Name: 유세포측정을 통한 BK-폴리오마바이러스 비코딩 제어 영역 구동 전사 활성 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 학습하세요 유세포측정을 이용한 BK-폴리오마바이러스 비코딩 제어 영역 구동 전사 활성 측정 방법을. HEK293T 세포와 이중 형광 리포터를 활용하여 항바이러스 화합물의 효과를 정량적으로 평가할 수 있습니다.

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저자는 우수한 기술 지원을 바바라 블레크만 감사합니다. 이러한 연구는 뒤스부르크 - 에센 의과 대학의 IFORES 프로그램과 대학 얼라이언스 루르와 메르카토르 연구 센터 루르 (MERCUR)의 RIMUR 프로그램에 의해 지원되었다. 저자들은 헬렌 세르츠니그 박사의 펠로우십과 지속적인 지원에 대해 위르겐-만초-스티퉁에게 감사를 표한다. 수집 및 환자 자료의 사용은 대학 뒤스부르크 - 에센의 의료 학부의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (14-6028-BO).

이 프로토콜은 뒤스부르크 - 에센 대학의 의료 학부의 윤리위원회에 의해 승인 된 인간의 연구의 지침을 따릅니다 (14-6028-BO).
1. 혈액 또는 소변 샘플 수집 및 폴리오마 바이러스 DNA의 격리
<ol><li>EDTA 관 또는 수집 관에 있는 소변에 있는 혈액의 적어도 3 mL를 수집합니다.</li>
	<li>샘플을 2,500 x g에서 15 분 동안 원심 분리합니다. 필요한 경우, 파이펫 플라즈마를 새로운 튜브에 넣고 플라즈마 샘플을 며칠 동안 4°C로 저장하거나 -20°C에서 동결하여 보관하십시오.</li>
	<li>1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브에 40 μL의 단백질을 준비하고 파이펫팅으로 400 μL의 플라즈마를 추가합니다.</li>
	<li>400 μL의 용해 완충액, 15s의 소용돌이, 56°C에서 10분 동안 배양하여 샘플을 용해시.</li>
	<li>제조업체의 지침에 설명된 대로 DNA 혈액 추출 키트를 사용하여 DNA를 분리합니다. 간단히, 알코올을 추가하고 DNA 결합 실리카 기반 막을 포함하는 스핀 컬럼에 용해를로드합니다. 순수한 DNA를 산출하기 위해 열을 여러 번 씻으하십시오.</li>
	<li>TE 완충제의 30-50 μL에서 항복한 DNA를 용해시켰다.</li>
</ol>2. 비코딩 제어 영역 (NCCR)의 증폭
<ol><li>물리적으로 분리된 방에서 다음 절차를 수행합니다. 분리된 방을 사용하여 시약을 준비하고 혼합물을 PCR 튜브에 분배합니다.</li>
	<li>프라이머 쌍 A(표 1)를 사용하여 프리-PCR용 마스터 믹스를 총 부피 50 μL로 준비하고 1.6단계에서 이전에 단리된 DNA를 사용한다. 사전 및 중첩된 PCR에 대한 마스터 믹스를 준비하기 위한 파이펫팅 방식은 표2에 인쇄되어 있습니다.</li>
	<li>마스터 믹스 45 μL을 PCR 튜브에 분배합니다.</li>
	<li>분리된 DNA의 5 μL을 PCR 튜브에 추가합니다. 참고 : 오염을 방지하기 위해 마스터 믹스 준비에 대한 것보다 다른 방을 사용합니다.</li>
	<li>표3에 나타인 바와 같이 반응 조건으로 PCR을 실행한다. 35사이클에서 변성, 어닐링 및 확장을 반복합니다.</li>
	<li>중첩 증폭용 프라이머 쌍 B는 AgeI 및 SpeI에 대한제한 사이트를 항구한다(표 1).</li>
	<li>사전 PCR의 5 μL을 사용하여 단계 2.2~ 2.5에 기재된 바와 같이 반응 조건으로 중첩된 PCR을 실행한다.</li>
	<li>PCR 제품의 10 μL을 6x 젤 로딩 염료 2 μL과 혼합합니다. 혼합물의 10 μL을 1.5% 아가로즈 겔에 적재하고, 60 mA에서 30 분 동안 겔을 실행한다.</li>
	<li>적절한 UV 문서화 시스템을 사용하여 젤을 시각화합니다. 참고: 앰플리콘의 크기는 재배열(삭제, 삽입 또는 중복)이 발생했는지 여부에 따라 300-500 bp 사이가 될 것으로 예상됩니다(그림2C).</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 PCR 정화 키트를 사용하여 PCR 앰플리폰을 정화합니다. 용출 버퍼의 30 μL에서 PCR 앰플리곤을 용해.</li>
	<li>프라이머 쌍 B를 사용하여 생거 시퀀싱을위한 앰플리폰을 보냅니다.</li>
</ol>3. NCCR을 이중 형광 리포터로 복제
<ol><li>표4에 기재된 바와 같이 37°C에서 2시간 동안 AgeI 및 SpeI로 정제된 앰플리콘(단계 2.10)을 소화한다.</li>
