Name: 전기 생리학 전체 셀 패치 클램프를 사용 하 여 시 냅 스 다양성의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 학습하세요 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 사용하여 급성 뇌 조각에서 시냅스 다양성을 평가하는 방법입니다. 이 기법은 다양한 종과 뇌 영역에서 신경 전달 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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제는 온타리오 대학원 장학금을 받았다. W.I. 정신 건강 연구의 캐나다에서 새로운 탐정 친교를 받았다. 이 작품은 건강 연구 (PJT 148707) 자연과학 및 공학 연구 위원회의 캐나다 (06106-2015 RGPIN)와 캐나다 연구소에서 W.I 보조금 운영 지원.

모든 동물 실험 동물 관리 위원회의는 웨스턴 온타리오 대학 동물 관리 지침 (AUP #2014-031)에 캐나다 위원회에 의해 승인 됩니다.
1입니다. 솔루션
<ol><li>
조각화 솔루션
	<ol>
<li>조각화 솔루션의 구성 표 1 을 참조 하십시오.</li>
		<li>20 x 재고 솔루션을 사전에 준비 하 고 최대 1 개월 4 ° C에서 그것을 저장.</li>
		<li>1 x 조각화 솔루션, NaHCO3, 포도 당 및 자당 ddH2O, 해산 하 고 20 배 재고를 추가 합니다. 315-320 mOsm 사이 osmolarity 확인 하 고 더 이상 1 주 4 ° c.에 대 한 솔루션을 저장</li>
		<li>솔루션을 조각화의 100 mL와 함께 두 개의 비 커와 parafilm으로 그들을 커버. 솔루션 (-80 ° C 냉동 고에서 약 20 분) 냉동 부분적으로 된다 때까지 솔루션을 냉장고에 침착 해. 얼음에 95% O2/5% CO2 20 분에 대 한 솔루션을 조각화의 두 비 커를 거품 가스 분산 관을 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="5">해결책 농도 (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>슬 라이 싱</td>
			<td>보통 실제</td>
			<td>낮은 Ca2 + 실제</td>
			<td>Sr+ 실제</td>
			<td>피 펫/내부</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>87</td>
			<td>126</td>
			<td>126</td>
			<td>126</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.5</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>SrCl2
</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>2.5</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>7</td>
			<td>1.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1.5</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2포4
</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.25</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>25</td>
			<td>26</td>
			<td>26</td>
			<td>26</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>포도 당</td>
			<td>25</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>자당</td>
			<td>75</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>K-글 루 콘 산</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>116</td>
		</tr>
<tr>
<td>나 글 루 콘 산</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2 EGTA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2ATP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>나3GTP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 다양 한 솔루션의 구성입니다.
<ol start="2"><li>
(슬라이스 복구 및 유지 관리)에 대 한 실제
	<ol>
<li>실제의 구성 표 1 을 참조 하십시오.</li>
		<li>20 x 재고 솔루션을 사전에 준비 하 고 최대 1 개월 4 ° C에서 그것을 저장.</li>
		<li>1 x 실제 NaHCO3 및 ddH2O에서에서 포도 당을 분해 하 고 20 x 주식을 추가. 298-300 mOsm 사이 osmolarity가 확인 합니다. 솔루션을 사용 하 여 1 일 이내.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
실제 (낮은 Ca2 + 녹음)
	<ol>
<li>낮은 Ca2 + 실제의 구성 표 1 을 참조 하십시오.</li>
		<li>20 x 재고 솔루션을 사전에 준비 하 고 최대 1 개월 4 ° C에서 그것을 저장.</li>
		<li>낮은 Ca2 + 실제 x 1, NaHCO3 및 ddH2O에서 포도 당을 녹이 고 (CaCl2 와 MgCl2 무료) x 20을 추가 주식, CaCl2 , MgCl2 를 지정 농도. 298-300 사이 osmolarity가 확인 합니다. 솔루션을 사용 하 여 1 일 이내.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
실제 (Sr2 + 녹음)
	<ol>
<li>Sr2 + 실제의 구성 표 1 을 참조 하십시오.</li>
