Name: 일차 인간 비강 상피 세포 : 정밀 의학의 맥락에서 바이오 뱅킹 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 배우세요 일차 인간 비강 상피 세포의 증폭, 분화 및 동결보존 방법을 통해 낭포성 섬유증 맞춤 치료를 위한 CFTR 활성 평가 기술을 익히세요.

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우리는 연구에 참여한 모든 환자와 그 가족에게 진심으로 감사드립니다. 이 작품은 프랑스 협회 Vaincre la Mucoviscidose의 보조금으로 지원되었습니다. 프랑스 협회 ABCF 2 및 버텍스 제약 혁신 상.

모든 실험은 헬싱키 선언과 인간 연구 윤리에 관한 Huriet-Serusclat 법에 의해 설명 된 지침과 규정에 따라 수행되었습니다.
1. 플라스크 및 다른 매체의 준비
<ol><li>표 1에 기재된 바와 같이 증폭, 공기-액체 및 동결 매질을 준비한다.</li>
	<li>콜라겐 50 mg을 0.2% 빙초산 100 mL에 용해시켜 인간 콜라겐 IV의 원액을 제조하였다. 적어도 1 시간 동안 자기 교반기에 혼합하고, 용액을 멸균 여과한다. 빛으로부터 보호되는 유리 병에 4 °C에서 최대 6 개월 동안 보관하십시오.</li>
	<li>원액을 이중 증류수에 1:5로 희석하여 콜라겐 IV의 작업액을 준비한다. 4°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.</li>
	<li>플라스틱 세포 배양 플라스크 또는 트랜스웰 필터를 콜라겐 작동 용액으로 코팅하십시오. 0.33 cm2 트랜스웰 필터에 대해 100 μL,25 cm2 플라스크에 대해 500 μL, 및 75cm2 플라스크에 대해 1 mL를 플라스크의 전체 성장 표면에 고르게 분배한다. 참고 : 이것은 플라스크를 좌우로 부드럽게 기울임으로써 달성 될 수 있습니다. 대안적으로, 플라스크의 코팅을 용이하게 하기 위해, 증가된 부피가 사용될 수 있고, 전체 표면이 고르게 커버될 때, 콜라겐 용액은 지시된 부피만을 남기도록 흡인된다. 흡인된 콜라겐 용액은 그 후 즉시 다음 플라스크를 코팅하는데 사용될 수 있다(즉, 3개의 75cm2 플라스크의 경우, 3 mL의 콜라겐 용액을 첫 번째 플라스크에 고르게 분배하고, 흡인물 2 mL를 다음 플라스크에 사용하는 등).</li>
	<li>세포 배양 플라스크를 최소 2 h 또는 하룻밤 동안 인큐베이터에 두십시오. 콜라겐을 철저히 흡인하고 플라스크를 인큐베이터 또는 후드 아래에서 최소 20 분 또는 하룻밤 동안 건조시킵니다.</li>
	<li>10 mL의 Mg2+- 및Ca2+-free DPBS로 세척하고, 인큐베이터에서 건조시키고, 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일에 보관하십시오. 플라스크를 실온(RT)에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.</li>
</ol>2. 비강 칫솔질
참고: 참가자가 급성 감염이 없는 동안 비강 칫솔질이 수행되는지 확인하십시오. CF 환자가 폐 감염이있는 경우, 환자의 항생제를 참조하고 증폭 배지에 항생제를 추가하십시오. 인간 비강 상피 세포는앞서 기술된 바와 같이 F508del/F508del 환자로부터 비강 양치에 의해 수집되었다.
<ol><li>환자에게 코를 불도록 요청한 다음 나파졸린 용액으로 자일로카인 5 %에 담근 면화 메쉬를 사용하여 두 콧구멍의 점막을 국소 적으로 마취하십시오.</li>
	<li>세포학 브러시를 사용하여 양쪽 콧구멍의 내측 벽과 열등한 turbinate를 부드럽게 닦으십시오. 브러시를 2 mL의 상업적으로 입수가능한 플러싱 매질과 함께 15 mL 튜브에 담그고; 부드럽게 흔들어 세포를 분리합니다. 두 번째 콧구멍에서 칫솔질을 반복하십시오.</li>
	<li>페니실린 (100 U / mL), 스트렙토 마이신 (100 μg / mL), 타조 실린 (10 μg / mL), 암포테리신 B (2.5 μg / mL) 및 콜리마이신 (16 μg / mL)과 같은 항생제를 플러싱 배지에 추가하십시오. 참고 : 비강 칫솔질은 RT에서 확장 및 배양을위한 전용 실험실로 배송 될 수 있으며 칫솔질 후 최대 72 시간까지 시드 할 수 있습니다.</li>
</ol>3. HNE의 분리
참고: HNE를 세포학 브러쉬로부터 단리하고, Mg2+- 및Ca2+-비함유 DPBS로 세척하고, 0.25% 트립신으로 해리시키고, 앞서 기술된 바와 같이 25cm2 플라스틱 플라스크 상에 시딩하였다(10).
<ol><li>1000 μL 피펫콘을 통해 브러시를 반복적으로 통과시키고 2 mL의 Mg2+- 및 Ca2+-free DPBS로 헹구어 세포학 브러쉬로부터 세포를 분리한다. 4°C에서 5분 동안 500 x g에서 원심분리하고 상층액을 버린다.</li>