	<li>2.10단계를 반복하고 소화된 앰플리곤을 정화한다.</li>
	<li>병행하여, 표5에 기재된 바와 같이, 37°C에서 2시간 동안 AgeI 및 SpeI로 플라스미드 백본(1.5 μg)을 소화한다. 이 단계는 한 번만 수행하면 됩니다. 후속 반응을 위해 -20 °C에서 소화를 동결하십시오.</li>
	<li>0.8% 낮은 용융 아가로즈 겔에서 소화된 플라스미드 백본을 분석하였다. 참고: 현재 40mA 보다 높은 젤을 실행하지 마십시오. 원래 플라스미드 pEX-K4 2-LTR CD3로부터 유래된 스페이서 영역의 예상 삽입은 128 bp(도 2C)이다.</li>
	<li>장파 UV 광(320 nm)을 사용하여 DNA 단편을 시각화하고 깨끗한 메스를 사용하여 백본 밴드를 잘라냅니다. 저용융 겔 단편을 새로운 1.5 mL 미세원원지 튜브로 옮김. DNA 손상을 방지하기 위해 긴 자외선 노출 시간을 피하십시오. 참고 : 낮은 용융 아가로스가 사용되기 때문에 결찰 전에 DNA를 정화 할 필요가 없습니다.</li>
	<li>젤 조각을 녹이고 부드러운 소용돌이로 2 분마다 혼합하기 위해 65 °C에서 10 분 동안 낮은 용융 아가로즈 조각을 포함하는 백본을 가열합니다. 용융 겔은 결찰에 직접 사용될 수 있다.</li>
	<li>표6에 나타낸 방식을 이용하여 16°C에서 밤에 T4 DNA 리가아를 사용하여 백본 및 소화된 앰플리콘을 리게이트한다.</li>
	<li>열 충격 방법, LB-amp 플레이트의 플레이트 박테리아, 밤새 37°C에서 배양하여 대장균의 변형을 수행합니다.</li>
	<li>다음날, 3개의 양성 클론을 선택하고 37°C에서 하룻밤 대장균 배양물(LB-Amp의 5 mL)과 배양을 준비한다.</li>
	<li>다른곳에서설명된 바와 같이 표준 프로토콜을 사용하여 플라스미드-DNA를 분리하고, AgeI 및 SpeI 소화를 수행하여 양성 클론을 확인하고 1% 아가로즈 겔에서 잘라낸 조각을 시각화합니다. 스페이서 대역(128 bp)은 더 큰 NCCR 서열(300-500 bp, 위 참조)으로 대체될 것이다.</li>
	<li>프라이머 EGFP-N 또는 프라이머 쌍 B를 사용하여 생거 시퀀싱을 위한 플라스미드를 보냅니다(표 1).</li>
	<li>돌연변이가 자발적으로 발생할 수 있기 때문에, 염기서열 분석 결과와 앰플리온으로 얻은 시퀀싱 결과를 비교한다. 앰플리온에 비해 동일한 서열을 포함하는 클론만 사용하십시오.</li>
	<li>분자 워크벤치 소프트웨어(예: 프리웨어 GENtle 1.9.4 또는 기타 시퀀스 편집 프로그램)를 사용하여얻은 시퀀스를 정렬하고 편집합니다(그림 3).</li>
	<li>GENtle 1.9.4를 시작하고 가져오기 버튼(녹색 아래쪽 화살표)을 클릭하여 DNA 서열을 가져옵니다.</li>
	<li>다음 도구를 클릭하고 메뉴에서 정렬을 선택하고 (바로 가기로 Ctrl + G 사용) 정렬을위한 DNA 시퀀스를 선택합니다.</li>
	<li>시퀀스 추가 또는 제거를클릭하여 시퀀스를 클릭하여 정렬에 시퀀스를 추가합니다. JN19243815와같은 전형적인 NCCR 합의 시퀀스를 포함, 일반적으로 사용되는 던롭 스트레인16에서NCCR 시퀀스를 사용하지 마십시오, 그것은 전형BKPyV보다 재배열 및 중복 다른 항구 때문에 변종. 참고: NCCR에는 이미 번역 시작 코돈이 포함되어 있습니다(그림 3).</li>
	<li>도구 모음에서 알고리즘을 클릭하여 정렬 방법을 선택하고 clustal W. 정렬 매개 변수를 2와 일치하도록 설정; 간격 확장 페널티 -1; 간격 페널티 -2및 확인을 클릭하여 정렬을 실행합니다.</li>
</ol>4. 기자 플라스미드와 HEK293T 세포의 과도 성 수혈 및 잠재적 인 항 바이러스 제와 치료
<ol><li>후속 형질감염 실험을 위해 충분한 양의 플라스미드 DNA를 준비하여 150 mL의 하룻밤 배양을 준비한다. 플라스미드 절연 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리합니다. 대안적으로, 다른 플라스미드 정제 키트가 사용될 수 있다.</li>
	<li>종자 1 x 105 HEK293T 세포는 10% FCS, 페니실린 및 스트렙토마이신(1x)을 함유하는 12웰 플레이트의 웰당 24시간 전에 형질감염 및 37°C 및 5% CO2에서 밤새 배양하여 형질감염 동안 활성 증식을 유지한다. 참고: 세포는 트랜스펙트 시 약 80%의 유동이어야 합니다.</li>
	<li>멸균 튜브에 250 μL의 감소된 혈청 매체를 놓고 각 리포터 플라스미드 DNA의 1 μg를 추가하고 파이펫팅하여 부드럽게 섞습니다.</li>