		<li>20 x 재고 솔루션을 사전에 준비 하 고 최대 1 개월 4 ° C에서 그것을 저장.</li>
		<li>Sr2 + 실제 x 1, NaHCO3 및 ddH2O 포도 당을 해산 하 고 추가 (CaCl2 및 MgCl2 무료) 20 주식, SrCl2 , MgCl2 를 지정 농도. 298-300 사이 osmolarity가 확인 합니다. 솔루션을 사용 하 여 1 일 이내.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
내부 솔루션
	<ol>
<li>K-글 루 콘 산 기반 내부 솔루션의 구성 표 1 을 참조 하십시오.</li>
		<li>하기 위해 내부 솔루션의 20 mL, 50 mL 튜브에 분자 생물학 학년 물 15 mL를 추가 합니다. 얼음에 다음 단계를 수행 합니다.</li>
		<li>분자 생물학에서 1 M 재고 농도에 미리 다음 솔루션 학년 물 준비. (ML)에 추가: 2.32 K-구 루 콘, 0.24 나 구 루 콘, 0.20 HEPES, 0.16 KCl, 0.05 k 2-EGTA, 50 mL 튜브에 0.04 MgCl2 .</li>
		<li>0.3 M 나3GTP의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>44.08 mg K2ATP 2 mL microcentrifuge 튜브에서의 무게 및 분자 생물학 학년 물의 1 mL을 추가 다음 50 mL 튜브에 추가 합니다.</li>
		<li>PH 7.2-7.4 1 m 코를 조정 합니다. 283-289 mOsm 사이 osmolarity가 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 슬라이스 준비
<ol><li>
도구 준비
	<ol>
<li>복구 챔버 (250 mL 비 커 4 웰 스와 그물에서에서 생성)을 실제의 200 mL를 추가 하 고 복구 챔버 물 목욕 (35 ° C)에 배치.</li>
		<li>파라핀 영화와 챔버 커버 하 고 지속적으로 95% O2/5% CO2 적어도 20 분 동안 유리 분산 튜브를 사용 하는 실제 거품.</li>
		<li>(메스, 각도 잘가 위, 집게, 벌금 페인트 브러시, 플라스틱 숟가락) 도구를 설정 하 여 해 부에 대 한 준비.</li>
		<li>단계 1.1.4에서에서 얼음 처럼 차가운 조각화 솔루션의 약 15 mL에 60 mL 주사기를 채우십시오.</li>
		<li>잘 접시의 뚜껑에 필터 종이 배치 하 여 절 개 플랫폼을 준비 합니다.</li>
		<li>얼음 트레이 여 얼음 트레이에 배치 조각화 챔버를 준비 합니다.</li>
		<li>보호 하는 블레이드 홀더에서 일회용 블레이드는 vibratome를 설정 합니다.</li>
		<li>전송 피 펫 파스퇴르 피 펫의 끝 고 깨진된 끝에 고무 전구를 배치 하 여 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
쥐의 뇌를 해 부
	<ol>
<li>척수 반사는 결 석까지 4 %isoflurane 포화 챔버에 동물 anesthetize</li>
		<li>단두대를 사용 하 여 동물을 목을 벨 하 고 신속 하 게 뇌를 제거 합니다.<ol>
<li>꼬리를 rostral에서 번호 22 메스 블레이드와 중간 절 개를 확인 합니다.</li>
			<li>옆 머리의 양쪽에 두 피를 껍질.</li>
			<li>Rostral (포함 하는 정면 뼈의 측면), 꼬리에서 한쪽에 두개골을 잘라 사용 좋은 위 사용 하 여 주의 하지 뇌 손상.</li>
			<li>두개골 조각 리프트를 사용 하 여 집게 두뇌와 빨리 단계의 2.1.4 주사기를 사용 하 여 차가운 조각화 솔루션의 15 mL와 함께 두뇌 냉각.</li>
			<li>두개골에서 뇌를 들어올립니다.</li>
			<li>장소 (1.1.4 단계)에서 얼음 처럼 차가운 조각화 솔루션으로 가득 비 커 중에서 뇌 95% O2/5% CO2버블링.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마우스 시상 하 부의 조각 준비
	<ol>
<li>원하는 뇌 영역에 대 한 뇌를 차단 하 고 각도 잘라 (예를 들어, 코로나 hypothalamic 슬라이스 조직 시 chiasm rostral와 블레이드를 사용 하 여 폰에 꼬리에서 손질과 꼬리 블록에 두뇌의 기지에 플랫 서피스 수직).</li>
		<li>앞쪽 측면에서 머리를 선택 하 고 인스턴트 접착제를 사용 하 여 지주 접시에 후부 측을 접착제를 사용 하 여 필터 종이의 잘라 조각.</li>
		<li>빨리 들고 접시 조각화 챔버로 놓고 솔루션 단계 1.1.4에서에서 두 번째 비 커에서 조각화와 챔버를 입력 합니다.</li>
		<li>vibratome에 조각화 상공과 얼음 트레이 보호 합니다.</li>
		<li>조각화 지역 (앞쪽에 및 사후 뇌)를 정의 하 고 250 µ m 두께 코로나 조각 자르는 시작. 권장 매개 변수: 0.10 m m/s, 진폭 속도 2 m m.</li>
		<li>원하는 뇌 영역에 대 한 적절 한 크기를 조각을 잘라.</li>
		<li>30-45 분 동안 35 ° C에서 분할 영역을 복구 합니다. 온난 한 목욕에서 복구 챔버를 제거 하 고 복구 추가 30 분에 대 한 실 온에서 하루 중 나머지에 대 한 실 온에서 계속 조각 조각 허용 그리고 거품 목욕 95% O2/5 %로 지속적으로 계속 CO2 .</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 전체 셀 패치 ClampRecording
<ol><li>
패치 펫을 당겨
	<ol>
<li>전체 셀 피 펫 끌어당기는 설명서에서 기록에 대 한 제안된 매개 변수를 사용 하 여, 3-5 m ω의 저항을 피 펫을 패치 펫 두꺼운 벽으로 둘러싸인된 유리에서 당겨.</li>
		<li>Microsyringe 상업 (수 제), 칠 피 펫 팁을 사용 하 여 필터링 된 내부 솔루션. microsyringe, 만들고, 1 mL 주사기의 팁을 구울가 만드는 팁을 수 있도록 긴 좋은 팁.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
전체 셀 구성 얻기
	<ol>
