Name: 출혈 성 뇌졸중의 병리학 적 결과를 연구 하기 위해 제 브라 피시 애벌레 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: 학습하세요 출혈성 뇌졸중 후 뇌 손상, 운동 장애 및 신경염증을 정량화하는 방법을 Danio rerio 애벌레를 사용하여. 형광 현미경을 활용한 실시간 관찰로 세포 반응을 분석하고 잠재적 치료제 선별에 활용할 수 있습니다.

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우리는 박사 데이비드 스 패 러와 장비 사용을 위한 맨체스터 대학교 시스템 현미경 검사의 핵심 시설에 감사 하 고 싶습니다, 교수 리처드 바인 DanioVision 및 닥터 잭 리버스-Auty의 사용에 대 한 통계 상담. Bbh 라인은 친절 하 게 캘거리 대학의 사라 아이의 실험실에서 니콜 Munsie에 의해 공유 되었다. 우리는 또한 스티븐 렌 쇼 박사, 아담 후르 스톤 박사의 닥터 앤드류 배드 록 박사와 헬렌 영 박사에 게 물고기 라인과 장비에 대 한 감사를 드립니다.
본 연구는 NC3Rs에 의해 지지 되었다 (NC/N002598), 뇌졸중 협회 (TSA LECT 2017/02) 및 영국 심장 재단 (MR/M501803)과 영국의 하트 파운데이션. 우리는 또한 그들의 지속적인 재정 지원을 위한 나탈리 케이트 모스 신탁 및 맨체스터 대학교 생물학 학부, 의학 및 건강에 특히 감사 하 고 있습니다.