	<li>DNA 혼합물에 3 μL의 형질전환 시약을 넣고, 파이펫팅하여 부드럽게 혼합하고 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>혼합물을 우물에 떨어 뜨리고 우물에 부드럽게 분배합니다.</li>
	<li>4시간 후, 상판체를 시험제 및 용매 제어를 포함하는 신선한 배지로 교체한다. 분석전까지 37°C에서 배양합니다. 이 예에서, mTOR 억제제 INK128 (100 ng/mL) 및 라파마이신(100 ng/mL)을 사용하였다.</li>
</ol>5. 형광 현미경 검사법 및 유세포 분석
<ol><li>형광 현미경하에서 적색 및 녹색 형광에 대한 세포를 확인합니다(그림4). 참고: 적색 및 녹색 형광은 각각 초기 및 후기 BKPyV 유전자 발현에 해당한다.</li>
	<li>72 시간 후 형질 감염 후, 상월제를 흡인하고 차가운 PBS 의 1 mL로 세포를 두 번 씻어.</li>
	<li>500 μL의 트립신을 부드럽게 추가하고 세포의 조기 분리를 피하기 위해 플레이트를 약간 돌립니다. 이 단계는 셀 이배를 방지하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>추가 후, 같은 파이펫 팁으로 직접 트립신을 제거하십시오.</li>
	<li>37 °C에서 적어도 5 분 동안 세포를 배양하십시오.</li>
	<li>3% FCS를 포함하는 PBS의 1 mL로 트립시니화 세포를 다시 중단하고 미리 표지된 FACS 튜브에 현탁액을 전달합니다.</li>
	<li>FACS 분석 전에 DAPI(1 μg/mL)를 추가합니다.</li>
	<li>유세포계를 사용하여 세포를 분석합니다. 각 샘플에 대해 DAPI 염색에 대해 음수인 적어도 10,000개의 살아있는 세포를 측정합니다.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>데이터를 유세포 분석 분석 소프트웨어로 가져오고 클릭 및 드래그하여 샘플을 작업 공간으로 추가합니다.</li>
	<li>가져온 파일을 두 번 클릭하고 그래프 플롯을 만듭니다. x축 및 y축을 클릭하여 FSC-A 대 SSC-A를 선택합니다. 도구 모음에서 다각형을 클릭하고 셀 모집단을 프레이밍하여주 셀 모집단을 게이트합니다(그림 5). 선택한 셀 모집단의 이름을 필요에 따라 지정합니다(예: "단일 셀"). "단일 셀"이 새 작업 영역으로 나타납니다.</li>
	<li>DAPI 음성(즉, "살아있는 세포")에 대한 게이팅 "단일 세포"를 진행합니다. 살아있는 세포를 확인하기 위하여DAPI 염색의 유무에 관계없이 세포 인구를 비교합니다. 두 플롯 에서 FSC-A 대 태평양-파란색-A를 선택합니다.</li>
	<li>사각형을 클릭하고 DAPI 음수 세포 모집단을 선택하고 선택한 셀 집단의 이름을 "살아있는 셀"로 지정하고 앞에서 설명한 대로 FITC(eGFP) 대 PE(tdTomato)를 보여주는 새로운 도트 플롯을 만듭니다.</li>
	<li>도구 모음에서 쿼드를 선택하여 "살아있는 셀"에 사분면을 추가합니다. 사분면의 중심을 각 모집단의 가장자리로 드래그하여 모집단을 게이트합니다. 사분면은 1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM+, 3) eGFP+tdTOM-, 4) eGFP+tdTOM+를 나타냅니다. 참고: FITC와 PE 간의 방출 스펙트럼의 스펙트럼 오버레이로 인해 적색 신호와 녹색 신호를 구별하고 정확한 결과를 얻으려면 초기 보상이 필수적입니다.</li>
	<li>사분면을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 통계추가를 선택하여 평균 형광 강도(MFI)를 결정합니다. 평균을 선택하고 확인을클릭합니다. 평균 MFI는 이제 "통계" 섹션의 인구 아래에 표시됩니다. 사분면 2와 4는 초기 표현식에 해당하고 사분면 3과 4는 늦은 식을 나타냅니다.</li>
	<li>통계적 기능을 위해 동일한 방식으로 복제를 추가합니다.</li>
	<li>데이터 해석플롯의 경우 초기 및 후기의 MFI 값을 막대 플롯으로 플롯합니다.</li>
	<li>다른 기증자 또는 바이러스 균주에서 얻은 NCCR 활동을 비교하려면 전형적 제어 또는 Dunlop 변형률16을 추가하고 상대 MFI를 100%로 설정하고 상대 MFI 값을 계산합니다. 각 복제를 반복하고 평균 및 표준 편차를 결정합니다.</li>
	<li>전사 활성에 대한 잠재적 화합물의 효과를 평가하기 위해 용매 대조군을 100%로 설정하고 처리된 세포의 MFI를 플롯한다.</li>
</ol>