<li>전압 클램프 모드에서 현재 기록 피 펫을 슬라이스 및 오프셋 피펫으로 바로 위에 놓습니다. 피펫으로에 약간의 긍정적인 압력을 적용 하 고는 자 지를 잠금.</li>
		<li>그대로 막으로 건강 한 셀을 선택 하 고 셀을 피펫으로 접근. 조직 (즉, 입력할 때 조직에 느린 파도)에 약간의 소요를 일으킬 해야 긍정적인 압력.</li>
		<li>피펫으로 세포 표면에 작은 보조 개 형성 될 때까지 대각선 모션을 사용 하 여 셀을 가까이 피 펫을가지고 천천히 계속.</li>
		<li>긍정적인 압력 잠금을 해제 됩니다. 셀 물개를 형성 하기 위하여 시작 되 고 저항 1 GΩ 위에 증가 합니다. 전압 클램프에서-68 셀을 잡고 mV.</li>
		<li>약간 대각선 셀에서 초과 압력을 제거 하려면 셀에서 당겨.</li>
		<li>빠르고 느린 피 펫 용량에 대 한 보상.</li>
		<li>셀 통해 휴식과 얻을 전체 셀 구성 피 펫 소유자에 연결 하는 튜브를 통해 간단한 흡입을 적용 합니다.</li>
		<li>멤브레인에 셀 모드 전환 테스트는 전기 생리학 데이터 수집에서에서 창 및 분석 소프트웨어 (예: Clampex).</li>
		<li>녹음 각 전압 클램프, 전에 동일한 소프트웨어를 사용 하 여 막 테스트를 수행 하 고 실험실 책 (막 저항, 액세스 저항 및 커패시턴스)에 관련 매개 변수를 기록 합니다.</li>
		<li>27-30 ° C에서 녹음 목욕 및 후속 실험에 대 한 1.5-2.0 mL/min 유량의 온도 유지 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 다양성 실험
<ol><li>
실험 1: 다중성 4 AP를 사용 하 여 추정
	<ol>
<li>전압 클램프에서-68 셀을 잡고 mV. 동일한 소프트웨어를 사용 하 여 perfusing 낮은 Ca2 + 실제와 목욕 하는 동안에 sEPSCs를 기록 합니다. 시 냅 스 활동 막의 돌파구 후에 높은 될 수 있습니다 안정적인 초기 녹음을 보장 하기 위해 전체 셀 구성의 시작 후 5 분 이상에 대 한 레코드입니다.</li>
		<li>실제 4 AP는 micropipette를 사용 하 여 추가 하 고 목욕 적용 30 µ M 4-AP. 기록 sEPSCs 전체 약물 효과 얻으려면 적어도 10 분.</li>
		<li>4 AP와 실제를 0.5 µ M TTX 및 10 µ M Cd2 + 를 추가 하 고 10 분 이상에 대 한 mEPSCs을 기록.</li>
		<li>오프 라인 분석을 위해 기준선 (낮은 Ca2 + 실제)에서 4-ap 통신, 4 AP 응용 프로그램의 10 분 및 TTX 응용 프로그램의 10 분의 적용 직전의 마지막 1 분을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
실험 2: desynchronize 사용 하 여 Sr2 + 소포 자료
	<ol>
<li>Perfusing 일반 캘리포니아2 + (목욕 실제와 같은) 실제 레코드 sEPSCs 적어도 5 분 동안 함께 목욕 하는 동안.</li>
		<li>Sr2 + (1.4 단계)에서 실제와 레코드 sEPSCs perfusing 시작 하 고 정상적인 Ca2 + 실제에서 전환.</li>
		<li>오프 라인 분석을 위해 큰 진폭 sEPSCs vesicles의 동기 출시 때문 인지를 결정 하려면 기준선 (정상적인 실제) Sr2 + 실제 응용 프로그램의 10일 분의 마지막 1 분 비교 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
실험 3: multivesicular 릴리스를 사용 하 여 테스트 Γ- DGG
	<ol>
<li>낮은 Ca2 + 실제 레코드 sEPSCs 적어도 5 분 동안.</li>
		<li>관류 시스템을 통해 실제를 30 µ M 4-AP를 추가 합니다. 적어도 10 분에 대 한 sEPSCs를 기록입니다.</li>
		<li>200 µ M γ-DGG 4 AP와 실제를 추가 하 고 10 분 이상에 대 한 sEPSCs을 기록.</li>
		<li>단계를 수행 하는 별도 셀에 컨트롤 실험 1-3 하지만 적용 낮은 농도 (125 nM) γ-DGG 대신 DNQX의.</li>
		<li>오프 라인 분석을 위해 각 약물 응용 프로그램의 마지막 분 분석.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
실험 4: 구심 성 입력을 활동 전위 발생을 증가 자극.
	<ol>
<li>일반 캘리포니아2 + 실제에서 기록 sEPSCs.</li>
		<li>Afferents를 사용 하 여 실제의 속도로 20 Hz 2 s 및 반복에 대 한 10 시간 20 초 간 버스트 간격으로 가득 monopolar 유리 전극 자극.</li>
		<li>분석을 위해 하는 기준으로 사용 하는 첫 번째 자극 전에 5000 ms 한 최종 자극 후 10-300 ms를 비교 하 고 걸릴 평균 진폭과 주파수 변경 10 재판.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5입니다. 분석
<ol><li>SEPSCs 및 mEPSCs 프로그램을 감지 하 고 분석 하 여 시 냅 스 전류 (예를 들어, 미니 분석 소프트웨어)를 사용 하 여 분석 합니다.<ol>
<li>이 소프트웨어를 사용 하 여 감지 AMPA 수용 체 EPSCs (또는 GABA 수용 체 EPSCs 억제 전류를 기록 하는 경우)에 대 한 제안 된 검색 매개 변수를 사용 합니다.</li>
		<li>논 스톱 분석 함수 를 사용 하 여 녹음에 EPSCs를 감지.</li>
		<li>수동으로 검색 프로그램은 각 이벤트를 탐지 정확 하 게 되도록 각 기록 (예: 이벤트 되지 않습니다 확인 놓친 또는 두 번 계산).</li>
		<li>클립보드에 복사 하 여 이벤트 데이터를 내보내고 데이터 관리 소프트웨어 (예: Excel)에 붙여 넣습니다</li>
		<li>평균 주파수 또는 진폭 각 약물 치료에 대 한 계산 하 고 관련 통계 분석을 수행.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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저자 공개할 게 없다

