermoFisher</td><td>A10437</td><td>red fill dye</td></tr><tr><td>6- carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594)</td><td>Janelia Research Campus</td><td></td><td>레드 필 염료</td></tr><tr><td>QX 314 염화</td>물 <td>Tocris</td><td>2313</td><td>전압 게이트 나트륨 채널 차단제</td></tr><tr><td>파워 미터&nbsp;</td><td>ThorLabs</td><td>S120C</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Chemicals for Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-D-glucamine</td><td>Sigma</td><td>M2004</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성 일수화물</td><td>시그마</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>시그마</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-글루코스</td><td>시그마</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>(+)-L-아스코르브산나트륨</td><td>시그마</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>티오우레아</td><td>시그마</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루브산</td><td>시그마</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 황산염 헵타 하이드레이트</td><td>시그마</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>시그마</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜 -비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N 프라임 ;, N 프라임; -테트라아세트산</td><td>시그마</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 5&프라임;-트리포스페이트 마그네슘 염</td><td>시그마</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>구아노신 5&프라임;-트리포스페이트 나트륨 염 수화물</td><td>시그마</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>2-Photon Microscope의 구성 요소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Olympus BX51 현미경용 Ultima 레이저 스캐너</td><td>Bruker Nano, Inc.</td><td></td><td>이미징 소프트웨어 및 Galvos</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 이미징 X-Y 검류계</td><td>Cambridge Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Mai Tai HP1040</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>조정 가능한 IR 레이저</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Pockels 셀 M350-80-02-BK(M302RM 드라이버 포함)</td><td>Conoptics, Inc.</td><td></td><td>IR 레이저 감쇠용</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 통합 Sphere 포토다이오드 파워 센서</td><td>Thorlabs, Inc</td><td></td><td>레이저 파워 픽오프 포토다이오드</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 언케이징 X-Y 갈바노미터</td><td>Cambridge Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Helios 2-Line Laser Launch</td><td>브루커 나노, Inc.</td><td></td><td>언케이징 레이저 부품</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; OBIS LX/LS 405nm(100mW)</td><td>코히런트, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; OBIS LX/LS 473nm(75mW)</td><td>코히런트, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 리무진 사이드카용 포인트 광활성화 / 광섬유 입력 모듈 - uncaging</td><td>Bruker Nano, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Upright Microscope</td><td>&nbsp; Olympus</td><td>BX51WIF</td><td>정립 현미경 섀시</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 대물렌즈: 올림푸스 M 플랜 FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm</td><td>&nbsp; 올림푸스</td><td></td><td>10x 대물렌즈</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 목표: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR</td><td>&nbsp; Olympus</td><td></td><td>60x 수침 대물렌즈</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; X-Cite 110, 4-LED LLG 결합 에피 형광 광원</td><td>Excelitas Technologies</td><td></td><td>LED 광원</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td>LED 필터는 블루라이트 자극을 위한</td></tr> 것입니다<tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td>LED 필터는 녹색 빛 자극을 위한 것입니다</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 비& W CCD 카메라; Watec, 0.5 in B/W CCD</td><td>Watec Co., LTD.</td><td></td><td>패치 클램프 녹화용 CCD 카메라</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>외부 검출기 - 이중 반사 방출 - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP)</td><td>Bruker Nano, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 다중 알칼리 사이드온 PMT</td><td>하마마츠</td><td>R3896</td><td>레드 채널 PMT</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 595/50m</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td>적색 채널 방출 필터</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 565lpxr</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td>이색성 빔 스플리터</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; GaAsP 엔드온 PMT</td><td>하마마츠</td><td>7422PA-40</td><td>그린 채널 PMT</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 525/70m</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td>친환경 채널 방출 필터</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Hamamatsu H7422</td><td>PMT Vincent Associates / Bruker</td><td>517329</td><td>PMT 셔터 마운트</td>용 고속 셔터</tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Dodt 그라디언트 대비 투과 감지 모듈</td><td>Bruker Nano, 주식회사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 다중 알칼리 사이드온 PMT</td><td>하마마츠</td><td>R3896</td><td>Dodt PMT</td></tr></tbody></table>

photoactivatable 니코틴의 레이저 플래시 photolysis를 통해 마우스 뇌 조각에서 nicotinic 아 세 틸 콜린 수용 체 기능을 프로 빙