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</ol>

요하네스 코르트는 아스텔라스와 노바티스로부터 연사비와 여행경비를 지원받았다. 마레크 와이더는 노바티스로부터 컨설팅 비용을 받았습니다. 올리버 비츠케는 암젠, 알렉시온, 아스텔라스, 바실레아, 바이오테스트, 브리스톨-마이어스-스퀴브, 코레비오, 치에시, 길르앗, 헥살, 얀센, F. 쾰러 케미 박사, MSD, 노바티스, 노바티스, 로치로부터 임상 연구, 연사 수수료, 명예 및 여행 경비에 대한 보조금을 받았습니다. 화이자, 사노피, 테바.

이 문서에서는, BKPyV 비코딩 제어 영역(NCCR) 구동 초기 및 후기 프로모터 활성의 분석을 허용하는 일반적으로 사용되는 방법이 제시된다. NCCR 활성은 동시에 측정될 수 있으며 형질감염된 세포의 라시스가 필요하지 않습니다. 더욱이, 비교적 많은 수의 세포를 분석할 수 있으며 형광 값의 정상화를 위한 추가 마커의 병용형화가 필요하지 않다.
이 방법의 중요한 부분은 복제된 NCCR이 환자 혈장내 의 대다수 변이체에 대응하는 앰플리톤 시퀀싱에 의해 확인된 것과 정확히 동일한 서열을 포함해야 한다는 것입니다. 정확한 결과를 달성하고 PCR에 취약한 오류를 최소화하려면 교정 판독 활동이 있는 폴리머라제(polymerase)를 사용하는 것이 좋습니다. 대안적으로, 서열은 상업적 유전자 합성 서비스에 의해 주문될 수 있다. 지정된 NCCR 서열은 직접 복제를 위한 측면 AgeI 및 SpeI 제한 사이트를 포함하여 주문할 수 있습니다. 이 경우, 플라스미드를 백본 플라스미드와 평행하게...