	<li>펠렛을 0.25% 트립신에 8-12분 동안 재현탁시켜 세포를 해리시킨다. 증폭 배지 5 mL를 첨가하여 효소 반응을 중지시킨다.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하고 상층액을 버린다. 펠렛을 증폭 배지 8 mL에 재현탁시키고 시드를 25cm2 콜라겐이 코팅된 플라스크 상에 상으로 시킨다. 37°C 및 5%CO2에서 성장한다. 이것은 구절 0에 해당합니다.</li>
	<li>다음날, 배지를 5 mL의 신선한 증폭 배지로 교체하고 부착, 형태학 (세포는 응집성 조약돌 외관을 가져야함) 및 수에 대해 매일 세포를 모니터링한다. 참고 : 초기 시딩 밀도는 비강 칫솔질의 품질과 상피 세포의 비율에 따라 다릅니다. 갓 분리 된 HNE 세포는 일반적으로 3-10 일 이내에 80 % -90 % 컨플루언시에 도달합니다. 느린 성장 속도는 샘플에서 불충분 한 상피 세포를 암시하며 폐기해야합니다.</li>
</ol>4. 인간 비강 상피 세포의 증폭 및 패시징
<ol><li>콜라겐 코팅된 플라스크 상에서 37°C 및 5% CO2의 증폭 배지에서 80%-90% 컨플루언시가 될 때까지 인간 비강 상피 세포를 성장시키고, 매 48-72시간마다 배지를 변경한다. 25cm2 플라스크의 경우 증폭 배지 5mL와 75cm2 플라스크에 10mL를 사용합니다.</li>
	<li>세포가 80%-90% 컨플루언시(confluency)에 도달하면, 10 mL의 Mg2+- 및Ca2+-free DPBS로 세포를 세척하고, 흡인물을 놔두고, 버린다.</li>
	<li>25cm2 플라스크에 0.25% 트립신 1 mL (또는 75 cm2 플라스크의 경우 트립신 2 mL)를 첨가하고, 8-12분 동안 인큐베이터 (37°C, 5%CO2)로 복귀시킨다.</li>
	<li>손바닥으로 플라스크를 단단히 두드려 세포가 분리되도록 도와줍니다.</li>
	<li>증폭 배지 10 mL를 첨가하여 효소 반응을 정지시킨다. 플라스크를 격렬하게 헹구고, 10 mL 피펫을 사용하여 세포를 헹구고 분리하기 위해 플라스크 표면 위로 증폭 배지를 뽑아 내고 배출한다.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하고 상층액을 버린다.</li>
	<li>펠렛을 증폭 배지의 5-10 mL에 재현탁시킨다.</li>
	<li>혈구계를 사용하여 세포를 계수하십시오. 참고: 이 시점에서 셀을 동결시킬 수 있습니다(단계 5.1-5.3 참조). 추가 증폭이 필요한 경우 콜라겐 코팅 플라스크에 다시 시드하십시오 (25cm2 플라스크는 3 개의 75cm2 플라스크로 확장 될 수 있으므로 더 큰 희석은 권장되지 않습니다).</li>
</ol>5. 원발성 비강 상피 세포의 동결 보존
참고: 바이오뱅킹 전 계대 1까지 HNE 세포를 성장시켜 해동시 세포 성장을 촉진하기에 충분한 세포를 확보하십시오. 그러나 바이오 뱅킹은 초기 통로 0 또는 통로 2에서 가능합니다. 다음의 냉동 보존 단계는 모든 구절에 적용됩니다.
<ol><li>세포 계수 후, 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하고, 상층액을 버린다.</li>
	<li>펠렛을 농축된 동결 배지 (표 1)에 재현탁시켜 mL 당 및 냉동 당 3 x 106-5 x 106 세포를 얻었다.</li>
	<li>-80°C에서 적절한 냉동 냉동 용기에서 분당 ∼1°C에서 온도를 감소시킴으로써 세포를 천천히 동결시킨다. 다음날, 보존된 샘플을 장기 보관을 위해 질소 저장 용기로 옮깁니다(본 연구는 17개월 보관으로 제한됩니다).</li>
</ol>6. 냉동 증폭된 HNE 세포 해동
<ol><li>수조를 37°C로 예열한다. 표 1 에 기재된 바와 같이 증폭 배지를 준비하고 배지를 37°C로 가온한다.</li>
	<li>질소 저장 탱크에서 냉동 장치를 제거하고 신속하게 수조에 넣고 바이알 전체를 물에 잠기지 않도록주의하십시오. 작은 얼어 붙은 물방울 만 남을 때 수조에서 냉동 장치를 제거하십시오. 바이알을 70% 알코올로 닦아내고, 닦아내고, 후드 아래에 두세요.</li>
	<li>1 mL 피펫을 사용하여, 해동된 세포를 빈 15 mL 튜브로 옮긴다.</li>
	<li>적가하는 방식으로, 1 mL의 따뜻한 증폭 배지를 첨가한다. 1분 후, 또 다른 증폭 배지 1 mL를 첨가하고, 추가로 1분 정도 기다린다.</li>
	<li>증폭 배지 10 mL를 첨가하고 500 x g에서 2분 동안 원심분리한다.</li>
	<li>상층액을 흡인하고 버립니다. 세포 펠릿을 적어도 1 x 10 6 cells/mL의 세포 밀도를 달성하는 데 필요한 증폭 배지의 부피에 재현탁시킨다.</li>