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

아 세 틸 콜린 (ACh) 수용 체 신경 프로세스의 다양 한 변조를 통해 작동 하지만이 함수를 실시 하는 세포 내 subcellular 위치 ACh 수용 체 기능을 연결할 도전 되었습니다. Nicotinic ACh 수용 체 (nAChRs) 네이티브 뇌 조직에서의 subcellular 위치, 공부 하는 광학 방법 electrophysiological 녹음 하는 동안 개별 위치 신경 막 근처에서 니코틴의 정확한 출시 위해 개발 되었습니다. 패치 클램프 뉴런 뇌 조각으로 가득 차 있습니다 염색 2 광자 레이저 스캐닝 현미경 검사 법, 동안 그들의 형태학을 시각화 하 고 하나 이상의 세포 막 근처 405 nm 레이저 빔을 초점 빛 플래시 실행 됩니다 니코틴 uncaging. 세포질 현재 심한, 측정 그리고 기록 된 신경의 고해상도 3 차원 (3D) 이미지 nAChR 반응과 세포 형태학의 화해 수 있도록 이루어집니다. 이 메서드는 복잡 한 조직 준비, cholinergic neurotransmission의 이해를 강화 하는 약속에 nAChR 기능 배포의 상세한 분석에 대 한 수 있습니다.