제 브라 피쉬는 앞서 설명한21과 같이 표준 조건 하에서 맨체스터 대학교 생물학 서비스 장치에서 모금 및 유지 되었다. 성인 제 브라 어 축산은 맨체스터 대학교 동물 복지 및 윤리 검토 위원회의 승인을 받았습니다. 모든 실험은 영국 본사 규정 (PPL: P132EB6D7)에 따라 수행 하였다.
참고: 본 연구에서 사용 된 형질 전환 라인은 대 식 세포 특이 적 계보 mpeg1를 포함 한다 :mcherry (앞서 설명 된 바와 같이 건축 된22), 호 중구 특이 적 mpo:GFP23,적혈구 별 gata1: dsred24 및 유비 크:야생 형, 감아 (mitfaw2/w2 ) 및 돌연변이 (bbhm292) 배경에서 세포 사 멸을 위한 리포터 (하우스25에서 다시 유래). 그림 1 은 실험 일정을 보여 줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> 그림 1 : 뇌 손상, 운동 및 신경 염증 결과를 특성화 하는 실험적인 타임 라인의 그래픽. 무형 유산, 뇌 내 출혈; bbh, 버블 헤드. 그림은 크리에이티브 커먼즈 라이센스 하에서 허가와 함께 Crilly 외20 에서 재현 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
1. 일 0: 계란의 생산과 수집
<ol><li>1 남성과 1-2 여성 성인 제 브라 피시에서 생산 된 사육 상자에서 자연 산란에서 수정 된 배아를 수집 합니다. 참고: 아 토르 바 스타 틴 프로토콜의 경우 모든 와일드 타입/형질 전환 동물을 사용할 수 있지만 출혈 비율은 균 주 사이에 약간 다릅니다.</li>
	<li>표준 E3 배아에 28 ° c에서 100 배아를 배양 하 고 표준 지침26에 따라 페 트리 디쉬 및 스테이지 당 배지.</li>
	<li>~ 6 시간 후에 포스트 시비 (hpf)는 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 접시에서 죽은 것과 수정 되지 않은 배아를 제거 합니다.</li>
</ol>2. 일 1:24 hpf 아 토르 바 스타 틴 처리
<ol><li>날카로운 초박형 해 부 집게 (27)를 이용한 아 토르 바 스타 틴 처리를 위한 Dechorionate 배아. 실험에 필요한 숫자는 그에 따라 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>2 개의 깨끗 한 배양 접시에 30 mL의 E3 배아 배지를 추가 합니다. 100 배아에 한 접시를 사용 하십시오. 참고: 플레이트가 세포 배양을 위해 설계 된 경우,이 초기 단계에서 dechor이온화 된 zebrafish는 종종 바닥에 달라 붙어 있습니다. 이를 방지 하려면 사용 하기 전에 깨끗 한 물에 접시를 철저히 헹 궈 주십시오.</li>
	<li>치료 판에서 60 µ L의 배아 수를 제거 하 고 0.5 mM 아 토르 바 스타 틴 (ATV) 60 µ L을 추가 하십시오. 0.5 mM의 스톡 농도에서, 상기 희석은 1 µ의 최종 농도가 되 고이는 유 충 비 hemorrhaged 및 ~ 80%의 유 충 hemorrhaged (ICH +)의 20%를 초래할 것 이다. 처리 되지 않은 컨트롤에 다른 플레이트 사용 참고: 아 토르 바 스타 틴은 증류수에 가용 화 (3mg을 10ml로) 0.5 mM의 원 액을 만든다. 가용 화는 다소 시간이 소요 되므로, 어두운 곳에서 실 온에서 밤새 배양 하 여 교 반을 한다. 완전 한 가용 화는 최대 1 주일까지 걸릴 수 있습니다. DMSO를 사용 하지 마십시오. 용액은-20°c에서 살 리 되 고 저장 된다. 동결 해제 하지 마십시오.</li>
	<li>파스퇴르 피 펫을 사용 하 여, 치료 판에 가능한 한 적은 물로 100 배아를 이송 한다.</li>
	<li>28 ° c에서 플레이트를 배양 합니다. 참고: ICH는 33과 48 hpf 사이에서 발생 합니다. 아 토르 바 스타 틴은 24 시간 이상 인큐베이션 함에 따라 제거 될 필요가 없으므로 추가적인 개발 문제가 발생 하지 않는다.</li>
</ol>3. 둘째 날: 무형 유산과 무형 문화 유산과 인구를 분리 하는 50 hpf
<ol><li>Ich + 물고기를 무형 문화 유산으로 구분 하 고 새로운 요리로 쉽게 옮겨 보세요.<ol>
<li>ATV 모델을 1 µ M의 농도로 사용 하는 경우, 애벌레의 75-100%가이 시점에서 출혈 (ICH +)을 나타낼 것 이다. 참고: 애벌레가 원하는 주파수에서 출혈 않으면, 아 토르 바 스타 틴 또는 더 높은 농도의 신선한 배치를 사용 하는 경우 유 충의 반응은 균 주 사이에서 다릅니다. 애벌레가 48 hpf에의 한 출혈을 나타내지 않았다면 그 (것) 들을 ICH를 고려 하십시오.</li>
		<li>Bbh 모델을 사용 하는 경우, 모든 동형 접합 체 돌연변이는 48 hpf에의 한 출혈을 나타낼 것 이다. 이종 접합 체를 사용 하는 경우, ICH-헤 테로 접합 및 야생 형 형제는 실험을 위한 대조 군 동물로 서 사용 될 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>필요한 경우, 마 취는 E3 미디어에 0.02% MS222를 추가 하 여 애벌레를 유 충 합니다. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 머리에 혈액이 존재 하는 애벌레를 신선한 E3 매체로 분류 하십시오. 그림 2를 참조 하십시오. 주의: 머리 속의 혈액은 전방, 중 또는 후 뇌 또는 조합으로 나타날 수 있으며 출혈 량은 동물 마다 다를 수 있습니다. Bbh 돌연변이 체에서는, ICH는 수시로 큰 머리에 의해 인식 되는 가혹한 부 종, 눈 사이 더 넓은 공간 및 더 많은 확산 출혈과 연관 됩니다. 그러나 모든 무형 유산 + bbh 유 충은 부 종을 나타낸다.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig2.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> 그림 2 : 무형 유산 + 뇌 출혈 표현 형. 형질 전환 gata1에 유지 되는 애벌레 무형의 표현 형의 예: dsred 리포터 감아 배경 (상단 패널) 및 형광 (상부 패널)에서 ~ 48 h 후 시비를 관찰 하였다. 무형 유산 유 충 (왼쪽 패널)에서는 어떠한 출혈 관찰 되지 않았다. 뇌와 뇌 (화살)에 있는 적혈구의 뚜렷한 축적은 무형 유산 + 애벌레 (우측 패널)에서 관찰 되었다. 축척 막대는 250 µm를 나타냅니다. 그림은 크리이 엣 알20 에서 크리에이티브 커먼즈 라이센스 하에 허가를 받은 상태에서 재현 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
4. 셋째 날: 72 hpf에서의 세포 사 멸 및 백혈구 분석
<ol><li>형광 현미경을 이용 하 여 애벌레를 스크린 하 여 형광체 단백질의 발현을 보장 한다. 참고: 본 연구에서, 형질 전환 유비크: Sec부록-mvenus 유 충은 뇌 세포 사 멸 및 이중 형질 전환 mpo를 보고 하는데 사용 되었다: GFP; mpeg1: 엠 체리 또는 유비. mpeg1: 엠 체리는 백혈구 분석에 사용 됩니다.</li>
	<li>0.02% MS222을 포함 하는 E3 미디어로 라이트 시트 장착 챔버를 채웁니다.</li>
	<li>마 취는 0.02% MS222를 사용 하 여 애벌레를 유 충 합니다. 단일 액 적으로 건조 된 배양 접시 표면에 설치 (n=1-6) 하기 위한 유 충을 이송 한다. 가능한 한 많은 액체를 제거 하십시오. 참고: 1.5% 낮은 용융 아가 로스는 전자 렌지에 메 틸 렌 블루를 사용 하지 않고 10ml의 E3 배지에서 용 해 된 낮은 용융 아가 로스 0.15 g을 사용 하 여 제조 되며, 사용할 때까지 45 ° c에서 보관 합니다.</li>
	<li>1.5% 저 용융 아가 로스 (45 ° c 열 블록에 액체로 유지)를 애벌레에 추가 하 고 800 µm 장착 모 세관을 사용 하 여 애벌레를 먼저 머리 위로 그립니다. 위치가 정확 하지 않다면 애벌레는 아가 로스 로부터 추방 되어 다시 장착 될 수 있다. 라이트 시트 챔버에 삽입 하기 전에 모 세관을 식혀 둡니다. 참고: 또는이 절차에는 공초점 현미경을 사용할 수 있습니다. 이를 위해 유 충은 유리 바닥 접시 위에 수평으로 아가 로스에 장착 되어야 합니다.</li>
	<li>아이 렌즈 (~ 300 µm) 사이에 z-스택 이미지를 획득 하 고 최대 강도 프로젝션 이미지를 처리 합니다.<ol>
<li>총 형광 세포 수 및 총 강도 형광20에 대해 수집 된 이미지에서 뇌 부위를 분석 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>18-24 h 이상의 다중 프로젝션 컴포지트의 타임 랩 스 비디오를 생성 하 여 백혈구 이동성 및 죽어가는 세포와의 상호 작용을 추적 합니다. 참고: 장기 라이브 이미징이 수행 되는 경우, 하나의 애벌레만이 모 세관에 장착 됩니다.</li>
	<li>화상 진 찰이 완료 되 면 안락사 하는 4% MS222의 치명적인 과다 복용으로 장착 모 세관에서 애벌레를 추방 한다.</li>
</ol>5. 셋째 날: 72 hpf에서 운동 성 분석을 위한 애벌레 선택
<ol><li>마 취는 0.02% MS222를 가진 페 트리 접시에 있는 애벌레를 유 충 합니다.</li>
	<li>운동 성 분석을 위해 n = 24 애벌레를 무작위로 선택 하 고 신선한 E3 매체로 옮겨 동물이 마 취 로부터 회복 하도록 합니다. 주:이 점에서 마 취 제는 잡기 쉬운 슬로우 수영 선수의 선택 바이어스를 제거 합니다.</li>
</ol>6.3-5 일: 72, 96 및 120 hpf에서 운동 하는 것
<ol><li>72 hpf에서 선택 된 유 충이 메 틸 렌 블루 없이 E3 매체로 선정 되었습니다. 주: 3 dpf에서의 서 리는 유 충이 마 취 (&gt; 1 시간)에서 회복 하기에 충분 한 시간을 허용 합니다.</li>
	<li>24 웰 플레이트의 웰 1 mL에 1 개의 애벌레를 피 펫을 이용 하 여 플레이트 한다. 참고: 애벌레의 손상을 방지 하기 위해 피 펫 팁의 끝을 자릅니다. 플레이트 크기는 실험 설계에 따라 변경 될 수 있다.</li>
	<li>카메라 챔버에 플레이트를 적재 하 고 화이트 라이트 놀라게 루틴을 사용 하 여 10 분 동안 모션을 분석 하 여 자발적인 수영을 증가 시킵니다. 참고: 수영 동작은 카메라 챔버 및 추적 소프트웨어 ( 재료 표참조)를 사용 하 여 추적 되었습니다.</li>
	<li>96 및 120 hpf에서 동일한 애벌레를 사용 하 여 실험을 반복 합니다. 분석 판의 개별 하우징에서 유 충을 페 트리 디쉬로 옮기고, 분석 사이에 28°c에서 배양 한다.</li>
	<li>분석 완료 시, 4% MS222의 치명적인 과다 복용으로 애벌레를 안락사 시킵니다.</li>
</ol>

