디지털 고속 섬모 비디오 현미경을 사용한 비강 칫솔질 샘플링 및 처리 – COVID-19 전염병에 대한 적응

발표된 공식적인 수술 절차와 표준화의 부족으로 인해 디지털 고속 비디오 현미경 검사는 원발성 섬모 운동이상증에 대한 확증적 진단 검사로 간주되지 못하고 있습니다. 또한, 이번 COVID-19 위기 동안 진단 서비스를 계속 제공하기 위해 섬모 비디오 현미경 프로토콜은 적절한 감염 통제 조치를 포함하도록 조정되었습니다. 디지털 고속 비디오 현미경을 사용한 섬모 기능 평가는 원발성 섬모 운동 이상증 진단에 매우 민감하고 특이적입니다.

다른 원발성 섬모 운동이상증 진단 검사와 비교했을 때, 디지털 고속 비디오현미경 검사는 상대적으로 수행하기 쉽고 저렴하며 하루 내에 결과를 얻을 수 있습니다. 디지털 고속 비디오 현미경은 원발성 섬모 운동이상증 진단에 대한 민감도와 특이도가 더 높습니다. 현재 원발성 섬모 운동이상증에 대한 확증 검사는 전자 현미경 검사와 유전자 검사만이 인정되고 있지만, 이러한 검사는 15-30%의 환자에서 원발성 섬모 운동이상증 진단을 놓치게 됩니다.

코 칫솔질 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 이비인후과 레지던트인 Lionel Benchimol이 맡을 것입니다. 비강 샘플을 채취하기 전에 환자가 코를 풀게 합니다. 비강을 청소한 후 환자를 눕히거나 머리를 뒤로 젖히고 편안하게 앉게 합니다.

보충된 Medium 199에서 브러시를 흔들어 촉촉하게 하고 코 입구에 내시경을 놓아 아래쪽 비갑개를 시각화합니다. 세포학 브러시를 코에 삽입하고 빼기 전에 브러시를 아래쪽 비갑개의 뒤쪽 부분 위로 후방과 전방으로 여러 번 움직입니다. 브러시를 M199 튜브에 넣습니다.

튜브 내부에 완전히 맞도록 와이어를 자르고 즉시 튜브를 닫으십시오. 그런 다음 샘플을 밀폐된 이중 백에 넣습니다. 검체 채취 후 9시간 이내에 미생물 안전 캐비닛의 검체 튜브를 열고 Weil-Blakesley 비강 겸자를 사용하여 브러시를 교반하여 수집된 상피 스트립을 제거합니다.

양면 스페이서를 유리 슬라이드에 붙이고 스페이서에서 보호 장치를 제거합니다. 섬모가 튜브 전체로 퍼질 수 있도록 튜브를 부드럽게 흔들고 피펫을 사용하여 튜브 중앙에서 스페이서로 약 60마이크로리터의 섬모 상피를 전달합니다. 22 x 4mm 직사각형 커버 슬립을 스페이서에 올려 챔버를 닫고 미생물 안전 캐비닛에서 제거하기 전에 슬라이드를 70% 에탄올로 소독합니다.

장갑을 끼고 난 후에는 이 슬라이드를 가열된 상자의 접시에 놓고 뚜껑을 닫습니다. 오일 이멀젼 대물렌즈에 오일을 추가하고 상자를 정립 또는 도립 광 현미경의 스테이지에 놓습니다. 상자와 렌즈 히터를 켜고 상자와 렌즈 히터 컨트롤러의 온도 설정을 조정합니다.

5분 후 렌즈 끝으로 커버 슬립에 닿을 때까지 대물렌즈를 배치합니다. 샘플의 호흡기 섬모 가장자리를 시각화하려면 카메라 소프트웨어를 연 다음 현미경 대물렌즈를 사용하여 샘플 내의 세포를 수동으로 찾고 세포를 모니터에 투사합니다. 모니터에서 이미지가 보이는지 확인하고 필요에 따라 집광기와 렌즈 초점을 조정하여 이미지 품질을 향상시킵니다.