	<li>세포를 증폭 배지를 함유하는 콜라겐 코팅된 플라스크 상에 시드한다.<ol>
<li>cryovial이 4 x 106 세포 이상을 함유하는 경우, 75cm2 플라스크 상에 시드하고, 증폭 배지의 10 mL에</li>
		<li>cryovial이 4 x 106 세포 미만을 함유하는 경우, 종자 세포를 25cm2 플라스크 상에, 증폭 배지의 5 mL에</li>
	</ol>
</li>
	<li>37°C, 5%CO2 에서 배양하고, 다음 2-3일에 걸쳐 세포 확장을 육안으로 관찰한다.</li>
	<li>이어서, 섹션 4에 상술된 바와 같이 세포 증폭을 수행한다. 참고: 4.7단계에서 세포를 수확한 세포가 거의 없는 경우. (즉, 팽창 전에 통로 0에서 동결되는 경우), 단계 6.5. 및 6.6. 생략될 수 있고, 세포는 원심분리 없이 25cm2 콜라겐 코팅된 플라스크 상에 직접 시딩될 수 있다. 그런 다음 다음 날 배지를 변경하여 디메틸 설폭사이드 (DMSO)를 제거해야합니다.</li>
</ol>7. 공기-액체 계면에서 인간 비강 상피 세포의 분화
주: HNE는 앞서 기술한 바와 같이 공기-액체 계면에서 분화되었다10.
<ol><li>0.33cm2 콜라겐 코팅 다공성 필터에 330,000 세포/필터의 밀도로 세포를 시드하고 정점 측의 증폭 배지 300 μL와 기저 측의 공기 액체 배지 900 μL로 보충하십시오.</li>
	<li>3일 후, 정점 배지를 흡인하고 세포를 공기-액체 배지에서 3-4주 동안 공기-액체 계면에서 배양하여 분화된 상피를 확립한다. 48-72 시간마다 기본 배지를 교체하십시오.</li>
</ol>8. CFTR 변조기
<ol><li>CFTR 조절제를 함유하는 공기-액체 매질을 준비한다. VX-445, VX-661 및 VX-809를 최종 농도 3 μM에서, VX-770을 100 nM에서 사용하십시오. 1μM의 최종 농도에서 교정기 ABBV-2222를 사용하고 10μM에서 강화제 ABBV-974를 사용하십시오. 모든 CFTR 조절제를 용해하려면 100% DMSO를 사용하십시오.</li>
	<li>교정기 배지에서와 동일한 양의 100% DMSO를 함유하는 공기-액체 배지를 준비한다.</li>
	<li>약물 또는 DMSO를 함유하는 배지를 공기-액체 계면에서 성장된 편광된 HNE 세포의 기저측측에 첨가하고, 37°C에서 5%CO2 중에서 24 시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>24시간 후, 흡인물은 배지를 버리고 단계 8.1-8.2.에서와 같이 제조된 신선한 배지로 교체하고, 37°C에서 5%CO2에서 24 시간 기간 동안 추가로 인큐베이션한다.</li>
</ol>9. 챔버 연구 사용
<ol><li>앞서 설명한 바와 같이 전압 클램프 조건 하에서 단락 전류 측정(Isc)을 측정합니다(9). 참고: 배양물의 경상피 전기 저항(TEER)은 젓가락 전압계로 측정하였으며, 적어도 200 Ω·cm2 에 도달하는 배양물만이 다음의 실험을 위해 고려되었다. 편광된 HNE 셀의 필터는 어싱 챔버에 장착되었고, 단락 전류 측정(Isc)은 전압 클램프 조건 하에서 측정되었다.</li>
</ol>10. 면역세포화학
<ol><li>앞서 기술한 바와 같이 면역검출을 수행한다9. 주: CFTR 면역검출은 항-CFTR C 말단 (24-1) 모노클로날 항체를 사용하여 1/100 희석액에서 하룻밤 동안 수행하였다. 조나-폐색-1 (ZO-1) (1/500 희석), 알파-튜불린 (1/300 희석), Muc 5AC (1/250 희석) 및 시토케라틴 8 (1/250 희석) 염색을 추가 필터 상에서 수행하였다. PBS-Triton-X100 0.1%로 세척한 후, Alexa 488 또는 594에 접합된 염소 이차 항체를 10% 염소 혈청에 30분 동안 첨가하였다(1/1000 희석). 최종 세척 후, 필터를 지지체로부터 절단하고 DAPI를 함유하는 Vectashield 장착 매체로 장착하였다. 공초점 현미경 (63x / 1.4 오일 차동 간섭 대비 λ 블루 PL APO 목표)을 사용하여 이미지를 캡처하고 ImageJ 소프트웨어로 분석했습니다.</li>
</ol>11. 통계 분석
<ol><li>적절한 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하십시오. 참고: 통계 분석은 S.A.S 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 환자 당 및 조건당 여러 HNE 필터가 얻어짐에 따라, 정량적 파라미터는 환자 당 중앙값 (± SEM)으로 표현되었다. 비교(평균 ± SD)는 Wilcoxon 매칭 쌍 서명 순위 테스트 또는 짝을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 수행하였다.</li>
</ol>

