Name: 까다로운 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위한 시간 효율적인 도구로서 박테리아 세포의 공동 발현과 결합된 풀다운 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 배우세요 박테리아 세포에서 단백질 공동 발현과 풀다운 분석을 결합한 방법으로, Escherichia coli BL21(DE3)에서 이형 이량체 형성을 효율적으로 연구할 수 있습니다. 이 기법은 단백질 상호작용을 신속하게 테스트하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 러시아 과학 재단 프로젝트 19-74-30026 (방법 개발 및 검증) 및 19-74-10099 (단백질-단백질 상호 작용 분석)의 지원을 받았습니다. 러시아 연방 과학 고등 교육부 보조금 075-15-2019-1661 (대표적인 단백질-단백질 상호 작용 분석).

Method Workflow의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 대장균의 공동 형질전환
<ol><li>표준 클로닝 방법을 사용하여 표적 단백질에 대한 발현 벡터를 준비합니다. 참고: 일반적으로 좋은 출발점은 GST/MBP 태그 단백질의 발현을 위해 암피실린 내성 유전자 및 ColE1 기원을 갖는 기존의 pGEX/pMAL 벡터와 p15A 또는 RSF 기원 및 카나마이신 내성을 갖는 호환 가능한 벡터를 사용하여 6xHis 태그 단백질을 발현하는 것이며, 경우에 따라 용해도를 증가시키기 위해 티오레독신 또는 SUMO-태그와 결합합니다. 일반적으로 실험 전에 여러 태그 조합을 테스트해야 합니다. 설명된 방법 자체는 표적 단백질의 발현 조건을 일괄 테스트하는 데 편리합니다. 대부분의 로제타 균주는 희귀 코돈에 대한 tRNA를 발현하기 위한 p15A 기원을 가진 플라스미드를 이미 함유하고 있으므로, 이러한 균주를 사용하는 것이 가능한 옵션인 경우, p15A 플라스미드는 피해야 한다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.<ol><li>37°C의 Luria-Bertani(LB) 배지에서 적절한 균주의 박테리아를 0.1-0.2의 광학 밀도(OD)로 성장시킵니다. BL21(DE3) 균주를 본 연구의 예로 사용하였다. 참고: 두 벡터로 효율적인 공동 형질을 달성하기 위해 새로 준비된 유능한 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 두 개 이상의 벡터를 공동 변환해야 하는 경우 순차적으로 변환하는 것이 좋은 변환 효율성을 달성하는 것이 좋습니다. Electroporation은 좋은 대안입니다.</li>
		<li>박테리아 현탁액 중 1.0 mL를 4°C에서 9,000 x g 에서 1분 동안 원심분리하고, 상청액을 버린다.</li>
		<li>0.5mL의 빙냉 완충액 형질전환 완충액(TB)(10mM MOPS[pH 6.7], 250mM KCl, 55mMMnCl2 및 15mMCaCl2)을 추가하고 얼음 상에서 10분 동안 인큐베이션합니다.</li>
		<li>4°C에서 8,000 x g 에서 30초 동안 원심분리하고, 상층액을 버린다.</li>
		<li>TB 버퍼 100μL를 추가하고 각 벡터 100ng을 추가한 후 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 단일 벡터를 개별적으로 변환하여 공동 발현 없이 단백질 거동을 연구합니다. 또한 비특이적 바인딩 제어를 위해 빈 공동 발현 벡터와 쌍을 이루는 발현 벡터를 공동 변환합니다. 참고: 이 연구에서 제공된 예에서, GST/MBP cDNA에 융합된 상응하는 cDNA를 갖는 pGEX/pMAL 벡터는 티오레독신 cDNA에 융합된 파트너 단백질 도메인을 인코딩하는 cDNA를 함유하는 호환 가능한 pACYC 유래 벡터와 함께 사용되었다.</li>
		<li>42°C에서 150초 동안 가열한 다음 얼음에서 1분 동안 식힙니다.</li>
		<li>항생제 없이 액체 LB 배지 1mL를 넣고 37°C에서 90분 동안 배양합니다. 0.5% 포도당과 해당 항생제(일반적인 농도는 50mg/L 암피실린, 20mg/L 카나마이신, 50mg/L 스트렙토마이신, 35mg/L 클로람페니콜)를 함유한 LB-한천 플레이트의 플레이트. 플레이트를 37°C에서 밤새 인큐베이션한다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 표현
<ol><li>2mL의 액체 LB 배지를 사용하여 플레이트에서 세포를 해당 항생제가 있는 50mL의 LB 배지로 플러시합니다(일반적인 농도는 50mg/L 암피실린, 20mg/L 카나마이신, 50mg/L 스트렙토마이신, 35mg/L 클로람페니콜). 금속 이온 또는 다른 공지된 보조인자를 첨가한다(본 연구에서 제공된 실시예에서, 0.2 mM ZnCl2가 매질에 첨가되었다). 실험의 후속 반복을 위해 -70°C에서 20% 글리세롤이 포함된 분취액을 보관합니다. 참고: 두 플라스미드 사이의 간헐적인 재조합 사건으로 인해 분리된 단일 클론에서 불량 발현 가능성을 배제하기 위해 플레이트에서 직접 여러 콜로니를 플러시하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>37°C에서 220rpm의 일정한 회전으로 세포를 0.5-0.7의 OD로 성장시키고, 실온(RT)으로 냉각하고, 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 1mM에 첨가합니다. 20 μL의 분취액을 비유도 샘플의 대조군으로 보관한다.</li>
	<li>세포를 하룻밤 동안 18°C에서 220rpm의 일정한 회전으로 배양합니다. 참고: 최적의 배양 시간과 온도는 다를 수 있습니다. 하룻밤 동안 18°C는 대부분의 단백질에 가장 효과적이며 기본적으로 시도하는 것이 좋습니다. 강한 비특이적 결합이 관찰되는 경우 배양 시간을 2-3 시간으로 줄이십시오.</li>