성공적인 패치 클램프 전기 생리학 실험에 대 한 한 가지 중요 한 요구 건강 한 조각/셀을 얻는 이다. 우리의 설명된 프로토콜 hypothalamic 조각 PVN의 뉴런을 포함 하는 최적화 되어 있습니다. 다른 뇌 영역 해야 수정 솔루션 및 조각화 방법21,22,,2324. 기록, 그것은 막 저항 등 셀 속성을 지속적으로 모니터링 하 여 안정적인 녹음을 허용 하도록 중요 한 커패시턴스 및 액세스 저항. 액세스 저항 증가 EPSC 진폭을 감소 하 고 따라서 진폭 측정을 혼동 수 있습니다. 따라서, 20 m ω를 초과 하거나 녹음 하는 동안 20% 이상 증가 액세스 저항 값으로 셀이 삭제 됩니다. 유사 하 게, 감소에 (또는 낮은) 막 저항 가난한 공간-클램프 될 수 있습니다 하 고, 따라서, 진폭을 줄일...

시 냅 스 전송 뉴런 간의 통신에 대 한 근본적인 메커니즘 이며 따라서, 두뇌 기능. 시 냅 스 전송 또한 불안정 하 고 방식 활동-종속 뿐만 modulatory 신호1응답에서 그 효능을 변경할 수 있습니다. 따라서, 시 냅 스 기능 검사 신경 과학 연구의 주요 초점 되었습니다. 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학 있도록 고안 실험적인 디자인 및 데이터 분석, 시 냅 시스 전송의 깊이 있는 생물 및 분자 메커니즘을 이해 하는 다양 한 기술입니다. 일반적으로 사용 되, 아마도 때문에 기술과 개념의 단순 방식은 미니어처 흥분 성의/금지 postsynaptic 전류 측정 (나 / Ipsc) 전압 아래 클램프 구성2,3, 4 , 5 , 6. 개별 mPSCs 연 접 터미널 7에서에서 발표 했다 그들의 각각 신경 전달 물질의 바인딩에 응 postsynaptic ionotropic 수용 체 (예: AMPA 및 GABAA 수용 체)를 통해 이온의 흐름을 나타내는 . 전압 개폐 나+ 채널 차단제 테트로도톡신 (TTX) 존재 녹음을 얻을 있기 때문에 릴리스 활동 전위 독립적 이며 일반적으로 신경 전달 물질을 포함 하는 단일 시 냅 스 소포를 포함 한다. 이 가정에 기초를 두어, mPSCs의 평균 진폭 널리 이용 된다 원유 견적으로 수와 단일 릴리스 사이트를 반대 하는 postsynaptic 수용 체의 기능을 나타내는 quantal 크기에 대 한. 다른 한편으로, mPSCs의 주파수 대표 postsynaptic 세포 그리고 그들의 평균 출시 확률에 종료 시 냅 스의 총 수의 조합으로 간주 됩니다. 그러나, 이러한 매개 변수는 시 냅 스, 또는 시 냅 스 다양성의 또 다른 변수 multiplicativity 측정 하지 않습니다-시 냅 시스 전송의 효능에 대 한 중요 하다.
시 냅 스 전송7,,89의 quantal 이론에 따라, 신경 세포의 쌍 사이 지정된 된 연결의 힘은 세 가지 요소에 따라 달라 집니다: 기능 시 냅 스 (N)의 수는 단일 시 냅 스 소포 (quantal 크기;의 출시에 postsynaptic 응답 Q)와 신경 전달 물질 방출 (Pr)의 확률. 시 냅 스 다양성은 n과 같습니다. 시 냅 스 다양성의 개발 또는 곱셈 시 냅 스의 가지 치기는 플라스틱 개발에 걸쳐 및 다른 질병 국가3,4,,610에. 이러한 이유로, 건강 및 질병에 시 냅 시스 전송의 효능을 이해 하기 위한 중요 한 의미는 다양성을 시 냅 스 특성화. 기법, 전자 현미경 등 여러 시 냅 스 연락처는 동일한 postsynaptic 신경11,12, 이전에 동일한 축 삭에서 발생을 감지 하 여 다양성을 시 냅 스의 구조적 증거를 확인할 수 있습니다. 13,14. 그러나, 이러한 구조적으로 확인 된 multisynapses 기능 자동15,16수 있습니다. N 의 정확한 기능 시험 주어진된 연결에 여러 기능 릴리스 사이트를 식별할 수 있는 짝된 전체 셀 녹음 등 electrophysiological 방법을 기술적으로 도전적인 필요 최소한의 단일 putative 축 삭을 모집을 목표로 하는 자극 접근.
이 프로토콜에서 우리 Hsia 외2에 의해 원래 개발 방법을 채택 하 여 시 냅 스 다양성을 추정을 위한 간단한 방법을 설명 합니다. 이 기술은 자연 Psc (sPSCs) 및 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학, 특정된 뉴런에 대 한 모든 입력에 걸쳐 시냅틱 복합성의 정도 예측할 수 있는 사용 하 여 mPSCs의 측정을 포함 한다.  로 이전에 정의 된, 시 냅 스 다양성 주어진된 사전 및 postsynaptic 신경 세포 사이의 시 냅 스의 수를 반영 합니다. 여러 개의 시 냅 스는 활동 전위에 의해 synchrony에서 모집 하 고, 큰 진폭 PSC를 생성 하는 개별 (즉, quantal) Psc의 일시적인 합계의 확률이 매우 높은 있을 것입니다.  MPSC 기록에서 (에 있는 활동 전위는에 의해 차단 TTX), 개인 (비 동기) mPSCs의 일시적인 합계의 확률은 낮습니다. 이 논리를 사용 하 여, 시 냅 스 다양성 sPSC 진폭 (활동 전위 종속 자료)와 mPSC 진폭을 비교 하 여 추정 수 있습니다.
다중성의 존재를 검사 4 개의 실험 및 예를 들어 glutamatergic EPSCs를 사용 하 여 그들의 분석을 설명 합니다. 그러나, 동일한 접근 방식을 사용할 수 있습니다 빠른 GABAergic/glycinergic 전송 (Ipsc). 각 실험에 대 한 간략 한 근거 아래 설명 되어 있습니다. 첫째, 위에서 설명한 mEPSCs에 sEPSCs의 진폭을 비교 하 여 시 냅 스 다를 추정 수 있습니다. 이 접근;에 대 한 두 가지 요구 사항이 있습니다. 1) 연 접 축 삭 한다 활동 전위의 충분 한 수 기록, 중 고 2) Pr 수 있어야 합니다 높은 여러 시 냅 스 신경 활동 전위의 도착 시 해제. 이러한 요구 사항을 충족, sEPSCs는 낮은 Ca2 + 인공 뇌 척수 (실제)에 처음 기록 된 고 K+ 채널 길 항 제, 행동 증가 4-Aminopyridine (4-AP)의 낮은 농도의 기록 잠재적인 발사 하 고 Pr. 다음 발사 하는 활동 전위는 TTX 및 홍보 전압-문이 캘리포니아2 + 채널 차단 Cd2 +감소에 의해 차단 됩니다. MEPSC의 sEPSCs (4AP)와 비교 (4AP, TTX와 Cd2 +). 두 번째 실험에서 캘리포니아2 + 아데닌 Sr2 + 기 출시 desynchronize를 실제에 의해 대체 됩니다. 캘리포니아2 + vesicles의 동기 릴리스에 대 한 필요는, Sr2 + 교체 다양성을 나타내는 큰 진폭 sEPSCs를 제거 한다. 셋째, mechanistically, 다양성에 발생할 수 있습니다 여러 개의 시 냅 스 연락처 중에서 동일한 postsynaptic 신경 또는 multivesicular 릴리스 (즉, 단일 시 냅 스 접촉 내 발표는 여러 vesicles)17,18. 다양성의 두 종류를 구분 하는 세 번째 실험 사용 하 여 낮은 선호도, 빠른 출신과 경쟁 길 항 근 AMPA 수용 체, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,의18 큰 있는지 여부를 확인 하 sEPSC 독립 시 냅 스의 multivesicular 릴리스 postsynaptic 수용 체의 겹치는 인구에 일시적인 합계의 결과입니다. 큰 진폭 이벤트 multivesicular 방출에서 발생 하는 경우 γ-DGG 효과가 있을 것입니다 덜 큰 작은에 비해 sEPSCs 억제에 큰 sEPSCs 여러 개의 시 냅 스 연락처의 일시적인 합계에서 발생 하는 것입니다 마찬가지로 영향을 받을 반면 Γ-DGG입니다. 4 실험에서 더 생리 메서드는 활동 전위 발사, 즉 입성 시 냅 시스 자극을 향상 시키기 위해 사용 됩니다. 시 냅 스 활동의 파열 수 뚜렷이 증가/촉진 자극된 afferents의 자발적인 활동 전위 발생 및 릴리스 확률. 따라서,이 이렇게 다양성이 더 생리 적인 방법으로 매니 페스트 수 있습니다.
다음 프로토콜 마우스 hypothalamic 조직에 이러한 실험을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 특히, corticotropin 공개 호르몬 (CRH) 신경 시상 하 부 (PVN)의 paraventricular 핵의 사용 됩니다. 우리는 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 실시 하기 위한 절차를 설명 하 고 시냅틱 다양성에 대 한 테스트를 특정 실험을 설명.