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<li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).</li>
<li>Reynolds, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+progenitor+clone+formation+is+enhanced+by+Y-27632-dependent+changes+in+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).</li>
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<li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+functional+differences+in+differentiated+Conditionally+Reprogrammed+%28CRC%29-+and+Feeder-free+Dual+SMAD+inhibited-expanded+human+nasal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).</li>
<li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+folding+correction+of+F508del+and+rare+CFTR+mutants+by+elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor+%28Trikafta%29+combination%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination.</a> JCI Insight. 5 (18), 139983(2020).</li>
<li>Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rock+Inhibitor+Y-27632+enables+feeder-free%2C+unlimited+expansion+of+Sus+scrofa+domesticus+swine+airway+stem+cells+to+facilitate+respiratory+research%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research.</a> Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).</li>
<li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+multiple+class+II+CFTR+mutations+by+elexacaftor%2Btezacaftor%2Bivacaftor+mediated+in+part+by+the+dual+activities+of+elexacaftor+as+both+corrector+and+potentiator%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator.</a> The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774(2021).</li>
<li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum%2Ffeeder-free+single+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).</li>
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<li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+pre-clinical+modulators+developed+for+F508del-CFTR+have+the+potential+to+be+effective+for+ORKAMBI+resistant+processing+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).</li>
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개인화된 의학의 맥락에서 CFTR 활성을 측정하기 위한 인간 기관지 상피(HBE) 세포의 대리자로서 환자 유래 비강 상피 세포의 사용은 HNE가 배양물 9,11에서 세포의 특성을 재생산함에 따라 제안되었다. HBE 세포 배양에 비해 HNE의 강력한 장점은 이들이 쉽고 비침습적으로 샘플링된다는 것이다. HNE 세포 배양물에서의 단락 전류 측정은 상피를 가로지르는 CFTR 의존성 Cl-수송의 평가를 가능하게 하며, 이는 다양한 유전자형9를 갖는 환자에서 비강 전위차에 의해 평가된 생체내 CFTR 활성과 유의하게 상관관계가 있는 것으로 나타났다. VX-809 치료시 HNE 세포에서 CFTR 활성의 구출은 또한 루마카프토르-이바카프터 처리된 F508del 동형접합성 환자12에서 임상 결과 FE...