Photolysis에 대 한 자극, 노출 복용량 (강도 및 시간), 노출 위치 및 빔 형상은 주요 변수. 이 문서에서 설명 하는 시스템은 두 개의 다른 photostimulation 빔, 가변을 통해 광선 검 류 계 시스템을 입력 하기 전에 렌즈 / photostimulation 빛 경로 이동 가능 합니다. 이 렌즈 없이 photostimulation 빔 채웁니다 60 x의 입구 눈동자 / 물 찍기 [60 x WD] 1.0 나 목표, 근처-회절-제한 된, 시료 내 초점면에서 sub-µ m 자리를 생산. 이것은 photostimulation 확장 초점 광학 축 대칭 위아래는 모래 시계 모양으로 빛에 연관 된다. 경로에 삽입 하는 렌즈 photostimulation 레이저 광 대물 렌즈의 입구 눈동자에 초점을 맞추고와 연필 모양의 빔으로 종료 됩니다. ~ 10 µ m 직경 60 x 목표에 대 한 예정 이다,이 빔 균일/세로 샘플을 통해 확장 합니다. 이 모드에서는 자극 자리 내의 어떤 주어진된 위치에서 빛의 강도 회절 제한 근처 작은 자리 강도의 ~ 1% 될 것입니다. 따라서 높은 레이저 능력은 ~ 10 µ m 자리 자극을 사용 하는 경우에 일반적으로 필요한. 이 문서에서 보고 하는 모든 실험, 모래 시계 형 photostimulation 빔 사용 되었습니다.
입력된 전압 설정 후 전력 측정기를 사용 하 여 샘플에서 레이저 전력 측정에 대 한 배달된 샘플 파워를 그릴 수 있습니다. 이러한 연구 2 mm의 작동 거리와 WD 목표 x 60을 사용 하지만 그것은 하지 전력 측정 감지기 요소에 손상을 방지 하기 위해 물에 잠긴. 목표와 나열 하기 &gt; 0.95 (침수 액체) 없이 측정, 낮은 인덱스 (공기)로 인해 렌즈 앞 얼굴 요소에서 총 내부 반사 손실 될 수 있습니다. 이 경우에, 더 정확한 샘플 전력 측정 (총 내부 반사 손실에 대 한 수정)에 대 한 1.0 나 객관적인 (1.0/0.95)2 공기에서 측정 하 여 측정 된 힘을 증가. 그림 1a 보여줍니다 405에 대 한 일반적인 입/출력 음모 및 473 nm 보이는 레이저는 레이저에 통합 실행이 연구. 이 레이저 시스템은 다음과 같은 이유로 사진 자극 노출 복용량 제어에 적합: (1) 그들은 입력된 전압을 기준으로 직접 선형 전원 출력을 제공 하는 사전 보정 (0-5 V), (2) 그들은 (아무 레이저로 자동 셔터 동작을 제공 출력), 그리고 (3) 그들은 빠른, 하위-ms 강도 펄스 기간 제어 (0.1 ms 응답). 레이저/galvo 시스템과 현장 사진-자극을 사용 하 여, MarkPoints 관광 명소의 일상적인 보정 필수 작업입니다. 그림 1b (왼쪽된 패널) 교정은 시스템을 보여 줍니다 (사진 자극을 원하는 지점 초래 하지 않습니다 그 포인트의 정확한 자극 화상 구멍 위치에 표시 된 대로), 교정 ( 후의 정확한 위치에 복귀와 함께 그림 1b, 오른쪽 패널). 
PA-Nic는 겸손 하 게 형광 (방출 피크 ~ 510 nm), 350-450 nm (1-광자 여기) 또는 700-900 nm (2 광자 여기)5사이 효과적인 여기 전시. 로컬 응용 프로그램 동안 PA-Nic를 시각화 하기 위해 PA-Nic (1 mM) 뇌 조직의 동시 영상 (1) 뇌 조직 광학 sectioned 전송 컨텍스트 Dodt 대비 및 (2) 내보낸된 형광을 통해 여기에서 뒤 근처 적용 (900 nm)의 PA 상태가 PA-Nic 2PE 형광 로컬 응용 프로그램 피 펫 (그림 2a)에서 압력 방출 동안 쉽게 감지 했다. 니코틴과 monoalkylcoumarin, 7-carboxymethylamino-4-메 틸 coumarin PA Nic photolysis 반응5주요 광화학 제품입니다. 같은 설정/매개 변수 PA-Nic 이미징에 사용 된 이미지를 사용 하 여 조직 되었다 니코틴 (1 mM) 또는 7-carboxymethylamino-4-메 틸 coumarin (1mm)의 전달 중 몇 군데. 형광 신호 감지 되었습니다 (그림 2a, 중간과 더 낮은 패널), PA Nic 결과의 특이성을 보여주는. 마지막으로, 펜 실바 니 아-Nic 뇌 조직 내에서 적용 하 고 PA Nic 형광 방출은 몇 군데 (그림 2b). 이 방법은 PA-Nic는 로컬 응용 프로그램 피 펫의 100-200 μ m 내에서 존재 하는지 확인 합니다. 함께, 이러한 데이터 확인 PA Nic 로컬 응용을 통해 뇌 조직에 효과적으로 전달 합니다.