폴리오마바이러스는 시미미안 바이러스 40(SV40)을 시제품 종으로 가진 작은 이중 가닥 DNA(dsDNA) 바이러스의 독립적인 군을 나타낸다. 1 차적인 감염은 일반적으로 질병 현상 없이 진행하고 일반적으로 면역 유능한 호스트에 있는 잠복 감염을 일으키는 원인이 되는 유년기 도중 주로 생깁니다. BK-폴리오마바이러스 (BKPyV)는 주로 신장 관 세포에서 신병요법을 일으키지 않고 지속하지만, 신장 이식 후 면역 능력이 손상된 경우 바이러스가 재활성화되어 심각한 손상및 이식 이식 장애를 일으킬 수 있습니다. 높은 비혈증에 도달할 때 기능 (1 x 104 BKPyV DNA 사본 / mL) 1,2. 신장 이식 수혜자의 대략 10%에서, BK-polyomavirus (BKPyV)의 재활성화는 신장 동종 이식 실패의 고위험과 관련되었던 80%까지 관련되었던 polyomavirus 관련되는 신장 병증 (PyVAN)귀착됩니다3,4 . 승인된 항바이러스제를 사용할 수 없기 때문에 현재 치료법은 면역 억제의 감소에 기초합니다. 흥미롭게도, mTOR 억제제는 항 바이러스 효과가있는 것 같다; 따라서, 면역억제 요법을 mTOR 계 면역억제로 전환하면 BKPyV 비레미아 5,6,7의 진행을 방지하는 대안적 접근법을 나타낼 수 있다. 그러나, mTOR 계 항바이러스 메커니즘은 현재 아직 불완전하게 이해된다. 따라서, 임상적으로 관련된 농도에서 잠재적항바이러스제의 영향을 측정하는 방법이 요구된다.
BKPyV의 원형 게놈은 약 5kb의 비코딩 제어 영역(NCCR)을 품고 복제의 기원역할을 하며, 이와 일치하게 초기 및 후기 단계 mRNA 전사체의 발현을 유도하는 양방향 프로모터로 구성된다. NCCR-재배열, 결실 및 중복이 병원성 BKPyV 8에서 발견되기 때문에 PVAN5,9,전형(wt)의 비교를 통해 유의하게 축적된 환자들로부터 재배열 (rr) NCCR 활동은 바이러스 복제 피트니스를 특성화하는 데 도움이됩니다.
도1에 요약된 바와 같이, 이 프로토콜은 기자 플라스미드 5로부터 발현된 두 개의 형광단 tdTomato 및 eGFP의 형광을 정량화함으로써 BKPyV NCCR 전사 활성을 측정하는 일반적인 방법을설명한다. 9,10,11. 절차는 SV40 대형 T 항원(lTAg)의 존재에서 수행되며, 이는 NCCR 활성 초기에 및 후기에 대한 잠재적항바이러스제의 영향을 별도로 분석할 수 있다5. 이 분석은 NCCR 활성에 대한 재배열의 영향을 추가로 분석하고 wt-NCCrRs5,9. 리포터 플라스미드는 각각 tdTomato 및 eGFP에 대한 두 전사체의 비교가능한 효율적인 처리를 보장하기 위해 각 형광부 개방 판독 프레임의 SV40 후기 폴리아데닐화 신호 하류를 항구합니다. qRT-PCR 기반 방법5,12에비해, 이 FACS 기반 접근법은 감염된 세포 배양에 대한 복잡한 추출 프로토콜이 없고 비용이 많이 들지 않으므로 저렴한 비용과 높은 처리량 호환 대안을 나타냅니다. 면역 형광 염색을 위한 항체가 필요합니다. 더욱이, 정의된 양의 형광세포가 유세포분석을 통해 분석되기 때문에, 세포주기 억제제의 분석도 정량적 방식으로 가능하다.

<table><tbody><tr><td>100 bp ladder</td><td>NEB</td><td>N3231</td><td>최대 1 kb 범위의 모든 사다리로 대체 가능</td></tr><tr><td>2-log ladder</td><td>NEB</td><td>N0550</td><td>최대 10 kb 범위의 모든 사다리로 대체 가능</td></tr><tr><td>Agar-Agar, Kobe I</td><td>Carl Roth</td><td>5210.3</td><td></td></tr><tr><td>AgeI-HF</td><td>NEB</td><td>R3552</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin Natriumsalz Cellpure</td><td>Carl Roth</td><td>HP62.1</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad iniectabilia</td><td>Bbraun</td><td>2351744</td>는 모든 제조업체 BD FACSCanto&trade<td>로 대체될 수</td></tr><tr><td>있습니다. II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>DFC450C 카메라 모듈</td><td>Leica</td><td></td><td>모든 카메라 사용 DMEM</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>41966-029</td> 모든 <td>제조업체로 대체 가능</td></tr><tr><td>DMIL LED 현미경</td><td>Leica</td><td></td><td>모든 형광 현미경 </td></tr><tr><td>DNA 혈액 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>는 모든 제조업체로 대체 할 수 있습니다</td></tr><tr><td>E.coli DH5alpha Competent Cells</td><td>Thermo Scientific</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior</td><td>MerckMillipore</td><td>50615</td><td>모든 FBS를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>FlowJo v10.5.3</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td>모든 유세포 분석 소프트웨어 FBS를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>젤 로딩 염료, 보라색 (6X)&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7024</td><td>모든 6x loading dye는 세포HEK293T 치환될 수 있습니다</td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>11268</td><td>이 세포는 simian virus 40(SV40) large T 항원을 구성적으로 발현하며, 클론 17은 높은 형질주입성을 위해 특별히 선택되었습니다.</td></tr><tr><td>HERAcell&reg; 240i CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>은 모든 제조업체로 대체 가능</td></tr><tr><td>HotStar PCR 키트</td><td>Qiagen</td><td>203203</td><td></td></tr><tr><td>Intas Gel 문서화 시스템</td><td>Intas</td><td></td><td>아가로스 겔을 포함하는 염색된 DNA에 대한 모든 시각화 시스템을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>저융점 아가로스</td><td>Biozym</td><td>850081</td>는 <td>모든 제조업체</td></tr><tr>에서 대체할 수 있습니다.<td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985070</td>는 <td></td></tr><tr>BKPyV 균주 Dunlop의 전장 게놈을 품고있는 모든 제조업체<td>pBKV (34-2)</td> <td>ATCC</td><td>45025</td> Plasmid로 대체 될 수 있습니다<td>. 양성 대조군으로 사용되었다. DNA 염기서열 Acc.: KP412983</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>단종 제품</td><td>모든 thermocycler를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>PCR 뉴클레오티드 믹스, 10 mM</td><td>Promega</td><td>#C1145</td><td>모든 제조업체로 대체 할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>PCR1 및 PCR2 프라이머</td><td>metabion</td><td>적용되지 않음</td><td>탈염. (10 &micro; M)을 PCR grade water</td></tr><tr><td>PenStrep (100x)</td><td>로 Gibco</td><td>15140-122</td>는 <td>모든 제조업체로 대체할 수 있습니다</td></tr>.<tr><td>-GelStain</td><td>Carl Roth</td><td>3865</td><td>dsDNA 농도 측정을 위한 형광 기반 염색</td></tr><tr><td>SpeI-HF</td><td>NEB</td><td>R3133</td><td></td></tr><tr><td>T4-DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>TransIT LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR2300</td><td></td></tr><tr><td>트립신 0.05% - EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>는 모든 제조업체에서 대체 가능</td></tr><tr><td>ZymoPURE II 플라스미드 키트</td><td>Zymo</td><td>D4201</td><td>은 모든 제조업체에서 대체 가능</td></tr></tbody></table>