낭포성 섬유증 (CF)은 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절기 (CFTR) 유전자의 돌연변이로 인해 CFTR 단백질의 부재 또는 기능 장애를 초래하는 상염색체 열성 장애로, 상피 1,2의 정점 표면에 위치한 음이온 채널입니다. CFTR 요법의 최근 발전은 질병의 예후를 개선했으며, CFTR 교정제와 CFTR 강화제를 결합한 마지막 승인 된 약물은 가장 빈번한 돌연변이 p.Phe508del 돌연변이 (F508del)3,4를 가진 CF 환자의 폐 기능과 삶의 질을 크게 향상 시켰습니다. 이러한 유망한 치료 진행에도 불구하고, CF 환자의 약 10 %는 이러한 CFTR 조절제에 의해 구출 할 수없는 돌연변이를 가지고 있기 때문에 부적격합니다. 이러한 환자의 경우, 특정 돌연변이에 대한 가장 효율적인 조합을 찾기 위해 다른 약물 또는 약물 조합을 테스트하여 개인화 된 치료법의 중요성을 강조 할 필요가 있습니다.
인간 비강 상피 (HNE) 세포는 간단하고 비 침습적 인 비강 칫솔질에 의해 수집하기 쉽고 CFTR 기능의 지표로서 순환 AMP 매개 염화물 (Cl-) 수송의 정량화를 허용합니다. HNE 세포는 인간 기도의 정확한 모델을 산출하지만, 그들의 수명은 배양에서 제한된다. 배양 기술의 최적화 덕분에, 환자 유래 일차 HNE 세포는 미세다공성 필터5,6 상에서 Rho-associated kinase inhibitor (ROCKi)로 조건부로 재프로그래밍되고, 증폭되고, 공기-액체 계면 (ALI) 조건에서 의사-층화된 상피로 분화될 수 있다. HNE 배양을 위한 수많은 배양 프로토콜(시판, 무혈청, "수제", 피더-세포와의 공동 배양 등)이 존재하며, 배지 및 배양 조건의 선택은 성장, 세포 집단 분화 및 상피 기능에 영향을 미치기 위해 기술되었다 7,8. 여기서 프로토콜은 CFTR 기능 분석을 위해 ALI에서 분화되는 많은 수의 HNE 세포를 성공적으로 수득할 수 있는 단순화된 피더가 없는 ROCKi 증폭 방법을 제시합니다.
우리는 분화된 HNE 세포에서, CFTR 조절제를 사용한 48시간 처리가 CFTR 의존성 Cl- 전류의 전기생리학적 교정을 유도하기에 충분하고, 시험관내에서 관찰된 교정이 환자의 임상적 개선과 상관관계가 있을 수 있음을 입증하였다9. 따라서 HNE 세포는 기본적인 CF 연구뿐만 아니라 환자 별 CFTR 조절제 테스트를 통한 전임상 연구에 적합한 모델을 나타냅니다. 개인화 된 치료의 이러한 맥락에서, 프로토콜의 목표는 우리의 조건에서 자란 CF 환자의 냉동 보존 HNE 세포가 CFTR 교정 연구에 적합한 모델임을 검증하는 것이 었으며, 신선하고 냉동 해동 된 세포로부터의 CFTR 의존성 Cl- 수송을 비교할 때 유사한 결과가 예상 될 수 있습니다. 이 연구는 또한 이중 및 삼중 요법을 사용할 때 다른 CFTR 조절제의 효능을 평가했습니다.