	<li>박테리아 현탁액을 두 부분으로 나누고(또는 두 개 이상의 다른 태그를 사용한 경우 그 이상) 단백질 발현을 확인하기 위해 세포 현탁액의 20μL 분취량을 보관합니다. 4,000 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다. 알림: 일시 중지 지점: 박테리아 펠릿은 -70 °C에서 최소 6개월 동안 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 풀다운 분석
참고: 자세한 절차는 6xHis 또는 MBP/GST로 태그된 단백질에 대해 설명되어 있습니다. 모든 절차는 4°C에서 수행됩니다.
<ol><li>실험 직전에 첨가된 프로테아제 억제제 및 환원제(아래 참조)가 있는 얼음처럼 차가운 용해 완충액 1mL에 박테리아 펠릿을 재현탁합니다. 디티오트레이톨(DTT)은 금속 이온을 제거하므로 금속 킬레이트 수지를 사용할 때 피하십시오. 테스트된 단백질에 대한 완충액 조성을 조정합니다. 대부분의 단백질에 적합한 용해 완충액의 일반적인 레시피는 다음과 같습니다.<ol><li>6xHis-pulldown: 30mM HEPES(pH 7.5), 400mM NaCl, 10mM 이미다졸, 0.1% NP40, 10%[w/w] 글리세롤, 5mM 베타-메르캅토에탄올, 1mM 페닐메틸스풀포닐플루오라이드(PMSF) 및 프로테아제 억제제 칵테일의 1:1,000 희석( 재료 표 참조).</li>
		<li>GST- 또는 MBP-풀다운: 20 mM 트리스 (25 °C에서 pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0.1 mMZnCl2, 0.1% NP40, 10% [w/w] 글리세롤, 5 mM DTT, 1 mM PMSF 및 프로테아제 억제제 칵테일의 1:1,000 희석을 혼합한다(재료 표 참조).</li>
	</ol></li>
	<li>얼음에 초음파 처리하여 세포를 파괴하십시오. 전기영동을 위해 20 μl 분취량을 보관한다. 알림: 일반적으로 20W 출력 전력으로 5초 간격으로 5초의 25-20펄스가 필요합니다.amp르. 과열을 방지하고 전체 세포 중단을 보장하기 위해 각 기기에 대해 적절한 초음파 처리 전력을 조정해야 합니다. 더 나은 성능을 얻으려면 고처리량 멀티 팁 초음파 처리기 프로브를 사용하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>20,000 x g 에서 30분 동안 원심분리기 후속 SDS-PAGE 분석을 위해 정제된 용해물 20μL를 수집합니다.</li>
	<li>수지(각 샘플당 50μL)를 1mL의 얼음처럼 차가운 용해 완충액으로 10분 동안 평형을 이루고 2,000 x g 에서 30초 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.</li>
	<li>세포 용해물(총 단백질 농도: 20-50mg/mL)을 수지에 넣고 15rpm의 일정한 회전으로 10분 동안 배양하고 2,000 x g 에서 30초 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. 후속 SDS-PAGE 분석을 위해 결합되지 않은 분획 20μL를 수집합니다.</li>
	<li>얼음처럼 차가운 세척 버퍼 1mL를 넣고 1분 동안 배양합니다. 2,000 x g 에서 30초 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 세척 버퍼의 일반적인 레시피는 다음과 같습니다.<ol><li>6xHis-pulldown: 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 30 mM 이미다졸, 0.1% NP40, 10% [w/w] 글리세롤 및 5 mM 베타-메르캅토에탄올을 혼합합니다.</li>
		<li>GST- 또는 MBP-풀다운: 20 mM 트리스 (25 °C에서 pH 7.5), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0.1 mM ZnCl2, 0.1 % NP40, 10 % [w / w] 글리세롤 및 5 mM DTT를 혼합하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>두 번의 긴 세척을 수행하십시오 : 1mL의 얼음 차가운 세척 버퍼를 추가하고, 15rpm의 일정한 회전으로 10-30 분 동안 배양하고, 2,000 x g 에서 30 초 동안 원심 분리하고, 상청액을 버립니다.</li>
	<li>1mL의 얼음 차가운 세척 완충액을 넣고 1분 동안 배양하고 2,000 x g 에서 30초 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.</li>
	<li>결합된 단백질을 50μL의 용출 완충액으로 1,200rpm의 진탕기에서 10분 동안 용출합니다. 용출 완충액의 일반적인 방법은 다음과 같습니다.<ol><li>6xHis-풀다운: 30mM HEPES(pH 7.5), 400mM NaCl, 300mM 이미다졸 및 5mM 베타-메르캅토에탄올을 혼합합니다.</li>
		<li>GST-풀다운: 20mM 트리스(25°C에서 pH 7.5), 150mM NaCl, 50mM 글루타티온(염기성 트리스로 pH 7.5로 조정) 및 5mM DTT.</li>
		<li>MBP-풀다운: 20 mM 트리스(25 °C에서 pH 7.5), 150 mM NaCl, 40 mM 말토오스 및 5 mM DTT를 혼합합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>용출된 단백질을 SDS-PAGE로 분석합니다. 참고: 아크릴아미드의 비율은 단백질의 크기에 맞게 조정해야 합니다. 본 연구에서 제공된 예에서, 180V의 정전압에서 트리스-글리신-SDS 완충액(2mM 트리스, 250mM 글리신, 0.1% SDS)에서 실행되는 12% 아크릴아미드 겔을 사용하였다. 겔은 0.2% 쿠마시 블루 R250, 10% 아세트산, 및 30% 이소프로판올에서 비등시킴으로써 염색하고, 10% 아세트산에서 비등시킴으로써 탈염색하였다. 로딩된 단백질의 양은 동일하지 않아야 하는데, 이는 다양한 양의 상호작용 단백질이 다른 실험에서 추출될 수 있기 때문입니다.</li>
</ol>