섬모 상피 스트립을 찾았을 때 길이가 50미크론 이상인 손상되지 않고 중단되지 않은 섬모 상피 가장자리만 선택합니다. 섬모 기능 분석을 위해 수직 가장자리 또는 사소한 돌기가 있는 가장자리만 사용해야 하며, 주요 돌기가 있는 섬모 가장자리 및 고립된 섬모 세포 또는 다른 세포 유형과 접촉하지 않는 단일 세포를 제외해야 합니다. 양호한 가장자리를 선택한 경우 초당 500프레임의 카메라 프레임 속도를 사용하여 약 2초 동안 박동하는 섬모 가장자리를 기록합니다.

측면에서 최소 6개의 양호한 가장자리를 기록한 후 view, 가열된 상자에서 슬라이드를 제거하고 슬라이드, 커버 슬립 및 스페이서를 밀폐 백에 넣습니다. 그런 다음 장갑과 마스크를 가방에 넣고 가방을 적절한 유해 의료 폐기물 용기에 넣습니다. 섬모 비트 주파수를 분석하려면 적절한 비디오 분석 소프트웨어 프로그램에서 녹음을 열고 섬모 가장자리를 약 10미크론의 인접한 약 5개의 영역으로 나눕니다.

감소된 프레임 속도와 영역당 최대 2개의 섬모 비트 주파수 측정에서 섬모 또는 섬모 그룹을 식별하고 시각화하여 가장자리당 최대 10개의 섬모 비트 주파수 측정값을 얻을 수 있습니다. 섬모 그룹이 5개의 비트 주기를 완료하는 데 필요한 프레임 수를 기록하고 공식을 사용하여 섬모 비트 빈도를 계산합니다. 샘플 내에서 각 뚜렷한 섬모 박동 패턴의 백분율을 결정하려면 각 섬모 또는 섬모 그룹에 대해 전체 박동 주기 동안 섬모가 취한 정확한 경로를 디지털 고속 비디오 현미경 분석에서 관찰된 정상적인 섬모 박동 패턴과 비교합니다.

분석된 각 섬모 또는 섬모 그룹에 정상, 뻣뻣함, 운동성, 비동기식 또는 이상운동성, 원형과 같은 뚜렷한 섬모 박동 패턴을 부여합니다. 그런 다음 각 샘플 내에서 각 고유한 섬모 비트 패턴의 백분율을 계산합니다. 샘플에 기인하는 섬모 박동 패턴은 관찰된 우세한 섬모 박동 패턴입니다.

여기에서는 성인 지원자 14명의 콧질 샘플에서 상세한 섬모 기능 분석 결과를 관찰합니다. 이 14개의 비강 칫솔질 샘플에서 242개의 섬모 가장자리가 기록되었으며 212개는 분석을 위해 정의된 포함 기준을 충족했습니다. 총 807개의 섬모 박동 빈도 측정 및 섬모 박동 패턴 평가가 분석된 섬모 또는 섬모 그룹으로부터 얻어졌습니다.

평균 운동성 지수는 건강한 지원자에서 관찰된 이전에 보고된 값과 유사했습니다. 운동이상증 점수(dyskinesia score)와 섬모 박동 빈도(ciliary beat frequency)는 수직 가장자리 또는 작은 돌기가 있는 가장자리만 선택할 때 얻은 이전에 보고된 값과 유사했습니다. 낮은 품질의 가장자리를 사용하면 섬모 박동 빈도가 낮고 운동 이상증 점수가 높은 것으로 보고됩니다.

너무 세게 칫솔질로 얻은 혈액 세포와 점액은 자유로운 섬모 박동을 막거나 관찰자로부터 섬모를 숨길 수 있습니다. 반대로, 브러시가 아래쪽 비갑개를 단단히 누르지 않으면 샘플에 고품질 섬모 상피 스트립이 충분하지 않을 수 있습니다. 또한 비강 앞쪽에 콧질을 수행하면 전이성 섬모가 없는 상피 세포만 얻을 수 있습니다.

프로토콜의 가장 중요한 두 가지 측면은 콧질의 품질과 완전한 양성 결과 또는 기술의 실패를 피하기 위한 고품질 상피 조각의 선택입니다.