<table><tbody><tr><td>ABBV-2222</td><td>Selleckchem</td><td>S8535</td><td></td></tr><tr><td>ABBV-974</td><td>Selleckchem</td><td>S8698</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 염소 2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594 염소 2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Life Technologies</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>안티 알파 튜불린 항체</td><td>Abcam</td><td>ab80779</td><td></td></tr><tr><td>안티 CFTR 단클론 항체 (24-1)</td><td>R & D Systems</td><td>MAB25031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-cytokeratin 8 항체</td><td>Progen</td><td>61038</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Muc5AC 항체</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-20118</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ZO-1 항체</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-10804</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td></td><td>Necker Hospital Pharmacy</td><td></td></tr><tr><td>Colimycin</td><td>Sanofi</td> provided by <td>Necker 병원 약국</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 유형 IV</td><td>시그마-알드리치 머크</td><td>C-7521</td><td></td></tr><tr><td>세포학 브러시</td><td>실험실 산부인</td>과 <td>02.104</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마-알드리치 머크</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>에피네프린</td><td>시그마-알드리치 머크</td><td>E4375</td><td></td></tr><tr><td>F12-영양 혼합물</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td></td> 10270106 <td></td></tr><tr><td>Ferticult</td><td>Fertipro NV</td><td></td> FLUSH020 <td></td></tr><tr><td>플라스크 25</td><td>Thermo Scientific</td><td>156.367</td><td></td></tr><tr><td>플라스크 75</td><td>Thermo Scientific</td><td>156.499</td><td></td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>VWR</td><td>20104.298</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마-알드리치 머크</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>하이드로코르티손</td><td>시그마-알드리치 머크</td><td>SLCJ0893</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마-알드리치 머크</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>mg2+ 및 Ca2+-free DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Life Technologies</td><td>15140130</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Necker Hospital Pharmacy</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Filters</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>CLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0,25%</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>을 사용한 Vectashield 장착 매체 제공VX-445</td><td>Selleckchem</td><td>S8851</td><td></td></tr><tr><td>VX-661</td><td>Selleckchem</td><td>S7059</td><td></td></tr><tr><td>VX-770</td><td>Selleckchem</td><td>S1144</td><td></td></tr><tr><td>VX-809</td><td>Selleckchem</td><td>S1565</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine naphazoline 5%</td><td>Aspen France</td><td>Necker Hospital Pharmacy</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody> 제공</table>