<ol><li>Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions%3A+Pulldown+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions: Pulldown assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).</li>
<li>Rose, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+dimerization%2C+coactivator+recognition+and+MODY3+mutations+in+HNF-1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).</li>
<li>Bonchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+diversity+and+homodimerization+specificity+of+zinc-finger-associated+domains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila.</a> Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).</li>
<li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112 (2), 193-205 (2003).</li>
<li>Badonyi, M., Marsh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+protein+complex+interfaces+have+evolved+to+promote+co-translational+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly.</a> Elife. 11, 79602(2022).</li>
<li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li>
<li>Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cotranslational+protein+maturation+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755(2021).</li>
<li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li>
<li>Shieh, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operon+structure+and+co-translational+subunit+association+direct+protein+assembly+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria.</a> Science. 350 (6261), 678-680 (2015).</li>
<li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), 57-64 (2021).</li>
<li>Bonchuk, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+highly+similar+spatial+organization+of+zinc-finger+associated+domains+with+a+very+low+sequence+similarity%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity.</a> Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).</li>
<li>Justin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+oncogenic+histone+H3K27M+inhibition+of+human+polycomb+repressive+complex+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2.</a> Nature Communications. 7, 11316(2016).</li>
<li>Lariviere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+mediator+head+module%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the mediator head module.</a> Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).</li>
<li>Taylor, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+T4+baseplate+and+its+function+in+triggering+sheath+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction.</a> Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).</li>
<li>Samara, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+assembly+and+function+of+the+SAGA+deubiquitinating+module%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module.</a> Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).</li>
<li>Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+assembly+and+activation+of+the+heterotetrameric+SAGA+histone+H2B+deubiquitinase+module%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module.</a> Cell. 141 (4), 606-617 (2010).</li>
<li>Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+ferritin%3A+modulation+of+subunit+stoichiometry+in+bacterial+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%22%5BJournal%5D)">Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems.</a> Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).</li>
<li>Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+replication+of+plasmid+p15A+and+comparative+studies+on+the+nucleotide+sequences+around+the+origin+of+related+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids.</a> Cell. 32 (1), 119-129 (1983).</li>
<li>Nijkamp, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+nucleotide+sequence+of+the+bacteriocinogenic+plasmid+CloDF13%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13.</a> Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).</li>
<li>Som, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+replication+of+Escherichia+coli+plasmid+RSF+1030%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+General+Genetics%22%5BJournal%5D)">Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030.</a> Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).</li>
<li>Tsao, K. L., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+production+of+two+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli+by+manipulating+plasmid+copy+number%3A+high-level+expression+of+heterodimeric+Ras+farnesyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+Purification%22%5BJournal%5D)">Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase.</a> Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).</li>
<li>Nallamsetty, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubility-enhancing+proteins+MBP+and+NusA+play+a+passive+role+in+the+folding+of+their+fusion+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+Purification%22%5BJournal%5D)">Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners.</a> Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).</li>
<li>Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+two-hybrid+assay+to+identify+interacting+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70(2019).</li>
<li>Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+two-hybrid+%28F2H%29+assay+for+direct+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).</li>
<li>Fiebitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mammalian+two-hybrid+screening+for+protein-protein+interactions+using+transfected+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays.</a> BMC Genomics. 9, 68(2008).</li>
<li>Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+and+Sgfl1+proteins+form+alternative+complexes+with+ENY2+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Doklady+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins.</a> Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).</li>
<li>Maksimenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+new+insulator+proteins%2C+Pita+and+ZIPIC%2C+target+CP190+to+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin.</a> Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).</li>
<li>Sabirov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+functional+role+of+the+interaction+between+CP190+and+the+architectural+protein+Pita+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster.</a> Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16(2021).</li>
<li>Dong, S., Provart, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+protein+interaction+networks+using+computational+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analyses of protein interaction networks using computational tools.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