유세포측정을 통한 bk-폴리오마바이러스 비코딩 제어 영역 구동 전사 활성 측정

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

BK-폴리오마바이러스(BKPyV)와 같은 폴리오마바이러스는 면역 손상 환자에서 심각한 병리학을 유발할 수 있습니다. 그러나, 매우 효과적인 항 바이러스는 현재 사용할 수 없기 때문에, 잠재적인 항 바이러스 에이전트의 영향을 측정 하는 방법이 필요. 여기서, BKPyV 비코딩 제어 영역(NCCR)의 분석을 가능한 이중 형광 리포터는 tdTomato 및 eGFP를 통해 바이러스 유전자 발현에 대한 잠재적항바이러스 약물의 영향을 정량화하기 위해 구축되었다. 식. 또한, 본 프로토콜에서 면역손상신장 이식 환자의 혈액 유래 DNA로부터 예시적으로 수득된 BKPyV-NCCR 앰플리칸을 복제함으로써, NCCR 재배열이 바이러스 성 유전자 발현에 미치는 영향을 결정할 수 있다. 환자 유래 앰플리톤의 클로닝에 이어, HEK293T 세포를 리포터 플라스미드로 형질전환시키고, 잠재적인 항바이러스제로 치료하였다. 이어서, 세포는 평균 형광 강도 72시간 후 형질감염을 측정하기 위한 FACS 분석을 실시하였다. 또한 잠재적인 세포 주기 억제 효과가 있는 약물의 분석을 테스트하기 위해 형질감염 및 따라서 형광 세포만 사용됩니다. 이러한 분석이 큰 T 항원 발현 세포에서 수행되기 때문에, 조기 및 후기 발현의 영향은 상호 독립적인 방식으로 분석될 수 있다.

본 대표적인 실험에서, BK-폴리오마바이러스 비코딩 제어 영역 구동 전사 활성은 유세포측정을 통해 측정하였다. 또한, BKPyV 재활성화 후 환자를 치료하는데 사용될 수 있는 mTOR 억제제는 바이러스 성 초기 유전자 발현의 억제를 위해 시험되었다. 이를 위해, 이중 형광-리포터 분석이 이전에 출판된바와 같이 사용되었다 5. 실험 설정의 전체 워크플로 우표 방식은 Figure1에 설명되어 있습니다. 첫째, 면역손상신장이식환자로부터의 혈액샘플을 기관윤리위원회의 승인을 받아 인간연구의 가이드라인에 따라 채취하였다. 혈액을 EDTA 함유 튜브에서 수집하고 위상을 원심분리에 의해 분리시켰다. 이어서, 400 μL의 혈장이 폴리오마바이러스 DNA의 분리를 위해 사용되었다. 비코딩 제어 영역(NCCR)은 외부 프라이머 쌍 BKV-CR-1fw 및 BKV-CR-1rv를 사용하여 <s...

이 원고에서, 프로토콜은 tdTomato 및 eGFP를 발현하는 양방향 리포터 플라스미드로 형질감염된 HEK293T 세포를 이용하여 BK-폴리오마바이러스 전사 활성의 FACS 기반 측정을 수행하기 위해 제시된다. 이 방법은 바이러스 전사에 대한 신규 화합물의 영향을 정량적으로 결정할 수 있게 한다.