세포질 구조의 시각화를 위한 동시 2PLSM와 전기 생리학 기록 요구는 실험의 두 구성 요소에 대 한 균형 고려 사항 조사 이며 종종 좁은 시간 창 (~ 20 분)에 사용할 수 있는 유효한 패치 셀에서 샘플 데이터 취득입니다. 세포질 시각화를 고려 하지 않고 그것은 침입 기록 안정성 때문에 시간과 함께 감소 경향이 후 가능한 한 빨리 기록 시작 하. 그러나, 이미징 요구 때 electrophysiological 고려는 작은/원격 구조에 형광 농도 증가 대 한 충분 한 시간을 허용 해야 합니다. 이 파생 셀 신형 이미징 때 때때로 유용 곡선28, 작성 염료 농도 검사 하 여 exemplified입니다. 그림 3 은 몇 가지 예를 들어 신경 2PLSM 통해 Z 더미로 몇 군데와 프레 젠 테이 션을 위해 최대 강도 투영으로 축소를 보여준다. 그림 3a 높은 품질 이미지 어디 신경 형태학 완료 될 것으로 보인다, 잡음을 최소화 하 고, 파편 세포 형태학의 해석에 방해가 되지 않습니다 보여줍니다. 그림 3b 는 낮은 신호 대 배경 비율 및 내용이 풍부한 파편 때문에 낮은 품질의 이미지를 보여줍니다. 이 파편은 종종 셀을 접근 하는 동안 패치 피 펫에서 염료를 이미징의 방출에서 발생 하는 강렬한 형광의 구형 주머니로 나타납니다. 특히, 100 µ M의 PA-Nic 목욕 (목욕 응용 프로그램 수행) 하는 경우에 신호-배경 비율을 감소 하는 경향이 있으며 최적의 이미지 대비 리드. 알 렉 사 Fluor 568 또는 594는 파인더 염료로 또는 정규화 2PE 참조/정규화로 종종 로컬 응용 프로그램 실험에 매우 유용 합니다. 이러한 염료의 2 광 양자 흥분에 대 한 효과적인 파장 ~ 780 nm27, PA-Nic의 동시 시각화 및 세포질 구획의 식별을 허용 하는. 그러나이 파장 않습니다 하지 완전히 하지 마십시오 PA Nic5의 2 광자 photolysis를. 알 렉 사 Fluor 488 이다 PA Nic 목욕 응용 실험; 적당 한 파장 ≥900 nm, 흥분 할 때 PA Nic5 의 2 광자 photolysis 세포질 구획의 적합 한 시각화 유지 하면서 피할 수 있습니다.
그림 4 뇌 조각에 MHb 뉴런에서 지역화 된 PA Nic 레이저 플래시 photolysis에 대 한 예제 데이터를 보여 줍니다. 그림 4a (상위 패널) MarkPoints 프로토콜 실행, 사진-자극 자리 위치와 겹쳐 전에 찍은 마지막 2PLSM 이미지의 화면 캡처 "참조" 이미지의 예를 보여 줍니다. 그림 4a (낮은 이미지 패널) 표시 사진 자극의 확대 보기 자리 세포 형태학에 중첩. PA Nic photolysis에 해당 시간 상관 electrophysiological 응답 그림 4a의 아래쪽 패널에 표시 됩니다. 이전 작품 시연이 현재 nAChR 길 항 근5에 민감합니다. 다른 셀 단일 자리 photolysis 1의 간격에서 수행 되었다에서 대표 데이터를 표시 하는 그림 4b s 또는 10 s. 10 s 간격 현재 보유 기준선에 대 한 충분 한 회복 시간을 허용 하는 반면, 짧은 1 s 간격에 지도 프로토콜로 현재 지주에 점진적 증가 하였다. 증가 하는 현재 제안 니코틴 1 Hz 간격29와 시스템에서 확산에 충분 한 시간이 없 었 어 요. 