설명된 방법을 사용하면 시험관 내에서 효율적으로 조립할 수 없고 공동 발현이 필요한 단백질-단백질 상호 작용을 테스트할 수 있습니다. 이 방법은 헤테로다이머화 단백질을 연구하는 데 적합한 몇 안 되는 접근법 중 하나이며, 이러한 단백질은 별도로 정제될 때 실험 동안 가장 자주 해리 및 재결합할 수 없는 안정적인 동종이량체를 형성하기 때문에 동종이량체화도 가능합니다 3,11.
설명된 방법의 워크플로우는 상호 작용하는 단백질의 개별 정제 및 후속 배양에 대한 시간 소모적인 단계가 없기 때문에 기존 풀다운에 비해 시간 효율성이 더 높습니다. 또 다른 장점은 단백질이 단백질 분해 및 산화에 노출되는 동안 인공 체외 환경 내에 존재하는 훨씬 더 적은 수의 단계와 더 짧은 기간으로 인해 더 높은 재현성입니다. 이 방법은 다른 시험관 내 기...

기존의 풀다운은 단백질-단백질 상호작용을 연구하는 데 널리 사용된다1. 그러나, 정제된 단백질은 종종 시험관 내에서 효과적으로 상호작용하지 않으며2,3, 이들 중 일부는 그들의 결합 파트너 없이는 불용성이다 4,5. 이러한 단백질은 공동 번역 조립 또는 분자 샤페론 5,6,7,8,9의 존재를 필요로 할 수 있습니다. 종래의 풀다운의 또 다른 한계는 많은 도메인이 배양 시간 동안 시험관 내에서 해리 및 재결합할 수 없기 때문에, 이들 중 다수가 동시번역적으로 조립된 안정한 호모올리고머로서 존재할 수 있는 도메인 간의 가능한 헤테로멀티머화 활성을 시험하는 것이다 8,10. 동시발현은 이러한 문제를 극복하는데 유용한 것으로 밝혀졌다 3,11. 박테리아에서 호환 가능한 벡터를 사용한 공동 발현은 폴리콤 억제 복합체 PRC212, RNA 중합효소 II 중재자 헤드 모듈13, 박테리오파지 T4 베이스플레이트 14, SAGA 복합체 데비퀴티닐라제 모듈 15,16 및 페리틴 17을 포함하는 대형 다중 서브유닛 거대분자 복합체를 정제하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 공동-발현에 통상적으로 사용되는 복제 기원은 ColE1, p15A18, CloDF1319 및 RSF20이다. 상업적으로 이용 가능한 Duet 발현 시스템에서, 이들 기원은 상이한 항생제 내성 유전자 및 편리한 다중 클로닝 부위와 결합되어 폴리시스트로닉 벡터를 생성하여, 최대 8개의 단백질의 발현을 허용한다. 이들 기원은 상이한 복제 수를 가지며, 표적 단백질의 균형 잡힌 발현 수준을 달성하기 위해 다양한 조합으로 사용될 수 있다21. 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위해 다양한 친화성 태그가 사용됩니다. 가장 흔한 것은 6x히스티딘, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 및 맥아당 결합 단백질(MBP)이며, 각각은 해당 수지에 특이적인 친화력을 가지고 있습니다. GST와 MBP는 또한 태그가 부착된 단백질의 용해도와 안정성을 향상시킨다22.
진핵 세포에서 단백질 공동 발현과 관련된 여러 방법도 개발되었으며, 그 중 가장 두드러진 것은 효모 2-하이브리드 분석(Y2H)23입니다. Y2H 분석은 저렴하고 쉬우며 여러 상호 작용을 테스트할 수 있습니다. 그러나 워크플로를 완료하는 데 1주일 이상 걸립니다. 또한 형광 2-하이브리드 분석(F2H)24 및 세포 어레이 단백질-단백질 상호작용 분석(CAPPIA)25과 같이 덜 자주 사용되는 포유류 세포 기반 분석법도 있습니다. F2H 분석은 비교적 빠르기 때문에 본래의 세포 환경에서 단백질 상호작용을 관찰할 수 있지만 고가의 이미징 장비를 사용해야 합니다. 이들 모든 방법은 천연 진핵생물 번역 및 접힘 환경을 제공하는 원핵생물 발현에 비해 이점을 갖는다; 그러나 그들은 전사 활성화 또는 형광 에너지 전달에 의해 간접적으로 상호 작용을 감지하며, 이는 종종 인공물을 생성합니다. 또한, 진핵 세포는 관심 단백질의 다른 상호작용 파트너를 포함할 수 있으며, 이는 고등 진핵생물의 단백질 간의 이진 상호작용 테스트를 방해할 수 있습니다.
본 연구는 기존의 풀다운 기술에 이어 차등적으로 태그된 단백질의 박테리아 공동 발현 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 공동 발현이 필요한 표적 단백질 간의 상호 작용을 연구 할 수 있습니다. 기존 풀다운에 비해 시간 효율성이 높아 여러 대상의 배치 테스트가 가능하므로 대부분의 경우 유리합니다. 호환 가능한 벡터를 사용한 공동-발현은 힘든 클로닝 단계를 필요로 하지 않기 때문에 폴리시스트로닉 공동-발현보다 더 편리하다.