일차 인간 비강 상피 세포 : 정밀 의학의 맥락에서 바이오 뱅킹

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

인간 비강 상피 (HNE) 세포는 간단하고 비 침습적 인 비강 칫솔질로 쉽게 수집 할 수 있습니다. 환자 유래 일차 HNE 세포는 공기-액체 계면 조건에서 의사층화된 상피로 증폭 및 분화되어 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절기(CFTR) 기능의 지표로서 순환 AMP 매개 염화물(Cl-) 수송을 정량화할 수 있다. 냉동 보존시 비강 양치의 품질 및 세포 밀도와 같은 중요한 단계가 효율적으로 수행되면 HNE 세포를 성공적으로 바이오 뱅크 할 수 있습니다. 또한, 단락 전류 연구는 동결 해동이 HNE 세포의 전기 생리 학적 특성과 CFTR 조절제에 대한 반응을 크게 변화시키지 않는다는 것을 보여줍니다. 본 연구에 사용된 배양 조건에서, 동결 당 2 x 10미만의 6 세포가 동결될 때, 실패율은 매우 높다. 우리는 냉동 당 적어도 3 x 106 세포를 동결하는 것이 좋습니다. 우리는 CFTR 교정기와 CFTR 강화제를 결합하는 이중 요법이 F508del-동형접합성 HNE 세포에서 CFTR 활성에 대해 필적할만한 보정 효능을 갖는다는 것을 보여준다. 삼중 요법 VX-445 + VX-661 + VX-770은 이중 요법 VX-809 + VX-770에 비해 CFTR 활성의 보정을 유의하게 증가시켰다. HNE 세포에서 CFTR 활성의 측정은 CFTR 조절제 요법을 안내하는데 유용한 유망한 전임상 바이오마커이다.

공기-액체 계면에서 배양된 신선한 HNE 세포는 면역염색에 의해 평가된 바와 같이 편광되고 분화된 호흡 상피의 전형적인 특징을 나타낸다(도 1). HNE 세포는 섬모(양성 알파-튜불린 염색) 및 비섬모 점액 생성 잔 세포(양성 Muc5Ac 면역염색)로 구성된 의사층화된 호흡기 상피의 생체내 상황을 모방하는 상피 세포의 이질층(양성 케라틴 8 면역염색)으로 재분화한다. 전체 상피는 단단한 접합부를 나타낸다 (ZO-1, zona-occludens-1 염색에 의해 평가됨). 강한 정점 CFTR 염색은 야생형 (WT) HNE 세포에서 볼 수 있으며, 정점 표면과 세포질에서 모두 감소된 CFTR 염색은 F508del/F508del HNE에서 관찰된다.
우리는 긍정적 인 결과를 샘플로 간주하여 성공적으로 확장 될뿐만 아니라 공기 - 액체 계면에서 3 주 후에 의사 층화 된 상피로 성공적으로 차별화되고 단락 전류 측정이 가...