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</ol>

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이 연구는 zebrafish 애벌레에 있는 ICH가 체계적으로 해석 되 고 정량화 될 수 있는 인간적 인 조건의 중요 한 측면을 탈환 하는 뇌 손상 반응을 유도 한다는 것을 보여줍니다. Zebrafish는 자발적 무형의 일관 되 고 재현성 있는 모델을 제공 하 여 혈관 파열을 방지 하기 보다는 혈액 유발 뇌 손상을 대상으로 하는 데 초점을 맞춘 미래의 약물 개입 연구를 지원 합니다17,28. 실제로, 임상 상황과 유사한 질병 발병의 급속 한 본질을 감안할 때, 그러한 접근법은 미래에 성공적인 번역을 위한 흥미로운 전망을 제공 합니다.
일부 제한은 개발 시스템 및 분류 계급의 사용과 같은 zebrafish 애벌레의 사용과 관련 되어 있지만,이 모델의 실용적이 고 과학적인 이점은 무형 유산에 대 한 새로운 통찰을 제공 하는 것으로 간주 되어야 한다. 수술은 시 술을 시작 하거나 부상 후 시간의 연장 된 기간 동안 세포 과정을 모니터링 할 필요가 없습니다. 제 브라 피시 페어링의 높은 체 내는 쉽게 접근 가능 하 고 큰 샘플 크기를 생성 하며, 애벌레의 빠른 발달로 인해 설치류 연구29,30에 비해 실험적 타임 라인이 현저히 감소 하였다.
현재이 모형은 살아있는 본래 동물의 두뇌에 있는 자발적인 무형 유산에 즉각 병리학 적이 고 면역학 반응을 해명 하기를 위해 사용 하기 위하여 적합 합니다. 잠재적으로,이 모델은 예방 또는 회복 촉진 여부에 관계 없이 무형 유산 요법을 위한 중간 정도의 높은 처리량의 약물 스크리닝에 적합 합니다. 이와 같이,이 연구에 제시 된 사후 무형 병 리는 전 임상 무형 유산 연구를 위한 대안적이 고 보완적인 플랫폼을 나타낸다.