이러한 시간 응답 분석 해야 드 노 보 공부 되 고, 어떤 새로운 셀 형식에 수행 nAChRs의 neuropharmacology 세포 유형 사이 다를 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig1.jpg"> 그림 1: Photostimulation 레이저 교정. (한) 사진-자극 레이저 전원 출력. 샘플 평면에서 (60 x 통해 1.0 / 나 물 찍기 목표) 405에 대 한 측정 및 표시 출력 설정에서 473 nm 사진 자극 레이저. (b) 사진-자극 레이저 교정. 화면 캡처 이미지 표시 의도 사진-자극 자리 사진 자극 발생 (화상-구멍) 하기 전 (왼쪽) 해당 위치 사이의 공간적 관계와 MarkPoints에서 (오른쪽) 실행 교정 후. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig2.jpg"> 그림 2: PA-Nic 로컬 응용 프로그램. (한) 탐지의 PA-Nic 로컬에서 응용 프로그램 피 펫. 1mm PA-Nic, photolysis 부산물, 또는 니코틴 실제에 녹아, 로컬 응용 프로그램 피 펫에 로드 되었고 2PLSM 동안 뇌 조직에 적절 하 게 (900 nm 여기) 각 약물에 대 한 동일한 이미지 설정을 사용 하 여 이미징. 레이저 Dodt 대비 전송 이미지 스캐닝 GaAsP 음극 PMT는 형광 방출을 캡처하는 데 사용 하는 반면 조직/피 펫을 보여 줍니다. (b) PA-Nic (1 mM) 뇌 조직으로 끼얹는다 고 PA-Nic 사용 하 여 그것의 본질적인 형광의 측면 확산 표시 (a)와 같이 2PLSM를 통해 몇 군데. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig3.jpg"> 그림 3: 2-광자 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 심상의 수집. (한) 최적의 2PLSM Z-누적 됩니다. 2PLSM Z-스택 최대 강도 계획의 두 가지 예 잘 해결된 dendrites와 MHb 뉴런에 대 한 표시 되며 거의 아무 간섭 파편. (b) 최적의 2PLSM Z-누적 됩니다. 2PLSM Z-스택 최대 강도 계획의 두 가지 예는 파편 (염료 셀 접근 동안 피펫으로에서 추방)으로 둘러싸인 MHb 뉴런에 대 한 표시 됩니다. 이러한 이미지는 이미지 (a)에 표시 한 것과 같은 보다 해석 하기가 더 어렵습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig4.jpg"> 그림 4: PA 상태가의 레이저 플래시 photolysis (한) MarkPoints 참조 이미지 및 내부 전류 PA Nic photolysis에 의해 불러 일으켰다. MHb 뉴런 하나에 대 한 원시 참조 이미지 MarkPoints 사진 자극 재판 한 (표시 된) 세포 위치에 표시 됩니다. 일부 사진-자극 위치 (이 시리즈의 맨 오른쪽 이미지)에 대 한 유의 수지상 구조 초점에서 하지만 소마와 근 모 수석. 각 참조 이미지 아래 니코틴 uncaging 갖는 내부 전류 플롯 됩니다. PA Nic photolysis에 대 한 (b) 간 자극 간격입니다. 표본 녹음 MHb 뉴런에 대 한 표시 됩니다 어디 니코틴 아니었다 반복적으로 갇힌 1 간 자극 간격 동일한 perisomatic 위치에 s 또는 10 미 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 문서는 니코틴 uncaging에 의해 마우스 뇌 조각에서 nicotinic 아 세 틸 콜린 수용 체 (nAChRs) 공부에 대 한 메서드를 제공 합니다. 동시 패치 클램프 기록 및 2 광자 레이저 스캐닝 현미경 검사 법으로 사용할 경우 해 신경 생물학의 깊은 이해를 제공 하는 세포 형태학 nicotinic 수용 체 기능을 연결 니코틴 uncaging 합니다.