<table><tbody><tr><td>8-ELEMENT 프로브</td><td>Sonics</td><td>630-0586</td><td>고처리량 8-ELEMENT Sonicator 프로브</td></tr><tr><td>Agar</td><td>AppliChem</td><td>A0949</td><td></td></tr><tr><td>Amylose resin</td><td>New England Biolabs</td><td>E8021</td><td>Resin for Resin for Purification of MBP-tagged proteins</td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>AppliChem</td><td>A4789 (kanamycin); A0839 (암피실린)</td><td></td></tr><tr><td>베타-메르캅토에탄올</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)&nbsp;</td><td>Novagen</td><td>69450-M</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>AppliChem</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5415R (Z605212)</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione</td><td>AppliChem</td><td>A9782</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione agarose</td><td>Pierce</td><td>16100</td><td>GST 태그 단백질 정제용 수지</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>A2926</td><td></td></tr><tr><td>헤페스&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>HisPur Ni-NTA Superflow Agarose</td><td>Thermo Scientific</td><td>25214</td><td>6xHis-tagged 단백질 정제용 수지</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>AppliChem</td><td>A1378</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A4773</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>AppliChem</td><td>A2939</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>AppliChem</td><td>414753</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>AppliChem</td><td>A3891</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>AppliChem</td><td>A2947</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AppliChem</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Roche</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>pACYCDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71147</td><td>p15A 복제 기원</td></tr><tr><td>pCDFDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71340</td> <td>단백질의 동시 발현을 위한 벡터CloDF13 복제 기원과 단백질의 동시 발현을 위한 벡터</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>AppliChem</td><td>A0999</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 VII</td><td>Calbiochem</td><td>539138</td><td>프로테아제 억제제 칵테일</td></tr><tr><td>pRSFDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71341</td><td>RSF 복제 기원을 가진 단백질의 동시 발현을 위한 벡터</td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>트리스&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A2264</td><td></td></tr><tr><td>VC505 초음파 처리기</td><td>Sonics</td><td>CV334</td><td>초음파 액체 프로세서</td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>AppliChem</td><td>A6285</td><td></td></tr></tbody></table>

까다로운 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위한 시간 효율적인 도구로서 박테리아 세포의 공동 발현과 결합된 풀다운 분석