유세포측정을 통한 BK-폴리오마바이러스 비코딩 제어 영역 구동 전사 활성 측정

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 유동 세포형을 통해 이중 형광 세포를 측정하여 BK-polyomavirus 비코딩 제어 영역 구동 전사 활성을 측정하는 것입니다. BK-polyomavirus는 면역 손상한 환자에 있는 가혹한 병리를 일으키는 원인이 될 수 있습니다, 특히 신장 이식 수신자에서. 그러나, 매우 효과적인 바이러스 백신은 현재 사용할 수 없기 때문에, 다른 화합물의 잠재적인 항 바이러스 영향을 측정 하는 방법이 필요.이 방법을 통해 바이러스 학자들은 비코딩 제어 영역에 의해 구동되는 BK-polyomavirus 전사 활동에 영향을 미치는 잠재적 인 항 바이러스 제의 영향을 분석 할 수 있습니다. 이 분석법은 또한 전형적인 비코딩 제어 영역에 비해 프로모터 활동에 대한 재배열의 영향을 연구할 수 있게 한다. 이중 형광 보고서와 함께 바이러스 프로모터 활성을 연구하는 장점은 조기 및 후기 유전자 발현을 상호 독립적으로 분석할 수 있다는 점입니다.더욱이, 바이러스증및 장기전성세포 배양실험의 어려운 천공은 전염및 형광세포만 분석되기 때문에 필요하지 않으며, 세포 생존력과 천공을 감소시키는 약물도 연구할 수 있다. 이 프로토콜은 뒤스부르크 에센 대학의 의학 교수의 윤리위원회에 의해 승인된 인간 연구의 지침을 따릅니다. 첫 번째 단계는 다종 바이러스 DNA의 격리를 위한 혈액 샘플을 수집하는 것입니다.EDTA 획득 튜브에서 적어도 3 밀리리터의 혈액을 수집합니다. 샘플을 2, 500 G에서 15분 동안 원심분리하고 플라즈마를 새로운 튜브로 피펫합니다. 단백질 SK 40마이크로리터를 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 준비하고 파이펫팅을 통해 400마이크로리터 플라즈마를 추가합니다.제조업체의 지침에 설명된 대로 DNA 얼룩 추출 키트를 사용하여 DNA를 분리합니다. 프라이머 쌍 A를 사용하여 사전 PCR에 대한 마스터 믹스를 총 50 마이크로리터로 준비하고 이전에 격리된 DNA를 사용합니다. 마스터 믹스의 45 마이크로리터를 PCR 튜브에 분배합니다.PCR 튜브에 격리 된 DNA의 5 마이크로 리터를 추가하고 표 3에 도시 된 바와 같이 반응 조건으로 PCR을 실행합니다. 35사이클에서 반복 적인 변성 어닐링 및 확장을 반복합니다. 중첩 된 응용 프로그램의 경우 복제에 대한 제한 사이트를 수용 하는 프라이머 쌍 B를 사용합니다.PCR 제품의 마이크로리터 10개를 6배 젤 로딩 염료 2개의 마이크로리터와 혼합합니다. 1.5% 아가로즈 젤에 믹스 10 마이크로리터를 적재하고 60 밀리암페어에서 30분 동안 젤을 실행합니다. 적절한 UV 문서화 시스템을 사용하여 젤을 시각화합니다.제조업체의 지침에 따라 PCR 정화 키트를 사용하여 PCR 앰플리턴을 정화합니다. 섭씨 37도에서 2시간 동안 지표 제한 효소로 정제된 앰플리턴을 소화합니다. 소화된 앰플리턴을 정화하기 위해 정화 단계를 반복합니다.동시에 플라스미드 백본을 소화합니다. 소화된 플라스미드 백본을 0.8% 낮은 마운트 아가로즈 젤로 분석합니다. 40 밀리암페어보다 높은 전류에서 젤을 실행하지 마십시오.긴 파도 UV 빛을 사용하여 DNA 조각을 시각화하고 깨끗한 메스를 사용하여 구부러진 백본을 잘라냅니다. DNA 손상을 방지하기 위해 긴 UV 노출 시간을 피하십시오. 새로운 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리튜브로 플로멜 젤 조각 조각에 대한 울타리.낮은 모드 아가로즈 조각을 함유한 백본을 섭씨 65도에서 10분간 가열하여 젤 조각을 녹이고 2분마다 부드러운 소용돌이로 섞습니다. 용융 젤은 결찰에 직접 사용할 수 있습니다. Ligate 백본과 T4 DNA 리개아제를 사용하여 소화된 앰플리코가 섭씨 16도에서 하룻밤 을 지니게 합니다.표준 복제 절차 후 플라즈마 DNA를 분리합니다. 제한 효소 소화를 수행하여 양성 클론을 확인하고 1% 아가로즈 젤에서 소화된 조각을 시각화합니다. 종자 100, 000 HEK293T 세포는 12웰 플레이트 의 웰 당 24시간 전 과배및 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하고, 형질 전환 시 활성 증식을 유지한다.