뇌 내 출혈 (ICH)은 자발적인 대뇌 혈관 파열과 관련 되었던 치기의 가장 가혹한 하위 유형 및 뇌 손상, 신체 장애 및 수시로 죽음1에 지도 하는 실질로 출혈입니다. 무형 유산2와 관련 된 높은 사망률 및 발병 률에도 불구 하 고, 언더 피닝 병 인 및 출혈 후 병리학의 이해는 여전히 결여 되어 있다. 따라서, 무형 유산을 예방 하거나 환자 결과를 개선 하기 위한 특별 한 치료법이 없습니다. 질병 생물학에 대 한 우리의 이해의 대부분은 ICH의 전 임상 설치류 모델에서 왔다3, 그러나 연구-이 모델에서 날짜는 클리닉에 어떤 성공적인 치료를 번역 하지 못했습니다4,5. 이 실패는 부분적으로, 포유류에서 모형을 생성 하는 침략 적인 수술을 위한 인간적 인 질병 및 요구 사항의 자발적인 본질을 쉽게 탈환 하는 무 능력을 포함 하 여, 이들 전 임상 모델의 몇몇 한계에 기인 할 수 있다6. 또한, 설치류는 온전한 조직에서 무형 유산에 대 한 세포 반응의 급속 한 발병을 관찰 하는 것과 관련 하 여 실질적인 문제를 제기 한다. 설치류 모델에서 번역의 부족을 감안할 때, 자연 무형의 대체 모델을 개발 하는 것은 우리가 이러한 실제적인 문제를 극복 하 고 새로운 약물 표적을 식별 하는 데 도움이 되는 경우에 필수적 이다.
혈관 발달의 분자 기전은 제 브라 피시 (danio 재기록)7을 포함 하 여 척추 동물 사이에서 잘 보존 됩니다. 이와 같이,이 모형 유기 체의 채택은 뇌혈관 질환8을 공부 하기를 위한 지금까지 더 유용한 기계화 전략이 되 고 있습니다. 뇌졸중 관련 조건9, 10,12와 관련 된 표현 형을 탈환 하는 다양 한 zebrafish 모델이 생성 되었습니다. 질병 병 인을 조사 하기 위해 zebrafish 애벌레의 사용은 포유류 모델8보다 실용적이 고 과학적인 이점을 제공 합니다. 여기에는 설치류와 관련 된 침 습 적 제약 없이 생체 내 이미징이 가능한 높은 재생 속도, 급속 한 개발 및 애벌레 투명성이 포함 됩니다. 이러한 장점을 다양 한 유전자 변형 리포터 라인과 결합 하 여 제 브라 피시 연구 공동체 내에서 사용할 수 있는 것은 질병 생물학을 연구 하기 위한 강력한 생체 내 접근법으로 서, 아직 병리학 적 연구에 활용 되지 이는 무형 유산의 결과 이다.
뇌의 혈액에 대 한 부상 반응은 복 상13; 1 차적인 모욕은 선천적인 면역 활성화에 의해 유도 되는 손상의 이차 물결을 시작 하는 신경 죽음과 세포 괴 사를 일으키는 원인이 됩니다. 뇌 손상, 특히 신경 염증 성분의 두 번째 단계는 미래의 약물 치료13에 대 한 현실적인 대상으로 간주 됩니다. 자발적 및 대뇌 특이 적 출혈는 제 브라 피시 애벌레에 앞서14,15,16,17,18에 기술 되었다. 이러한 두 가지 모델은 HMGCR 통로 및 콜레스테롤 생 합성14를 저해 하는 24 시간 후 시비 (hpf)에서 아 토르 바 스타 틴 (ATV)을 사용 하 고, arhgef7 유전자에서의 저 혈당 돌연변이를 발현 하는 버블 헤드 (bbh) 돌연변이, β 픽스, 이어서 단단한 혈관 내 접합부에 대 한 액 틴 리 모델링을 억제 한다 (18). 이 모형은 순환의 개시에서 자발적인 대뇌 특정 혈관 파열을 전시 합니다 (~ 33 hpf). 최근, 우리는 뇌 손상 반응의 주요 측면이 인간과 zebrafish 애벌레 (20) 사이에 보존 되는 것을 공개 하기 위해 이러한 모델을 특징으로 한다. 이 연구는 zebrafish 애벌레에 있는 자발적인 두뇌 출혈 및 뇌 손상을 정량화 하는 방법, 그리고 인간 상태와 관련 있는 운동 및 신경 염증 표현 형을 획득 하 고 시각화 하는 데 필요한 방법론을 보여줍니다. 이러한 데이터 및 기술은 임상 전 무형 유산 연구를 위한 가치 있는 보완적인 시스템으로 서이 모델 종의 사용을 지원 한다.

<table><tbody><tr><td>24 웰 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>28 &deg; C 인큐베이터</td><td>LMS</td><td>210</td><td></td></tr><tr><td>Atorvastatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PZ0001-5mg</td><td></td></tr><tr><td>사육 상자</td><td>Thoren Aquatics 시스템</td><td>10011</td><td></td></tr><tr><td>Daniovision 관측실</td><td>Noldus</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>E3 매체 1x</td><td></td><td></td><td>4% Instant Ocean, 500 &micro; L 메틸렌 블루 1L dH2O</td></tr><tr><td>EthoVision XT 소프트웨어</td><td>Noldus</td><td>버전 11</td><td></td></tr><tr><td>열 블록</td><td>Grant-Bio</td><td>PHMT-PSC18</td><td></td></tr><tr><td>인스턴트 오션</td><td>인스턴트 오션</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>라이트 시트 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Z.1</td><td></td></tr><tr><td>라이트 시트 현미경 장착 모세관</td><td>Zeiss</td><td>402100-9320-000</td><td></td></tr><tr><td>저녹는 아가로스</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>메틸렌 블루</td><td>시그마-알드리치</td><td>319112-100ML</td><td></td></tr><tr><td>현미경&nbsp;</td><td>라이카</td><td>MZ95</td><td>해부 현미경</td></tr><tr><td>현미경 라이</td><td>카</td><td>M165FC</td><td>형광 현미경</td></tr><tr><td>MS222</td><td></td><td></td><td>4g 트리카인 분말, dH2O 500mL, 1M 트리스 10mL(pH 9). pH를 ~7로 조정</td></tr><tr><td>P1000 피펫</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>P1000 피펫 팁</td><td>Starlab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Starlab</td><td>E1414-0300</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시&nbsp;</td><td>코닝</td><td>101VR20</td><td></td></tr><tr><td>피펫보이</td><td>인테그라 생명과학</td><td>피펫보이</td><td></td></tr><tr><td>스트라이프렛 25ml</td><td>코닝</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>트리카인 파우더</td><td>시그마-알드리치</td><td>A5040-25G</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>피셔 바이오시약</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>초미세 해부 겸자</td><td>한천 과학</td><td>AGT502</td><td></td></tr><tr><td>Zen 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td>버전 2.3</td><td></td></tr></tbody></table>