<table><tbody><tr><td>1 mL 주사기</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 블레이드</td><td>Fisher Scientific/기타</td><td>35698</td><td></td></tr><tr><td>22 블레이드</td><td>VWR/기타</td><td>21909-626</td><td></td></tr><tr><td>22 &mu; M 주사기 필터</td><td>Milipore</td><td>09-719-000</td><td></td></tr><tr><td>Adson foreceps</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8547</td><td></td></tr><tr><td>각진 날카로운 가위</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8437</td><td></td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10</td><td></td></tr><tr><td>양날 블레이드</td><td>VWR</td><td>74-0002</td><td></td></tr><tr><td>여과지</td><td>Sigma/기타</td><td>1001090</td><td></td></tr><tr><td>파인 붓</td><td>Fisher/various</td><td>15-183-35/various</td><td></td></tr><tr><td>Gas Dispersion Tube VWR</td><td></td><td>LG-8680-120</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Fresenius Kabi/others</td><td>M60303</td><td></td></tr><tr><td>Krazy glue</td><td>various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini analysis</td><td>Synaptosoft</td><td>MiniAnalysis 6</td><td></td></tr><tr><td>Osmomoter</td><td>Wescor Inc</td><td>모델 5600</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>pH 미터</td><td>Mettler Toledo</td><td>FE20-ATC</td><td></td></tr><tr><td>고무 전구</td><td>VWR</td><td>82024-550</td><td></td></tr><tr><td>메스 핸들 No. 3</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8350</td><td></td></tr><tr><td>메스 핸들 No. 4</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8356</td><td></td></tr><tr><td>단일 가장자리 블레이드</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome 슬라이서</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>정수 시스템</td><td>Millipore</td><td>Milli-Q Academic A10</td><td></td></tr><tr><td>웰 플레이트 뚜껑</td><td>Fisher / various</td><td>07-201-590 / 다양</td><td></td></tr> 한<tr><td>< 강한>화학 물질 / 시약< / 강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-AP</td><td>시그마</td><td>275875</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>분자 프로브</td><td>B1204</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2*2H2O</td><td>시그마</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>CdCl2</td><td>sigma</td><td>202908</td><td></td></tr><tr><td>DNQX</td><td>Tocris</td><td>189</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>시그마</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시그마</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>K2-ATP</td><td>시그마</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>K-글루코네이</td><td>트 시그마</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2*6H2O</td><td>시그마</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>분자 생물학 등급 물</td><td>시그마</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>시그마</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NaCl Bioshop</td><td>SOD001.1</td><td></td></tr><tr><td>Na-글루코네이</td>트 <td>시그마</td><td>S2054</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>71504</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>피크로 톡신</td><td>시그마</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>SrCl</td><td>시그마</td><td>255521</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>Bioshop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>알라몬 연구소</td><td>T-550</td><td></td></tr><tr><td>yDGG</td><td>토크리스</td><td>6729-55-1</td><td></td></tr></tbody></table>