Photoactivatable 니코틴의 레이저 플래시 Photolysis를 통해 마우스 뇌 조각에서 Nicotinic 아 세 틸 콜린 수용 체 기능을 프로 빙

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...

이 기술은 광액성 니코틴 분자의 레이저 플래시 사진 용액과 함께 다중 광자 레이저 스캐닝 현미경 검사를 활용합니다. 니코티닉 콜린 체 수용 체의 정확한 활성화를 허용. 이 기술은 니코틴 수용체 작용제 응용에 대한 미세한 경련성 제어를 허용하고, 수용체 기능적 발현 패턴 및 콜린성 시냅스 또는 부피 전송의 연구를 위한 강력한 도구를 제공한다.시술을 시작하기 전에 프로그래밍 가능한 파이펫 풀러를 사용하여 20-40 마이크로미터 개구름이 있는 유리 마이크로 파이프를 당깁니다. 0.22 미크론 필터를 통해 레코딩 용액의 약 1 밀리리터를 변형시보. 그리고 여과된 레코딩 용액에서 충분한 lyophilized 광액 활성 니코틴을 재중단하여 2밀리머 최종 농도를 산출한다.포토액티브 약물의 50 마이크로리터로 당겨진 로컬 응용 마이크로파이프를 백필하고 마이크로 조작기에 장착된 파이펫 홀더에 파이펫을 고정합니다. 적절한 튜브 길이를 통해 파이펫 홀더를 지속적인 저압 적용이 가능한 압력 배출 시스템에 연결합니다. 그리고 마이크로 조작기를 사용하여 로컬 응용 프로그램 파이펫을 세포 외 기록 솔루션으로 기동합니다.피펫 팁을 마우스 뇌 조직 샘플 위에 약간 배치하고, 관심 있는 세포로부터 약 50 마이크로미터를 배치합니다. 그리고 간략하게 파이펫에 압력의 평방 인치 당 1 ~ 2 파운드를 적용합니다. 관심 있는 셀의 변위가 최소화되어야 합니다.안정적인 전세포 패치 클램프를 달성한 후, 압력 배출 장치에 대한 낮은 적용을 켜고, 1~2분 동안 광액활성 니코틴으로 세포를 둘러싼 조직을 포화시한다. 로컬 응용 프로그램은 실험에 추가복잡성을 도입합니다. 그러나 화합물을 절약하고 PA-Nic의 높은 농도를 활용할 수 있습니다.광액활성 니코틴의 목욕 적용을 위해, 먼저 100 마이크로몰러 최종 농도로 연속 재순환에 적합한 기록 용액의 부피에 용액의 충분히 용해. 그리고 결과 혼합물을 관류 시스템에 로드합니다. 그런 다음 분당 1.5~2밀리미터 속도로 광액활성 니코틴 용액의 재순환을 시작하여 최소한의 내지름과 전체 길이의 튜브를 사용하여 필요한 재순환 량을 최소화합니다.재순환 하는 동안, 지속적으로 카보겐으로 용액을 거품, 낮은 조명 조건에서 섭씨 32도에서 목욕 온도를 유지. 목욕 응용 프로그램은 조직의 PA-Nic 투과의 단순성과 균일성의 혜택을 누릴 수 있습니다. 그러나 그것은 반드시 낮은 micromolar PA-Nic 농도 활용, 화합물의 높은 총 금액을 소비.내측 하베눌라 뉴런의 라이브 시각화를 위해, 전송된 빛 또는 적외선 차동 간섭 대조 광학 및 비디오 카메라를 사용하여 안정적인 전세포 패치 클램프 레코딩을 설정합니다. 고저항 셀 부착 구성을 설정한 후 침입하기 전에 설정 및 소프트웨어를 레이저 스캐닝 모드로 전환합니다. 침입 후 레이저 스캐닝을 사용하여 화상 이미징 염료가 확산에 의해 신경을 수동적으로 채우고 있는지 확인합니다.염료가 살아있는 스캔 기능을 사용하기 전에 적어도 20~30분 동안 셀룰러 구획을 채우도록 하여 신경과 셀룰러 구획을 시각화합니다. 신경 기능의 정확한 라이브 시각화를 허용하는 이미징 매개 변수를 선택하고 적절한 설정을 조작하여 디스플레이 시각화, 해상도, 신호 대 노이즈 비율 및 이미지 프레임 획득 시간에 영향을 미치거나 변경합니다. 신호 대비를 향상시키기 위해 조회 테이블 창을 열고 조회 테이블 바닥 과 천장 설정을 조정합니다.조직 내에서 관심 영역을 찾으려면 1X 광학 줌을 선택하고 패닝 컨트롤을 사용합니다. Z 계열 도구를 사용하여 관심 셀이 포함된 시작 및 중지 위치를 선택합니다. 