출혈 성 뇌졸중의 병리학 적 결과를 연구 하기 위해 제 브라 피시 애벌레 사용

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

높은 글로벌 사망률을 가진 치기의 가장 가혹한 특수형 임에도 불구 하 고, 뇌 내 출혈 (ICH)를 가진 환자를 위한 특별 한 처리는 없습니다. 무형 유산 모델링 사전-임상적으로는 어려운 것으로 입증 되었으며, 현재 설치류 모델은 인간의 ICH의 자발적인 본질을 제대로 탈환 하 고 있다. 따라서 무형 유산의 질병 기전을 연구 하 고 잠재적인 신약 발견을 위한 대체 전 임상 방법론에 대 한 긴급 한 요구 사항이 있다.
Zebrafish의 사용은 주로 질병의 포유류 모델을 통해 소유 하 고 있는 다 수의 장점으로 인해 번역 연구에 대 한 점점 더 인기 있는 접근법을 나타내며, 다양 한 재생 속도와 애벌레 투명성을 포함 하 여 살아있는 이미징. 다른 집단은 제 브라 피쉬 애벌레가 뇌혈관 발달의 유전 적 또는 화학적 파괴를 따르는 자발적인 무형 유산을 전시할 수 있다는 것을 확립 했습니다. 이 방법론의 목적은 임상 전 무형 유산 연구의 맥락에서 뇌 출혈의 병리학 적 결과를 연구 하기 위해 이러한 모델을 활용 하는 것입니다. 살아있는 화상 진 찰 및 운동 성 분석을 사용 하 여, 뇌 손상, 신경 염증 및 무형 문화 유산 후 기능을 평가 하 고 정량화 할 수 있습니다 운동.
이 연구는 인 간에 있는 뇌 출혈의 주요 병리학 적 결과는 무형 문화 유산의 전 임상 조사를 위한 중요 한 생체 내 시스템으로 모델 유기 체를 강조 하는 zebrafish 애벌레에 보존 되어 있음을 보여준다. 이 방법론의 목적은 제 브라 피시 애벌레 모델을 설치류에 대 한 대체 보완 모델 시스템으로 사용 하기 위해 전 임상 뇌졸중 커뮤니티를 활성화 하는 것입니다.