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

풀다운은 쉽고 널리 사용되는 단백질-단백질 상호작용 분석법입니다. 그러나 시험관 내에서 효과적으로 조립되지 않는 단백질 복합체를 연구하는 데는 한계가 있습니다. 이러한 복합체는 공동 번역 조립 및 분자 샤페론의 존재를 필요로 할 수 있습니다. 이들은 시험관 내에서 해리 및 재결합할 수 없는 안정한 올리고머를 형성하거나 결합 파트너 없이는 불안정합니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 종래의 풀다운 기술에 이어 일련의 호환 벡터를 사용하여 차등적으로 태깅된 단백질의 박테리아 동시 발현에 기초한 방법을 사용할 수 있다. 워크플로우는 상호 작용하는 단백질의 개별 정제 및 후속 배양에 대한 시간 소모적인 단계가 없기 때문에 기존 풀다운에 비해 시간 효율성이 더 높습니다. 또 다른 장점은 훨씬 더 적은 수의 단계와 시험관 내 환경 내에 존재하는 단백질이 단백질 분해 및 산화에 노출되는 더 짧은 기간으로 인해 더 높은 재현성입니다. 이 방법은 다른 시험관 내 기술이 부적합한 것으로 판명되었을 때 여러 단백질-단백질 상호 작용을 연구하는 데 성공적으로 적용되었습니다. 이 방법은 단백질-단백질 상호작용을 일괄 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 대표적인 결과는 BTB 도메인과 본질적으로 무질서한 단백질 사이의 상호작용 및 징크-핑거 관련 도메인의 이종이량체에 대한 연구에 대해 표시됩니다.

설명된 방법은 많은 다른 대상과 함께 일상적으로 사용되었습니다. 여기에 제시된 것은 기존의 풀다운 기술로는 얻을 수 없는 몇 가지 대표적인 결과입니다. 첫 번째는 특정 ZAD(Zinc-finger-associated domain) 이량체화에 대한 연구이다11. ZAD는 안정적이고 특이적인 이량체를 형성하며, 이종이량체는 paralogous 그룹 내에서 밀접하게 관련된 도메인 사이에서만 가능합니다. 이 도메인에 의해 형성된 이량체는 안정적이며 적어도 며칠 동안 해리되지 않습니다. 따라서, 정제된 ZAD를 혼합하는 것은 어떠한 검출가능한 결합도 생성하지 않는다. 동시에, MBP와 티오레독신-6xHis-융합된 ZAD의 공동 발현은 MBP-풀다운 분석의 SDS-PAGE 결과에서 추가 밴드로 나타나는 양호하고 재현 가능한 호모-이량체화 활성을 보여줍니다(그림 2A). 헤테로다이머의 작은 부분은 다른 도메인과 함께 발현되는 M1BP와 함께 볼 ...

여기에서는 일련의 호환 가능한 벡터를 사용하여 차등적으로 태그된 단백질의 박테리아 공동 발현 방법을 설명한 다음 시험관 내에서 조립할 수 없는 단백질 복합체를 연구하기 위한 기존의 풀다운 기술을 설명합니다.