하나의 마이크로미터의 단계 크기를 설정하고 가장 높은 해상도의 이미지를 생성할 이미지 크기를 선택합니다.종종 1, 024 x 1, 024 라인당 픽셀. 그런 다음 세포를 포함하는 모든 Z 평면에서 뉴런을 연속적으로 이미지화합니다. 레이저 자극을 보정하려면 이미징 레이저 전력이 최소보다 큰 시스템 스캐닝을 시작하고, 얇은 빨간색 마커 형광 층에 목표 초점을 미세 조정합니다.형광장 내의 영역을 선택하여 이물질이 없는 부분을 고르게 코팅하고 도구, 교정 및 정렬 메뉴를 열어 끊임없는 갈증 기능을 선택합니다. 405나노미터 레이저, 400의 레이저 자극 력, 20밀리초의 자극 지속 시간을 선택하여 두 번째 갈바노미터 미러 쌍의 공간 보정을 위한 화상 반점 자습서를 따르십시오. 빨간색 마커에 1~5마이크로미터 직경의 구멍을 산출합니다.중앙 스팟 화상 후 이미지를 자극하고 새로 고치고 둥근 빨간색 표시기를 중앙, 오른쪽 중앙 및 아래 중심 반점의 실제 스팟 위치로 이동하여 9개의 스팟그리드를 획득하도록 업데이트를 선택합니다. 교정을 테스트하려면 마크 포인트 창을 열고 샘플의 새 영역에서 정의된 스팟의 자극 매개 변수를 수동으로 활성화하여 올바른 최신 교정 파일이 마크 포인트 창에 로드되는 것을 주의하십시오. 그런 다음 테스트 펄스를 적용하여 올바른 교정을 확인합니다.관심 있는 셀룰러 영역을 간략하게 이미지화하고 찾으려면 라이브 스캔을 선택하고 광학 줌을 늘려 필요에 따라 작은 구조를 시각화합니다. 세포막에 인접한 마크 포인트 단일 스팟 십자선을 배치하고, 사진 자극 매개변수를 1-50밀리초 지속 시간, 1-4 밀리와트 레이저 전력 및 적어도 하나의 예심으로 설정합니다. 그런 다음 실행 마크 포인트를 선택하여 마크 포인트 프로토콜을 시작하고 전기 생리학 데이터 수집을 실시간으로 관찰합니다.1밀리머 PA-Nic의 광액 활성성 니코틴 2PE 형광은 입증된 바와 같이 현지 응용 파이펫에서 압력 배출 중에 쉽게 검출된다. 광액탄성 니코틴 광석 반응의 주요 광화학 제품의 전달은 동일한 농도 및 흥분 력 및 파장에서 형광 신호를 생성하지 않습니다. 광액 활성 니코틴 결과의 특이성을 입증.입증된 바와 같이 뇌 조직에 적용된 광액활성 니코틴의 이미징은 국소 응용 용 파이펫의 100 내지 200 마이크로미터 내의 약물의 존재를 드러낸다. 광액활성 니코틴이 현지 응용 프로그램을 통해 뇌 조직에 효과적으로 전달될 수 있음을 확인합니다. 여기서, 뉴런 형태가 완성된 것처럼 보이는 고품질의 이미지가, 소음이 최소화되고, 파편이 세포 형태해석의 해석을 방해하지 않는, 도시된다.그러나 이러한 이미지는 품질이 낮습니다. 신호 대 배경 비율이 낮고 상당한 이물질로 인해. 입증 된 바와 같이 PA-Nic의 레이저 플래시 사진 분해와 뇌 조각에 내측 habenula 뉴런의 두 광자 레이저 스캐닝 현미경 검사를 페어링하면 세포 형태와 전기 생리적 반응의 조정을 허용합니다.10초 간격으로 수행된 단일 스팟 사진 용해는 기준선 보유 전류에 대한 충분한 복구 시간을 허용합니다. 1초 간격이 짧아지지만 프로토콜이 진행됨에 따라 보유 전류가 점진적으로 증가합니다. 니코틴은 짧은 간격으로 시스템에서 확산할 시간이 충분하지 않다는 것을 시사합니다.광액 활성 분자를 활용하는 실험을 설계할 때 형광 지표를 선택하고 호환되는 포원 방출 스펙트럼을 사용하여 형광을 보고하는 것이 중요합니다. PA-Nic은 짧은 파장 사진 용해 성수기로 인해 가장 일반적인 형광과 호환됩니다. 가장 적합한 PA-Nic 응용 기술을 선택할 때, 관심의 뉴런에서 니코틴 수용체의 기능적 발현, 생리적 활성을 신중하게 고려하는 것이 중요하다.이 기술의 숙련된 활용은 니코틴 응용 프로그램의 미세한 현절 제어를 허용, 이는 니코틴 수용체 활성화에 의해 네이티브 니코틴 수용체 참여의 운동을 연구하기위한 흥미로운 새로운 가능성을 가능하게, 세포 세포 소세포 화, 및 뉴런 활동의 변조.