형질 전환 유비 큐를 이용한 뇌 세포 사 멸의 평가: 세 넥 터-mvenus는 모든 무형 유산 유 충에 존재 하는 ATV와 bbh 모델에서 무형 유산 + 애벌레에서 죽어가는 세포의 확실 한 클러스터를 초래 한다 (그림 3). 클러스터는 96 hpf 전에 후퇴 합니다. 이미지 분석을 통해, 출혈은 뇌의 형광 신호의 총 강도에서 현저한 2 배 증가와 연관 되어, 표시 된 세포 사 멸을 나타냅니다.
신경 염증 반응은 ICH + 애벌레에서 두뇌에 있는 mpeg1 양성 대 식 세포의 수를 현저 하 게 증가 시켜 서 확인 됩니다. 총 mpo 포지티브 호 중구 세포의 수 또한 증가 하지만 통계적 유의 성은 도달 하지 않았다 (도 4). Mpeg1 양성 대 식 세포의 형태학은 또한 세포가 활동적인 둥근, 아메바 모양 모양을 채택 하기 때문에 무형 유산 + 애벌레에서 변화 하는 것을 볼 수 있습니다. 이러한 활성화 된 둥근 세포는 또한 시간이 지남에 따라 모니터링 되어 유비의 증가 된 식 세포 반응을 보여주기 위해 있습니다 :무형 유산 + 애벌레에서 죽어가는 셀을 표현 하는 sec부록 청구-Mvenus (그림 5). 야자수 과정을 나타내는 양성 대 식 세포 mpeg1 는 비활성으로 분류 되었다.
뇌 출혈은 bbh 및 ATV 모델 모두에서 ICH 형제 컨트롤과 비교 하 여 72 및 96 hpf의 운동 성 유의 한 감소와 관련이 있습니다 (그림 6). 120 hpf의 운동 성이 근처의 기준선 수준으로 회복 됩니다. 달걀 클러치와 균 주 사이의 기준선 운동 성에는 종종 차이가 있으므로 매번 ICH를 제어 해야 합니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig3.jpg"> 그림 3 : 제 브라 피시 애벌레의 뇌 내 출혈 (ICH)이 정량적 인 뇌 손상을 초래 합니다. 72HPF의 무형 유산 형제 (왼쪽 패널)와 비교 하 여 무형 유산 + 애벌레 (우측 패널)의 뇌 손상 표현 형의 대표 이미지. 명시 야 이미지 (하단 패널, 스케일 바 = 250 µm)는 무형 유산 + 애벌레의 뇌 출혈 (화살)의 존재를 보여줍니다. 형광 현미경은 유비 크에 세포 사를 가시화 하기 위해 수행 되었다 :sec부록-mvenus 리포터 라인 (상단 패널, 스케일 바 = 100 µm). 죽어가는 세포의 군집은 peri-헤 마로 알 영역에서 관찰 되었다. 이미지는 뇌 전용 영역으로 잘리고 보조 파일 1에서 매크로를 사용 하 여 지름 30 픽셀 보다 큰 원형 입자의 총 녹색 형광 강도 (흰색 선)를 분석 했습니다. (B) ATV 모델을 통해 얻은 비 처리 된 무형 유산 및 무형 유 충의 뇌에서의 형광 신호의 정량화는 72 hpf에서 3 개의 독립적 복제). ICH +를 치료 하지 않은 것과 비교 했을 때 유의 0.03 한 차이를 관찰 하였다 (* * p = 0.004). (C) 상기 버블 헤드 (bbh) 모델을 통해 얻어진 엔 다 인 및 무형 유산의 두뇌에서의 부록에 결합을 위한 판독으로 서 형광 신호의 정량화는 72 hpf에서 2 개의 독립 복제). 그래프는 평균에서 SD를 보여줍니다. MVenus 형광의 현저한 차이는 무형 유산 +와 무형 유산에 부합 하는 형제 (* * 0.002) 사이에서 관찰 되었다. 그림은 크리에이티브 커먼즈 라이센스 하에서 허가와 함께 Crilly 외20 에서 재현 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig4.jpg"> 그림 4 : 뇌 내 출혈 (ICH)은 제 브라 피시 애벌레 두뇌에서 타고 난 세포 면역 반응을 시작 합니다. 백혈구의 수는 이전에 mpo에 대해 설명 된 뇌 영역 내에서 정량화: GFP; mpeg1: dsRed 이중 형질 전환 애벌레 (2 개의 독립 복제)에서 72 hpf는 대 식 세포 (* p = 0.01)에서 현저한 증가를 밝혀 주지만 호 중구 (p = 0.5), 무형 유산에 대 한 대응 그림은 크리에이티브 커먼즈 라이센스 하에서 허가와 함께 Crilly 외20 에서 재현 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig5.jpg"> 그림 5 : 활성화 된 대 식 세포는 뇌 병 변에 대 한 포식 반응을 보여준다. (A) 대표 타임 랩 스 스틸 (야자수)은 부록 긍정 세포 (아이 vi)로 이동 하는 대 식 세포를 나타낸 것 이다. 스틸은 20 배 대물 렌즈를 사용 하 여 전체 뇌를 촬영 한 일련의 이미지에서 얻습니다. 축척 막대는 50 µm을 나타냅니다. 대 식 세포는 부록 양성 세포 (vi, vii)를 포식 하기 전에 아메바 형태 (v)를 획득 하였다. 포식 후에 대 식 세포는 야자수 형태학을 재개 하 고 합병 하 고 부록 긍정 세포는 더 이상 볼 수 없습니다 (viii). 야자수 대 식 세포 (#), 아 넥 Inv 양성 세포 (화살표), 아메바 대 식 세포 (*)가 지시 되어 있다. (B) mpeg1의 양성 세포 및 무형 유산 및 야자수 형태학을 나타내는 ich + 라 발 뇌의 대표 이미지. 축척 막대는 50 µm을 나타냅니다. (C) 무형 유산과 비교 하 여 야자수 뇌에서 대 식 세포의 증가 된 비중 및 감소 된 비율이 관찰 되었다. 그림은 크리에이티브 커먼즈 라이센스 하에서 허가와 함께 Crilly 외20 에서 재현 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig6.jpg"> 그림 6 : 무형 유산 유발 뇌 손상은 제 브라 피시 애벌레에서 정량 운동 적자를 초래 한다. (A) 무형 유산 및 72, 96 및 120 HPF에서 ich + bbh 유 충의 대표적인 수영 트랙 예 (B) 무형 유산 + 유 충은 72 및 96 hpf 모두에서 10 분 기록 기간 동안 이동에 소요 되는 누적 시간을 현저히 감소 시켰다. 120 hpf 시점에서의 유의 성은 손실 되어 뇌 손상 으로부터 회복을 잠재적으로 암시 합니다 (그룹 당 n = 24 애벌레; 3 개의 독립 된 0.003 0.00006 복제를 0.08 수행 합니다. (C) 120 hpf에서 무 치료 및 ATV 처리 된 ICH 및 ich + 애벌레에서 이동 하는 데 소요 되는 누적 시간의 정량화. 무형 유산 + 유 충은 10 분 기록 기간 동안 모바일에 소요 되는 누적 시간의 현저한 감소를 나타냈다. 3 개의 기술 복제 (그룹 당 n = 24 애벌레)를 사용 하 여 0.0003 0.00004 평균에서 SD를 계산 하였다. 그림은 크리에이티브 커먼즈 라이센스 하에서 허가와 함께 Crilly 외20 에서 재현 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
보조 파일 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/Supplementary_File_1-Macro.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기에서 우리는 인간의 뇌 내 출혈 (ICH)의 맥락에서, 제 브라 피쉬 애벌레에 있는 두뇌에 있는 출혈 뒤에 뇌 손상, 운동 적자 및 신경 염증을 정량화 하는 프로토콜을 제시 합니다.