전기 생리학 전체 셀 패치 클램프를 사용 하 여 시 냅 스 다양성의 평가

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

중앙 신경 조직에서 뉴런의 쌍 종종 여러 개의 시 냅 스 연락처 및/또는 기능 신경 전달 물질 방출 사이트 (synaptic 다양성)를 형성 한다. 시 냅 스 다 플라스틱 이며 개발에 걸쳐 변화와 다른 생리 적인 조건에서 시 냅 시스 전송의 효능에 대 한 중요 한 결정 되 고. 여기, 우리는 실험 종료 급성 뇌 조각에 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 사용 하 여 주어진된 postsynaptic 신경에 시 냅 스의 복합성의 정도 추정에 대 한 개요. 특히, 전압 클램프 녹음 자발적인 흥분 성의 postsynaptic 전류 (sEPSCs)의 진폭 및 미니어처 흥분 성의 postsynaptic 전류 (mEPSCs)의 차이 비교 하는 데 사용 됩니다. 이 방법의 뒤에 이론은 이다 다양성을 전시 하는 구심 성 입력 큰, 활동 전위 종속 sEPSCs 각 시 냅 스 접촉에서 발생 하는 동기식 릴리스 때문에 표시 됩니다. 반면에, 활동 전위 독립적인 릴리스 (비동기) 인 작은 진폭 mEPSCs를 생성 합니다. 이 문서는 실험 및 분석 시 냅 스 다양성의 존재의 특성의 집합을 설명 하 고 요구 사항 및 기술의 한계에 설명 합니다. 이 기술은 vivo 영향 서로 다른 뇌 영역에 시 냅 스 연락처의 조직에에서 어떻게 다른 행동, 약리학 또는 환경적 개입 조사에 적용할 수 있습니다.

위의 프로토콜 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 사용 하 여 예를 들어 마우스 hypothalamic 뉴런을 사용 하 여 시 냅 스 복합성의 정도 검사 하는 방법을 설명 합니다. 이 슬라이스 준비 기술은 건강 한 가능한 세포가 없는 부 어 막 또는 핵 (그림 1) 항복 한다. 프로토콜의 각 단계 조직 및 녹음의 품질의 건강을 위해 중요 하다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59461/59461fig1.jpg"> 그림 1: 건강 하 고 건강에 해로운 조직 다음 슬라이스 준비. 40 x 확대 차동 간섭 콘트라스트 광학 아래 PVN의 전기 생리학 준비를 슬라이스. 빨간 화살촉 건강 한 세포를 나타내고 검은 화살촉 건강에 해로운 ...

여기, 선물이 급성 뇌 조각에 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 사용 하 여 기능 시 냅 스 다양성을 평가 하기 위한 프로토콜.