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

이 방법을 사용하면 헤테로다이머 형성과 같은 효율적인 테스트 샘플을 위해 공동 발현이 필요한 단백질 복합체의 형성을 연구할 수 있습니다. 이 방법의 주요 잠재력은 호환 가능한 벡터의 조합을 사용하여 차등적으로 태그가 지정된 연구 단백질의 공동 발현을 활용하여 효율적인 복잡한 조립을 촉진하고 시간 효율적인 워크플로 및 확장성을 통해 여러 상호 작용의 신속한 패치 테스트를 가능하게 하는 것입니다. 이 방법은 최적의 단백질 발현 및 정제 조건의 신속한 스크리닝에도 사용할 수 있습니다.시각적 데모는 co-expression 설정, 세포 중단 및 후속 풀다운 단계와 같은 프로토콜의 중요한 단계를 올바르게 수행하는 데 도움이 됩니다. 시작하려면 섭씨 37도의 Luria-Bertani 또는 LB 배지에서 대장균 BL21(DE3) 균주를 0.1에서 0.2의 광학 밀도(OD)로 성장시킵니다. 박테리아 현탁액 1 밀리리터를 섭씨 4도에서 9, 000 G에서 1 분 동안 원심 분리하고 상청액을 버린다.그런 다음 0.5 밀리리터의 얼음 차가운 변환 완충액 (TB)을 넣고 얼음에서 10 분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 섭씨 4도에서 8, 000 G에서 30 초 동안 원심 분리하고 상청액을 버린다. 그런 다음 TB 버퍼 100마이크로리터, 각 벡터 100나노그램을 추가하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다.섭씨 42도에서 150초 동안 가열한 다음 얼음에서 1분 동안 식힙니다. 다음으로, 항생제가없는 LB 배지 1 밀리리터를 넣고 섭씨 37도에서 90 분 동안 배양합니다. 배양 후, 0.5% 포도당 및 해당 항생제를 함유하는 LB 한천 플레이트에 현탁액을 도금하기 전에 100마이크로리터의 LB 배지에 펠릿을 원심분리하고 재현탁합니다.접시를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음날, 2 밀리리터의 LB 배지로 플레이트에서 세포를 해당 항생제와 함께 50 밀리리터의 LB 배지로 플러시합니다. 후속 실험을 위해 섭씨 영하 70도에서 20% 글리세롤이 포함된 분취량을 저장하기 전에 금속 이온 또는 기타 알려진 보조 인자를 추가합니다.섭씨 37도에서 220RPM의 일정한 회전으로 세포를 0.5에서 0.7의 OD로 성장시킵니다. 배양액을 실온으로 냉각하고 IPTG를 1 밀리몰의 최종 농도로 첨가한다. 유도되지 않은 샘플의 대조군으로서 세포 현탁액의 20 마이크로리터 분취액을 저장한다.섭씨 18도에서 220RPM으로 하룻밤 동안 세포를 배양합니다. 다음날, 박테리아 현탁액을 두 부분으로 나누고 단백질 발현을 확인하기 위해 20 마이크로 리터 분취량을 저장합니다. 나머지 세포 현탁액을 4, 000 G에서 15 분 동안 원심 분리한다.풀다운 분석을 위해, 실험 직전에 프로테아제 억제제 및 환원제가 첨가된 1밀리리터의 얼음-차가운 용해 완충액에 펠릿을 재현탁시킨다. 테스트된 단백질에 대한 완충액 조성을 조정합니다. 얼음 위에서 초음파 처리하여 세포를 파괴하고 전기 영동을 위해 20 마이크로 리터 분취량을 저장합니다.16, 000 G에서 30 분 동안 원심 분리하고 전기 영동을 위해 정화 된 용해물 20 마이크로 리터를 수집한다. 수지를 1 밀리리터의 얼음 차가운 용해 완충액으로 10 분 동안 평형시킨 다음 2, 000 G에서 30 초 동안 원심 분리하고 상청액을 버린다. 세포 용해물을 수지에 첨가하고 15RPM의 일정한 회전으로 10분 동안 배양합니다.이어서, 분석을 위해 결합되지 않은 분획 20 마이크로리터를 수집하기 전에 원심분리하고 상청액을 버린다. 다음으로, 1 밀리리터의 얼음처럼 차가운 세척 완충액을 넣고 1 분 동안 배양합니다. 다시, 원심분리하고 상층액을 버린다.그런 다음 얼음처럼 차가운 세척 버퍼로 두 번 길게 세척합니다. 2차 세척 후, 결합된 단백질을 50 마이크로리터의 용출 완충액으로 1, 200 RPM의 진탕기에서 섭씨 4도에서 10분 동안 용출시킨다. 용출된 단백질을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석합니다.징크 핑거 관련 도메인(ZAD), 맥아당 결합 단백질의 호모 이량체화(MBP) 및 6xHistidine 풀다운 분석에 대한 연구가 여기에 나와 있습니다. MBP와 티오레독신 6x히스티딘 융합 ZAD의 공동 발현은 MBP 풀다운 분석의 SDS-PAGE 결과에서 추가 밴드로 나타나는 우수하고 재현 가능한 동종이량체화 활성을 보여줍니다. 대안적인 복합체 형성을 연구하기 위해 이 방법을 사용하는 또 다른 예가 여기에 나와 있습니다.동시 발현 분석에서, 6x히스티딘 태깅된 ENY2는 GST-태깅된 Sgf11 및 MBP-CTCF 둘 다와 상호작용했지만, MBP 풀다운에는 GST-Sgf11이 존재하지 않았고 그 반대의 경우도 마찬가지였다. 동시 발현과 결합된 풀다운과 비교하여 기존 풀다운 분석의 워크플로우에서 필요한 시간 간격의 단계별 비교가 여기에 나와 있습니다. CP190 단백질의 BTB 도메인과 초파리 CTCF 단백질의 GST 태그 C-말단 도메인 사이의 동일한 상호작용을 연구하기 위해 두 기술을 모두 활용한 결과가 여기에 나와 있습니다.친화도 및 용해도 테스트, 티오레독신, GST 또는 MBP의 올바른 선택은 분석의 효율적인 실행에 매우 중요합니다. 또 다른 중요한 단계는 빠르고 균일한 세포 파괴입니다. 다중 팁 초음파 처리기 프로브를 사용하는 것이 좋습니다.이 방법을 사용하면 기존의 풀다운 분석에서 정제된 단백질의 배양 중에 분리되지 않는 동종이량체를 형성하는 단백질 도메인 간의 이종이량체 형성을 직접 연구할 수 있습니다.

pulldown-assay-coupled-with-co-expression-bacteria-cells-as-time

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

시험 단백질 - 단백질 상호 작용이 단백질 기능의 해부를 위해 불가결이다. 여기서는...