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

이 방법은 출혈성 뇌졸중 후 뇌의 혈액에 대한 즉각적인 세포 반응을 연구하기위한 무료 전 임상 접근법을 제공합니다. 설치류 모델과 는 달리, 제브라피시 애벌레의 투명성은 형광 현미경 을 사용하여 실시간으로 살아있는 동물의 뇌 내에서 세포 반응을 관찰 할 수 있습니다. 시작하려면 차 여과기를 사용하여 한 남성과 1 ~2 명의 여성 성인 제브라피시에서 생산 된 사육 상자에서 천연 산란에서 모든 수정 된 배아를 수집하십시오.표준 E3 배아 배지를 함유한 각 페트리 접시에 100개의 배아를 전달한다. 표준 지침에 따라 섭씨 28도에서 배양하고 스테이지를 진행합니다. 수정 후 6시간 동안 파스퇴르 파이펫을 사용하여 접시에서 죽은 배아와 수정되지 않은 배아를 제거하고 접시를 인큐베이터에 다시 넣습니다.24 시간 후 수정, 밝은 필드 스테레오 현미경에서, 아토르 바스타틴 치료에 대 한 배아를 탈경 하기 위해 날카로운 초박형 집게를 사용 하 여. 그런 다음 E3 배아 배지 30밀리리터를 두 개의 깨끗한 페트리 접시에 추가하면, 하나는 치료를 위해, 다른 하나는 대조를 이시합니다. 처리 접시에서 배아 물 60 마이크로리터를 제거하고 애벌레 출혈의 80 %를 달성하기 위해 0.5 밀리머라 아토르 바스타틴의 60 마이크로 리터를 추가합니다.파스퇴르 파이펫을 사용하여 100개의 배아를 각 접시에 가능한 한 적은 물에 옮기습니다. 섭씨 28도에서 두 가지 요리를 배양하십시오. 수정 후 50시간 후 언제든지 현미경으로 파스퇴르 파이펫을 사용하여 출혈이 없는 집단에서 출혈을 조심스럽게 분리하고 애벌레를 신선한 E3 미디어를 함유한 새로운 요리로 옮습니다.출혈 양성 애벌레를 쉽게 분리하기 위해 적혈구에서 형광 단백질을 표현하는 안료 나 물고기없이 물고기를 사용할 수 있습니다. 셋째 날, 형광 현미경으로 유충을 검사하여 형광 단백질의 발현을 보장합니다. 그런 다음 광시트 장착 챔버를 0.2%MS-222를 함유한 E3 용지로 채우면 마취를 한다.파스퇴르 파이펫을 사용하여 1-6개의 애벌레가 들어 있는 한 방울을 건조 페트리 접시 표면에 전달하여 장착합니다. 파이펫을 사용하여 가능한 한 많은 액체를 제거하십시오. 45도의 낮은 용융 아가로즈를 애벌레에 넣고 800 마이크로미터 장착 모세관을 사용하여 유충을 먼저 끌어올립니다.포지셔닝이 정확하지 않은 경우 아가로즈에서 애벌레를 추방하고 다시 마운트하십시오. 모세관을 식힌 다음 라이트 시트 챔버에 삽입하십시오. ZEN 이미징 소프트웨어에서, 애벌레의 방향을 지정하고 눈 렌즈 사이의 헤드의 z 스택 이미지를 얻기 위해 획득을 누르기 위해 연속프레스.처리 탭에서 각 z 스택에서 최대 강도 투영 이미지를 생성합니다. 운동성 분석기를 무작위로 선택하려면 마취 후 24개의 애벌레를 신선한 E3 매체로 옮기고 동물이 마취에서 회복할 수 있도록 합니다. 애벌레가 마취에서 완전히 회복된 후, 말단 절단 이체가 있는 파이펫을 사용하여 메틸렌 블루없이 E3 배지로 유충을 회수하였다.24 웰 플레이트의 우물 당 1 밀리 리터에 하나의 애벌레를 접시. 플레이트를 카메라 챔버에 로드합니다. EthoVision XT 추적 소프트웨어에서 실험 설정을 조정하여 백색 광 깜짝 루틴을 설정하여 10분 동안 자발적인 수영 및 분석 동작을 늘립니다.96 및 120 시간 후 fertilizatin에서 운동 분석을 반복합니다. 형질비퀴틴분비체를 이용한 뇌세포 사망 평가는 녹색 형광브라이트필드 영상에 의해 표시된 모든 비출혈유충에 결석한 출혈성 애벌레에서 죽어가는 세포의 명확한 클러스터를 생성한다. 죽어가는 세포는 출혈유충에 대한 아토르바스타틴 과 버블 헤드 모델 모두에서 관찰되었다.MPEG1 양성 대식세포의 형태는 세포가 활성 둥근 아모에이드 모양으로 채택함에 따라 인트레이스 역골 출혈 양성 애벌레의 변화입니다. 이러한 활성화된 둥근 세포는 시간이 지남에 따라 모니터링되어 유비퀴틴분비체 의 증가된 식세포 반응을 나타내기 위해 서마레뇌 출혈 양성 애벌레에서 죽어가는 세포를 발현하는 유비퀴틴 V M 정맥의 증가된 식세포 반응을 나타내었다. 뇌 출혈은 72 및 96 시간 후 수정 후 운동성에 있는 유의한 감소와 연관됩니다.120시간 후 수정시 운동성은 기준선 수준에 가깝게 회복됩니다. 이 절차의 가장 중요한 측면은 현상금 표고 를 진행하기 전에 뇌 출혈의 존재 또는 부재에 대한 애벌레를 철저히 검사하는 것입니다. 이 모형은 또한 현상형 엄격이 출혈 후에 향상될 수 있는지 결정하기 위하여 약 검열을 위해 이용될 수 있습니다, 미래에 새로운 약 후보를 확인하기 위하여 저희를 이끌어 낼 수 있는 접근.이 기술은 우리가 지금 전에 공부하기 위하여 이렇게 악명 높게 어려웠던 시간 점 도중 두뇌에 있는 출혈 후에 즉시 세포 반응을 탐구하는 것을 허용합니다. 이 프로토콜에 설명된 시약이나 계측기는 특별히 위험하지 않지만 화학 물질, 날카로운 또는 레이저를 사용할 때마다 표준 관리 및 예방 조치를 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 주사 전자 현미경(SEM)과 투과 전자 현미경(TEM)의 요소를 결합하여 고해상도 이미지를 생성하는 기술인 대규모 주사 투과 전자 현미경(STEM)을 사용하여 제브라피시 유충의 뇌 손상을 조사하는 방법을 보여줍니다. 뇌 손상을 식별하기 위해 샘플을 준비하고 고해상도 STEM 이미지를 획득하는 데 필요한 단계를 간략하게 설명합니다.