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

두뇌에서, 신경 쌍의 쌍은 수시로 시냅스 복합성에게 불린 다중 시냅스 접촉을 형성합니다. 그러나 시냅스 복합성에 대한 정확한 검사는 기술적으로 도전적인 실험이 필요합니다. 이 프로토콜은 전세포 패치 클램프 전기 생리학을 사용하여 시냅스 복합성의 총 추정을 위한 간단한 방법을 설명합니다.이 방법은 시냅스 복합성을 조사하기 위해 모든 종과 뇌 영역에 적용 될 수있다. 이 방법은 전세포 패치 클램프 전기 생리학에서 기본적인 기술이 필요합니다. 낮은 안정적인 액세스 저항으로 고품질 레코딩을 얻는 것은 데이터의 정확한 해석에 매우 중요합니다.전체 셀 구성을 얻으려면 기록 파이펫을 슬라이스 바로 위에 놓고 전압 클램프 모드에서 파이펫 전류를 오프셋합니다. 파이펫에 약간의 양압을 바르고 스톱콕을 잠급니다. 다음으로, 그대로 막으로 건강한 세포를 선택하고 파이펫으로 조직에 접근하십시오.양압은 조직에 약간의 장애를 야기한다. 작은 보조제가 세포 표면에 형성될 때까지 피펫을 대각선 동작으로 셀에 더 가깝게 가져옵니다. 그런 다음 양압 잠금을 해제합니다.셀은 씰을 형성하기 시작하고 저항은 하나의 기가옴 이상으로 증가합니다. 전압 클램프에서 셀을 마이너스 68 밀리볼트로 고정합니다. 이어서, 피펫을 세포에서 대각선으로 당겨 과도한 압력을 제거합니다.빠르고 느린 파이펫 커패시턴스를 보상합니다. 파이펫 홀더에 연결된 튜브를 통해 간단한 흡입을 적용하여 세포를 돌파하고 전세포 구성을 얻습니다. 그런 다음, 전기생리학 데이터 수집 및 분석 소프트웨어에서 멤브레인 테스트 창에 셀 모드로 전환한다.기록 용 목욕의 온도를 섭씨 27~30도에서 유지하며, 후속 실험을 위해 분당 1.5~2밀리리터의 유속량을 유지한다. 복합성 시냅스에서, 행동 잠재력신경 전달 물질 방출을 동기화 하 고 더 큰 포스트 naptic 전류를 생성. TTX와 카드뮴으로 작용 잠재력 및 칼슘 의존성 혈관 방출을 차단하면 포스트냅틱 전류가 합산되지 않도록 하고 진폭을 감소시다.다각성이 없는 경우 차단 작업 잠재력은 진폭을 변경하지 않습니다. 실험 1에서, 복합성을 추정하기 위하여는, 저칼슘 aCSF로 그것을 견딜 동안 영하 68 밀리볼트에서 세포를 보유합니다. 안정적인 기준선을 보장하기 위해 자발적인 EPSC를 최소 5분 동안 기록합니다.다음으로, aCSF에 30개의 마이크로몰라 4-AP를 추가하여 작용 잠재력 에 의존하는 이벤트를 늘리고, 완전한 약물 효과를 얻기 위해 최소 10분 동안 자발적인 EPSC를 기록한다. 이어서, 4-AP로 aCSF에 0.5 마이크로몰라 TTX 및 10개의 마이크로몰라 카드뮴을 추가하고, 미니어처 EPSC를 최소 10분 동안 기록한다. 오프라인 분석을 위해 4-AP 적용 직전의 마지막 1분, 4-AP 애플리케이션의 10분, TTX 애플리케이션의 10분을 사용하십시오.이 실험에서 세포외 칼슘은 시냅스 소포의 방출을 비동기화하기 위해 스트론튬으로 대체됩니다. 따라서 다각성이 있는 경우, 이것은 포스트냅스 전류의 진폭을 감소시켜야 한다. 실험 2에서는, 일반적인 칼슘 aCSF를 가진 세포를 perfusing하는 동안 적어도 5 분 동안 자발적인 EPSCs를 기록합니다.소포 방출의 비동기화를 위해 스트론튬 aCSF로 셀을 인코딩하기 시작하고 자발적인 EPSC를 기록하십시오. 오프라인 분석을 위해, 큰 진폭 자발적 EPSC가 소포의 동기 방출때문인지 여부를 확인하려면 기준기의 마지막 순간을 스트론튬 aCSF 응용 프로그램의 10분에 비교한다. 다발성은 시냅스 갈라진 에서 더 높은 신경 전달 물질 농도를 일으키는 다발성 방출을 관련시킬 수 있습니다.감마-DGG의 추가, 낮은 친화 AMPA 수용체 길항제, 작은 uniquantal 포스트 naptic 전류에 비해 더 큰 다콴탈의 덜 효과적인 억제로 이끌어 냅니다. 다각적 방출없이, 감마-DGG는 더 크고 작은 포스트 냅스 전류에 동등하게 효과적일 것입니다. 실험 3에서는 다각성 방출을 테스트하기 위해 저칼슘 aCSF에서 최소 5분 동안 자발적인 EPSC를 기록합니다.관류 시스템을 통해 aCSF에 30 개의 미세 몰라 4-AP를 추가하십시오. 자발적인 EPSC를 최소 10분 동안 기록합니다. 그런 다음 4-AP로 200 개의 마이크로 몰라 감마-DGG를 aCSF에 추가하고 자발적인 EPSC를 최소 10 분 동안 기록합니다.별도의 셀에서 대조군 실험으로서 절차를 반복하지만 감마-DGG 대신 DNQX의 낮은 농도를 적용한다. 오프라인 분석을 위해 각 약물 응용 프로그램의 마지막 순간을 분석합니다. 시냅스 활동의 버스트는 자극된 포렌트의 자발적인 작용 잠재적 발사 및 방출 확률을 일시적으로 증가시킬 수 있다.뉴런이 복합성을 나타내는 경우, 행동 잠재력의 증가는 포스트 냅스 전류의 진폭의 일시적인 증가를 야기한다. 실험 4에서는 정상적인 칼슘 aCSF에서 자발적인 EPSC를 기록합니다. 작용 잠재력 발사를 증가시키기 위해 aCSF로 채워진 단극성 유리 전극을 2초 동안 20 헤르츠의 속도로 자극하고, 20초 의 인터버스트 간격으로 10회 반복합니다.분석을 위해 첫 번째 자극 전에 5, 000밀리초 자발적 EPSC를 베이스라인으로 사용하고 최종 자극 후 10~300밀리초 의 자발적 EPSC와 비교합니다. 그런 다음 평균 진폭및 주파수 변화를 10번 이상 수행합니다. 시냅스 전류를 감지하고 분석하는 프로그램을 사용하여 자발적인 EPSC 및 소형 EPSC를 분석합니다.AMPA 수용체 매개 EPSC를 검출하기 위해 제안된 검출 파라미터 및 논스톱 분석 기능을 사용합니다. 프로그램이 각 이벤트를 정확하게 감지하고 있는지 확인하기 위해 각 레코딩을 수동으로 검사합니다. 이벤트 데이터를 클립보드에 복사하여 내보내고 데이터 관리 소프트웨어에 붙여넣습니다.다음으로, 각 약물 치료에 대한 평균 주파수 및 진폭을 계산하고 관련 통계 분석을 수행한다. 여기에 표시된 예에서 4-AP는 자발적인 EPSC의 진폭과 빈도를 모두 증가시킵니다. TTX와 카드뮴의 후속 적용은 진폭과 주파수를 모두 감소시다.다음은 레코딩에서 자발적인 EPSC 진폭의 분포입니다. 여기서 조사된 시상 하부 뉴런에서 기준선 및 TTX 조건의 진폭및 주파수는 동일하며, 이는 기준선 자발적 EPSC에 잠재적 인 EPSC가 거의 포함되어 있지 않습니다. 따라서 후속 실험은 기준선과 4-AP 간의 차이를 비교하여 복합성을 측정할 수 있다.시냅스 전송의 강도는 시냅스 활동의 버스트에 의해 일시적으로 증가 될 수있다. 더 많은 생리적 조건 하에서 복합성을 조사하기 위해, 포퍼런트 자극은 행동 잠재적 인 발사 및 방출 확률을 증가시키기 위해 사용될 수있다. 다음은 시냅스 자극 다음의 자발적EPSC 주파수 및 진폭 변경 사항에 대한 요약입니다.안정적인 기록은 데이터의 정확한 해석을 위해 필수적입니다. 이 분석을 혼동 할 수 있기 때문에, 기록 중에 액세스 저항이 20 % 이상 변경하는 경우 데이터를 설명합니다. 이 프로토콜은 시냅스 복합성을 추정하는 간단한 방법을 제공합니다, 이는 다른 생리학적 및 병리학 적 조건에서 시냅스 효능과 가소성의 주요 결정요인입니다.