단백질 막 중첩 분석 : 가용성식이 및 불용성 단백질 간의 상호 작용을 테스트하는 프로토콜 체외에서</em

이 비디오에서는 증폭된 발광 근접 균질 분석(bead-based proximity assay)을 시연합니다. 이 제품은 균일한 크기의 수용체 및 공여체 비드를 사용하며, 단백질 상호 작용을 억제하는 잠재적인 소분자를 스크리닝하기 위해 상호 작용하는 경향이 있는 두 개의 단백질로 고정되어 있습니다.

Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay: 단백질-단백질 상호작용을 억제하는 소분자를 스크리닝하기 위한 비드 기반 근접 Assay입니다.

이 비디오는 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위해 진핵 세포에서 단백질 복합체를 정제하는 기술인 탠덤 친화성 정제를 보여줍니다. 이 복합체에는 서로 다른 항원결정기 태그로 표지된 두 개의 단백질이 포함되어 있습니다. 두 개의 서로 다른 태그에 대한 친화력을 가진 두 개의 수지를 순차적으로 사용하여 복합체를 정제할 때, 용리액에 두 단백질이 모두 존재하면 둘 사이의 상호 작용을 확인할 수 있습니다.

단백질-단백질 상호작용을 연구하기 위한 Tandem Affinity Purification Assay

이 기사는 관심 단백질과 E. coli의 다른 인자 간의 상호 작용을 모니터링하기 위해 부위 특이적 광교차결합과 함께 펄스 추적 무선 라벨링을 사용하는 방법을 설명합니다. 기존의 화학적 가교 방법과 달리 이 접근 방식은 살아있는 세포에서 정렬된 조립 경로의 고해상도 "스냅샷"을 생성합니다.

부위별 교차결합을 사용하여 분비된 박테리아 독성 인자의 조립 모니터링

단백질 사이의 상호 작용은 모든 세포 과정에 기본적이다. 생물 발광 공명 에너지 전달을 사용하여, 단백질의 쌍 사이의 상호 작용이 생균에 실시간으로 모니터링 할 수있다. 또한, 병원성 돌연변이의 효과가 평가 될 수있다.

생물 발광 공명 에너지 전달을 이용하여 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사

단백질 상호 작용 : SILAC의 면역 실험은 새로운 단백질을 발견하기위한 강력한 수단을 나타냅니다. 있도록하여 제어 및 시험 샘플, 진정한 상호 작용 모두에서 단백질 풍부 정확한 상대적 정량화 간단 실험 오염물 구별 될 수 있고, 선호도가 낮은 상호 작용은 덜 엄격한 버퍼 조건의 사용을 통해 유지.

SILAC - 면역 정량 프로테오믹스를 사용하여 포유 동물 세포에있는 단백질 상호 작용 파트너의 식별

단백질은 서로 상호 작용하며 이러한 상호 작용은 단백질의 기능을 대부분 결정합니다. 단백질 상호 작용 파트너는 디하이드로폴레이트 환원효소 단백질-단편 보완 분석법(DHFR-PCA)을 기반으로 하는 효모 적합성 분석을 사용하여 생체 내에서 고처리량으로 식별할 수 있습니다.

살아있는 세포의 단백질 조각 보완 분석 (PCA)에 의해 게놈 전체 단백질 - 단백질 상호 작용 상영

단백질 동시 발현은 단백질 복합체의 in vitro 재구성에 대한 강력한 대안이며 in vivo에서 생화학 및 유전자 검사를 수행하는 데 도움이 됩니다. 여기에서 우리는 단백질 복합체를 얻고 세포의 돌연변이 빈도를 조정하기 위해 대장균에서 단백질 공동 발현을 사용하는 것에 대해 보고합니다.

단백질 공동 식의 다각적 인 장점에<em&gt; 대장균</em

이 원고 luciferase 활동의 측정에 기반 하는 단백질 단백질 상호 작용을 결정 하기 위한 간단 하 고 신속한 실험 절차를 설명 합니다.

Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

여기서, 우리는 형광 현미경을 사용하여 이종 세포 시스템에서 트랜스에서 리간드 수용체 상호 작용을 신속하고 반정적으로 측정하는 최적화된 프로토콜을 제시한다.

이종 세포 시스템에서 단백질 응집을 통한 세포 간 상호 작용 측정

배우세요 박테리아 세포에서 단백질 공동 발현과 풀다운 분석을 결합한 방법으로, Escherichia coli BL21(DE3)에서 이형 이량체 형성을 효율적으로 연구할 수 있습니다. 이 기법은 단백질 상호작용을 신속하게 테스트하는 데 활용됩니다.

까다로운 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위한 시간 효율적인 도구로서 박테리아 세포의 공동 발현과 결합된 풀다운 분석

더 많은 동영상 탐색