probing-nicotinic-acetylcholine-receptor-function-mouse-brain-slices

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 더 나은 접근 장물과 스펙트럼을 사용하여 수용체의 형광 단백질 태그를 포함한 접근 방법의 조합을 사용하여 니코틴 중독의 메커니즘을 이해하기 위해 CNS의 뉴런의 특정 subtypes의 subcellular 지역 내에서 nicotinic 아세틸콜린 수용체 변화를 quantifying의 소설 기법을 개발했습니다 공촛점 이미징.

만성 니코틴 관리와 마우스 노크 인의 Fluorescently 태그를 Nicotinic 수용체의 분광 공촛점 이미징

이 비디오는 마우스의 복부 해마에서 니코틴 성 아세틸콜린 수용체의 니코틴 매개 활성화가 축삭을 따라 지속적인 칼슘 신호를 어떻게 초래하는지 보여줍니다.

시냅스 공동 배양에서 배쪽 해마 축삭을 따라 니코틴 유도 칼슘 신호 전달 이미징

이 논문에서, 우리는 심하게 절연 뇌 조각의 뉴런에 리간드 - 개폐 이온 채널 기능을 연구 할 수있는 유용한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 패치 클램프 기술을 사용하여 기록 뉴런에 약물의 로컬 응용 프로그램에 대한 약물 채워진 micropipette의 사용을 포함한다.

마우스 뇌 슬라이스의 Nicotinic 아 세티 콜린 수용체 기능을 공부하는 약물의 로컬 응용 프로그램

우리는 니코틴 아세틸콜린 수용체(nAChRs) 매개 시냅스 전달의 시냅스 전 메커니즘을 분석하기 위해 직접 라이브 이미징을 허용하는 복부 해마 – 측좌 회로의 유전자 키메라 제제를 in vitro에서 개발했습니다. 이 제제는 또한 시냅스 가소성의 시냅스 전후 메커니즘을 연구하기 위한 유익한 접근 방식을 제공합니다.

니코틴 유도 칼슘 신호 전달 및 복부 해마 축삭을 따라 신경 전달 물질 방출의 라이브 영상

여기서 우리는 발광 생물 기자를 사용하는 방법을 -imaging 소설 칼슘 2+ 제시한다. 이 방법은 칼슘 결합과 광 자극에 대한 필요성을 제거, 발광 구조물의 융합 GFP-쿼린을 이용한다. 중요한 것은이 방법은 깊은 뇌 구조와 높은 시간 해상도로 긴 연속 촬영, 접근을 허용한다.

발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

우리는 성인 마우스에서 급성 조각에 단일 코르티코스트 리아 탈 글루타마티터지시냅스에서 글루타메이트 방출과 클리어런스 사이의 균형을 평가하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 글루타메이트 검출을 위해 형광 센서 iGluu, 신호 수집을 위한 sCMOS 카메라 및 초점 레이저 조명장치를 사용합니다.

정상 및 헌팅턴 마우스의 급성 뇌 슬라이스에서 글루타메이트 방출 및 섭취량의 단일 시냅스 지표

이 프로토콜은 포유류 Neuro-2a 세포주를 이용한 뉴런 니코틴계 아세틸콜린 수용체 소단위의 발현 및 정량을 설명합니다. pH 민감성 형광 태그와 공초점 현미경은 수용체의 위치가 형질막과 pH 중립 세포 내 구획에서 발현된 수용체를 정밀하게 평가할 수 있게 하여 nAChR 수송과 약리학적 조절 연구를 용이하게 합니다.

포유류 세포에서 정량적 영상을 이용한 세포내 니코틴 아세틸콜린 수용체의 원형 및 세포내 원형질막 위치

갇힌 화합물의 광분해는 다양한 생리학 활성 화합물의 농도에 신속하고화된 증가의 생산 수 있습니다. 여기, 우리는 갇힌 캠프의 광분해와 함께 또는 dissociated 마우스 후각 감각 뉴런의 후각 전달 연구를위한 CA를 갇힌 패치 - 클램프 녹음을 얻는 방법을 보여줍니다.

강한 감각 뉴런의 속눈썹에 갇힌 화합물의 플래시 광분해

이 프로토콜에서는, 우리는 영상 칼슘의 최근 진행 상황을...

Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답

여기에서는 후각 수용체 뉴런(ORN)의 다양화와 관련된 분자 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있도록 초파리 더듬이의 전체 마운트 면역 염색 과정을 설명합니다.

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

배우세요 포토활성화 니코틴을 이용한 레이저 플래시 광분해 기술로 마우스 뇌 조각에서 니코틴성 아세틸콜린 수용체 기능을 정밀하게 연구하는 방법입니다. 이 기술은 콜린성 신경생물학 연구에 활용됩니다.

Photoactivatable 니코틴의 레이저 플래시 Photolysis를 통해 마우스 뇌 조각에서 Nicotinic 아 세 틸 콜린 수용 체 기능을 프로 빙

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