evaluation-synaptic-multiplicity-using-whole-cell-patch-clamp

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 Mauthner 뉴런 및 기타 망상 척수 세포의 전기적 특성을 연구하는 방법인 전체 세포 패치 클램프 전기생리학이라는 기술을 설명합니다.

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다중 전극 패치 클램프 녹음은 복잡한 작업을 구성한다. 여기에서 우리는 실험 단계의 많은 자동화함으로써, 성능과 녹음 수의 질적 향상으로 이어지는 프로세스를 가속화 할 수 방법을 보여줍니다.

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대뇌 피질의 네트워크는 억제의 interneurons의 작지만 다양한 설정에 의해 제어된다. 의 interneurons의 기능 조사 그러므로 표적으로 기록하고 엄격한 확인이 필요합니다. 세포 내 라벨, 사후 형태 학적 및 면역 조직 화학적 분석 신경 세포의 단일 또는 시냅스 결합 쌍에서 전체 셀 녹음을 포함하는 통합 접근 방식은 여기에 설명한다.

Morphologically- 및 Neurochemically 확인 된 해마의 interneurons에서 전체 세포 패치 클램프 녹음

쌍 기록은 시냅스로 연결된 두 개의 뉴런에서 동시에 전체 세포 패치 클램프 기록으로, 개별 뉴런 사이의 시냅스에 대한 정확한 전기생리학적 및 약리학적 특성화를 가능하게 합니다. 여기에서는 전기생리학을 위한 모든 실험실에서 유기형 해마 절편 배양에서 이 기술을 확립하기 위한 자세한 방법론과 요구 사항에 대해 설명합니다.

해마의 Organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음

급성 뇌 절편에서 시냅스로 결합된 뉴런의 패치 클램프 기록 및 동시 세포 내 바이오사이틴 충전을 통해 구조적 및 기능적 특성의 상관 분석을 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목적은 뉴런 미세 회로에서 전기생리학적 기록의 필수 기술 단계와 후속 형태학적 분석을 설명하는 것입니다.

급성 뇌 조각에서 신경 세포의 미세 회로의 전기 생리 및 형태 학적 특성은 페어 패치 클램프 녹음을 사용하여

이 프로토콜은 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하기위한 기본 절차 단계를 설명합니다. 이 기술은 신경 세포의 전기적 동작의 연구를 허용하고, 뇌 조각에서 수행하는 경우, 여전히 상대적으로 잘 보존 된 뇌 회로에 통합되어 신경 세포에서 다양한 신경 기능의 평가를 할 수 있습니다.

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

조각 패치 클램프 기술 기본 속성 및 흥분 성의 또는 억제 시 냅 스의가 소성 학습 유도 된 변화를 분석 하기 위한 효과적인 방법입니다.

조각 패치 클램프 기술 학습 유도 소성을 분석 하기 위한

학습하세요 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 사용하여 급성 뇌 조각에서 시냅스 다양성을 평가하는 방법입니다. 이 기법은 다양한 종과 뇌 영역에서 신경 전달 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

전기 생리학 전체 셀 패치 클램프를 사용 하 여 시 냅 스 다양성의 평가

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