세포는 경질에서 대략 80%의 합류에 있어야 합니다. 멸균 튜브에 감소 된 혈청 매체250 마이크로 리터를 넣고 보고된 각 플라즈마 DNA의 마이크로그램을 추가하고 파이펫팅으로 부드럽게 섞습니다. DNA 혼합물에 3개의 마이크로리터를 추가하고 피펫팅하여 부드럽게 섞어 섭씨 22도에서 15분 동안 배양합니다.혼합물을 넣고 우물에 드롭와이즈를 넣고 웰에 부드럽게 분배합니다. 4시간 후, 상체를 테스트 에이전트 및 용매 제어를 포함하는 신선한 매체로 교체하십시오. 이 예에서, mTOR 억제제 INK-128 및 라파마이신이 사용되었다.분석전까지 섭씨 37도에서 배양합니다. 형광 현미경의 밑에 적색과 녹색 형광을 위한 세포를 검사합니다. 적색 및 녹색 형광은 각각 초기 및 후기 BK-폴리오메 바이러스 유전자 발현에 대응한다.72 시간 후 트랜스포션, 신중하게 상체를 갈망. 차가운 PBS의 1 밀리리터로 세포를 두 번 씻으시면 됩니다. 부드럽게 500 마이크로 리터 트립신을 추가하고 세포의 조기 분리를 피하기 위해 약간 접시를 켭니다.이 단계는 셀 더블을 방지하는 것이 중요합니다. 또한 트립신은 동일한 파이펫 팁으로 직접 제거됩니다. 섭씨 37도에서 적어도 5분 동안 세포를 배양한다.트립신 S 세포를 3%FCS를 함유한 1밀리리터 PBS로 다시 중단하고 사전 표지된 FACS 튜브에서 서스펜션을 전송합니다. FACS 분석 전에 밀리리터당 1마이크로그램의 농도에 DAPI를 추가합니다. 유동 세포계를 사용하여 세포를 분석합니다.각 샘플에 대해, 적어도 10, 000 살아있는 세포를 측정합니다. 정확한 결과를 얻기 위해서는 빨간색 및 녹색 신호를 구별하는 데 초기 보상이 필수적입니다. 비코딩 제어 리젠트는 복제에 대한 제한 부위를 수용하는 내부 프라이머 쌍을 사용하여 중첩된 PCR 프로토콜을 사용하여 증폭되었다.앰플리콘 검증은 아가로즈 겔 전기전도를 통해 수행되었지만 겔내 균질 크기 분포에서 전형적인 NCCR 서열에서 유래된 앰플리콘은 삽입 및 삭제를 가진 재배열된 NCC에서 유래한 앰플리콘이 크기가 달랐다. NCCR을 포함하는 양수 클론의 선택은 제한 분석에 의해 확인되었다. 작은 스페이서 영역은 양수 클론을 나타내는 더 큰 NCCR 조각으로 대체되었습니다.검증된 클론으로부터 분리된 플라스미드 DNA가 피로세퀀싱을 위해 보내졌다. 이 예에서는, P 블록내의 삭제 및 O-블록의 대체가 검출되었다. HEK293T 세포는 보고 가능한 구조에 대한 존중으로 과도하게 전염되었고 NCCR 활성은 형광 현미경 검사법에 의해 모니터링되었다.적색 및 녹색 형광은 각각 초기 및 후기 BK-폴리오메 바이러스 유전자 발현에 대응했다. 제1 NCCR은 강한 후기 유전자 발현을 보였고 두 번째 예는 비교적 강하지만 중간 정도의 후기 유전자 발현을 보였다. DAPI 네거티브 셀이 게이트되고 tdTomato 대 eGFP를 보여주는 점 플롯이 만들어졌습니다.tdTomato 또는 eGFP에 대한 긍정적뿐만 아니라 부정적인 샘플은 분석에만 포함되었습니다. 평균 형광 강도는 각 테스트 클론에서 파생되었다. 이 예에서, 이중 mTOR 억제제 INK128을 통한 치료는 tdTomato MFI를 현저히 감소시켰으며 이는 조기 발현이 억제되었다는 것을 의미한다.이 방법을 사용하면 전사 활성을 통해 BK-polyomavirus를 검출하기 위해 현재 사용되고 있는 다른 화합물을 식별할 수 있습니다. 초기 유전자 발현에서, 이것은 확실히 바이러스성 연루를 결정합니다. 억제 방울은 BK-polyomavirus 재활성화의 경우 면역 손상된 환자를 위한 에이전트로서 사용되는 것으로 간주될 수 있다.

measurement-bk-polyomavirus-non-coding-control-region-driven

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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바이러스 감염의 항체 의존성 증진을 조사하기 위한 In vitro assay

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