Investigating a a Zebrafish Larval Brain Injury Using Large-Scale Scanning Transmission Electron Microscopy(대규모 주사 투과 전자 현미경을 사용한 제브라피시 유충 뇌 손상 조사)

이 비디오에서는 수정된 제브라피시 배아를 실체 현미경으로 적척한 다음 콜레스테롤 합성 억제제에 노출시켜 유충에서 혈관 파열과 뇌출혈을 유발합니다. 뚜렷한 붉은 반점으로 식별할 수 있는 출혈성 유충은 이후 추가 분석을 위해 현미경으로 분리됩니다.

제브라피시 유충의 약물 유발 출혈 모델링

애벌레 제브라 피쉬의 뇌 발달의 영상이 설명되어 있습니다. 3D 영상을 촉진하고 화학적 처리를 사용하여 뇌 혈관 발달을 수정하는 기술도 제공됩니다.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

제브라피시 성체 신경 발생 및 재생의 세포 및 분자 메커니즘을 밝히기 위해 우리는 제브라피시 성체 텔렌스팔론에서 기계적 손상을 일으키는 침습적 수술과 면역조직화학 또는 현장 교잡화에 의한 찌른 반구의 변화를 모니터링하는 프로토콜을 개발했습니다.

Zebrafish의 성인 Telencephalon의 자상 부상 : 척추 동물의 뇌 신경 발생과 재생을 조사하는 방법

이 기사는 제브라피시 배아에서 기계적 혈관 손상을 일으키는 방법을 설명합니다. 이 부상 모델은 실시간 현미경 검사에 이상적으로 적합한 유기체에서 지혈, 부상 관련 염증 및 상처 치유를 연구하기 위한 플랫폼을 제공합니다.

Zebrafish의 태아에서 기계 선박 부상

합성, 특성, 및 성인 zebrafish 조직학 분석 및 탐지 하는 Alzheimer의 질병 모델을 설정 하에 아 밀 로이드 독성을 생성 하기 위한 단위체 아 밀 로이드-β42 펩 티 드의 사출이이 프로토콜에 설명 합니다. 집계입니다.

아 밀 로이드-β42 독성 그리고 Zebrafish 두뇌에서 Neurodegeneration 모델링

여기서 우리는 생체 내 최대 애벌레와 청소년 단계에서 제브라피시 배아 뇌를 이미지화하는 방법을 제시합니다. 전기 생리학적 접근법에서 채택된 이 미세침습 절차는 성숙한 뉴런의 세포 및 세포 세포 이하 세부 사항에 대한 액세스를 제공하며 뇌 기능 및 약물 개입을 특성화하기 위한 광유전학 및 신경 약리학과 결합될 수 있습니다.

두개골과 피부 제거에 의해 깨어 얼룩말 물고기 애벌레와 청소년에서 완전히 활성 뇌 조직의 생체 내 이미징

우리는 무딘 힘 외상성 뇌 손상 (TBI) 및 후속 신경 재생의 기초 메커니즘에 따라 병리학의 폭을 검사하기 위해 성인 얼룩말 물고기에 대한 Marmarou 체중 드롭 모델을 수정했습니다. 이 무딘 힘 TBI 모델은 확장 가능, 온화한 유도, 보통, 또는 심한 TBI, 인간의 TBI에서 관찰 부상 이질성을 다시 수상.

성인 얼룩말 피시의 무딘 힘 부상의 효과를 연구하는 확장 가능한 모델

성인 제브라피쉬의 기계적 뇌 손상 모델은 높은 재생 능력을 조절하는 분자 메커니즘을 조사하기 위해 설명됩니다. 이 방법은 형광 면역 염색을 사용하여 재생 반응을 평가하기 위해 여러 종의 작은 물고기의 시신경에 찔린 상처 손상을 만드는 것을 설명합니다.

재생 능력의 비교 분석을 위해 Zebrafish와 Medaka를 사용한 성인 시신경의 찔린 상처 부상 모델

본 프로토콜은 유충 취급을 위한 자동화된 미세유체 플랫폼과 결합된 레이저 병변 시스템을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 조직 특이적이고 재현성이 높은 부상을 유도하는 방법을 기술한다.

제브라피쉬 유충의 척수 재생 연구를위한 제어 된 반자동 레이저 유도 부상

본 프로토콜은 복부 이뇌팔론(Dn)에서 신경독성 6-히드록시도파민(6-OHDA)을 갖는 성인 제브라피쉬의 뇌심실(ICV) 주사 및 개방 탱크 테스트를 사용하여 수영 거동 후 후유증의 장애 및 후속 회복에 대한 평가를 설명하며, 이는 비디오 추적 소프트웨어를 이용한 분석을 수반한다.

6-하이드록시도파민 유발 성인 제브라피쉬계 파킨슨병 모델의 운동성 평가

학습하세요 출혈성 뇌졸중 후 뇌 손상, 운동 장애 및 신경염증을 정량화하는 방법을 Danio rerio 애벌레를 사용하여. 형광 현미경을 활용한 실시간 관찰로 세포 반응을 분석하고 잠재적 치료제 선별에 활용할 수 있습니다.

출혈 성 뇌졸중의 병리학 적 결과를 연구 하기 위해 제 브라 피시 애벌레 사용

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