여기서 우리는 공기-액체 계면에서 일차 인간 비강 상피 (HNE) 세포의 단리, 증폭 및 분화 및 증폭 된 HNE를 성공적으로 동결 및 해동 할 수있게 해주는 바이오 뱅킹 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 상이한 조절제 처리시 분화된 HNE 세포의 전기생리학적 특성 및 CFTR 관련 염화물 분비 보정을 분석한다.

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...

이 프로토콜은 일차 비강 상피 세포를 증폭, 분화 및 동결보존하기 위한 주요 단계를 강조합니다. 우리의 배양 조건에서, 원발성 비강 상피 세포는 폐 상피를 모방한다. 이를 통해 환자 유래 배양 및 신선한 또는 바이오 뱅크 세포에서 개인화 된 의학 연구가 가능합니다.환자 유래 비강 상피 배양물을 사용하여 CFTR 활성을 평가하고 새로운 치료법에 대한 환자의 개별 반응을 평가함으로써 낭포성 섬유증 치료를 도울 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 엔지니어 인 Aurelie Hatton이 될 것입니다. 시작하려면 비강 상피 또는 HNE 세포를 10 밀리리터의 증폭 배지에서 성장시킵니다.섭씨 37도 및 5% 이산화탄소가 80 내지 90%컨플루언시에 도달할 때까지 75 평방 센티미터의 콜라겐 코팅 플라스크에서 인큐베이션한다. 48~72시간마다 배지를 교체하십시오. 나중에 10 밀리리터의 마그네슘과 칼슘이없는 DPBS로 세포를 씻으십시오.염분을 흡인하고 버리십시오. 0.25 % 트립신 2 밀리리터를 첨가하고 플라스크를 8 ~ 12 분 동안 인큐베이터로 반환하기 전에. 나중에 플라스크를 손바닥으로 단단히 두드려 세포 분리를 돕습니다.효소 반응을 멈추기 위해 증폭 배지 10 밀리리터를 첨가한다. 10 밀리리터 피펫을 사용하여 플라스크를 격렬하게 헹구고 플라스크 표면 위로 증폭 배지를 뽑아 내고 배출하여 세포를 헹구고 분리하고 세포를 15 밀리리터 튜브에 수집하십시오. 세포 현탁액을 섭씨 네 도에서 5분 동안 500배 G에서 원심분리하고 상층액을 버린다.펠렛을 다섯 내지 10밀리리터의 증폭 배지에 재현탁시킨다. 그런 다음 혈구 측정기에서 세포를 계산하십시오. 세포 계수 후, 세포를 섭씨 네 도에서 5분 동안 500배 G에서 원심분리하고 상층액을 버린다.그 후 펠렛을 농축된 동결 배지에 재현탁시켜 밀리리터 당 여섯 개의 세포를 10회 내지 세 번 내지 다섯 번 수득하고 냉동 바이알에 놓는다. 영하 80도의 적절한 냉동 냉동 용기에서 분당 약 섭씨 한 도만큼 온도를 낮춤으로써 세포를 천천히 동결시킵니다. 다음 날, 보존된 샘플을 장기 보관을 위해 질소 저장 용기로 옮깁니다.갓 준비한 증폭 배지를 섭씨 37도로 설정된 수조에서 따뜻하게 합니다. 질소 저장 탱크에서 냉동 바이알을 제거하고 신속하게 수조에 넣고 바이알 전체를 물에 담그지 않도록주의하십시오. 작은 얼어 붙은 물방울 만 남을 때 수조에서 냉동 바이알을 제거하십시오.바이알을 70 % 알코올로 닦아 후드 아래에 놓습니다. 1 밀리리터 피펫을 사용하여 해동 된 세포를 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 한 밀리리터의 따뜻한 증폭 배지를 드롭 와이즈 방식으로 첨가하십시오.잠시 후 증폭 배지 한 밀리리터를 더 넣고 잠시 기다립니다. 증폭 배지 10 밀리리터를 넣고 섭씨 네 도에서 두 분 동안 500 배 G에서 원심 분리하십시오. 상층액을 흡인하고 버립니다.펠렛을 밀리리터 당 1회 10 내지 여섯 개의 세포의 세포 밀도를 달성하기 위해 요구되는 증폭 배지의 부피에 재현탁시킨다. 세포를 증폭 배지를 함유하는 25 평방 센티미터의 콜라겐 코팅 플라스크 상에 시딩한 후, 세포를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 인큐베이션한다. 앞서 입증된 바와 같이 세포 증폭을 수행하기 전에 이삼일에 걸친 세포 확장을 육안으로 관찰한다.세포를 0.33 평방 센티미터 콜라겐 코팅 다공성 필터에 필터 당 3.3 배 10 내지 5 번째 세포의 밀도로 시드하고, 정점 측에서 300 마이크로리터의 증폭 배지와 기저측에서 900 마이크로리터의 공기 액체 배지로 보충한다. 사흘 후, 정점 배지를 흡인하고 세포를 공기-액체 배지에서 삼 내지 사주 동안 공기-액체 계면에서 배양하여 분화된 상피를 확립한다. 48 ~ 72 시간마다 기본 배지를 교체하십시오.공기-액체 계면에서 배양된 신선한 HNE 세포는 편광되고 분화된 호흡 상피의 전형적인 특징을 나타내었다. 78개의 HNE 세포 샘플에서, 성공률은 플러싱 배지에서 운반 즉시 및 운반 후 즉시 시딩된 비강 양치에서 비교되었다. 성공적인 배양의 초기 평균 비율은 82 %였으며 0에서 5 일 사이에 시드 된 샘플에서 87 %에 도달했습니다.신선한 조건에서 성공적으로 분화된 샘플의 83%는 또한 동결보존된 샘플에서 성공적이었다. 마찬가지로, 신선한 조건에서 분화하지 못한 샘플에서 71 %는 동결 해동 조건에서도 실패했습니다. 더욱이, 냉동 바이알 당 10 내지 6개의 세포 사이에서 두 내지 세 번 사이에 동결된 샘플의 50%는 해동될 때 성장하지 못하여, 6개의 세포에 대해 두 번 10회 미만으로 80%에 도달하였다.DMSO 처리된 HNE 세포에서 CFTR 억제제(172)에 반응하는 포스콜린 및 단락 전류 변화에 반응하는 단락 전류 변화에 대해, 신선 또는 냉동 해동된 HNE 간에 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 치료 시, 두 세포 유형 모두 포스콜린에 대한 반응의 단락 전류 변화의 증가와 CFTR 억제제 172에 대한 반응의 단락 전류 변화의 감소와 함께 상당한 보정을 나타냈다. CFTR 기능 이중 요법의 시정 반응은 포스콜린에 대한 반응에서 DMSO 처리된 HNE 세포 단락 전류 변화와 비교하여 평가되었고, CFTR 억제제 172에 대한 반응으로 VX-809 플러스 VX-770 및 VX-661 플러스 VX-770 둘 다에 의해 유의하게 개선되었다.6명의 F508del 동형접합성 환자로부터의 HNE에서 세 가지 상이한 CFTR 조절제 요법을 비교하였다. CFTR 보정기 및 전위제, 정점 및 CFTR 변조기 둘 다와 함께 사용될 때, CFTR 억제제(172)에 반응하여 포스콜린 및 단락 전류 변화에 응답하여 단락 전류 변화를 유사한 정도로 보정한다. HNE 세포를 동결시킬 때, 해동 시 좋은 결과를 얻을 가능성을 높이기 위해 냉동 바이알 당 적어도 3백만 개의 세포를 보유하는 것이 중요하다.HNE 세포에서의 CFTR 활성은 낭포성 섬유증에서 개인화된 치료법을 평가하고 조정하는데 좋은 예측 모델인 것으로 나타났다.

primary-human-nasal-epithelial-cells-biobanking-context-precision

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 여기서 쥐, 인간의 비강 충치의 후각 점막 조직 검사로 연구를 해왔하는 방법을 설명합니다. 이러한 biopsies은 뇌 질환의 분자 변이를 식별하거나 뇌 손상 / 질병의 동물 모델에 세포 이식을 위해 활용할 수 multipotent 성인의 줄기 세포를 분리하거나 사용할 수 있습니다.

설치류 또는 인간의 네이절 강한 줄기 세포를 분리

인간 자원 봉사자의 표면 부스러기 생검을 통해 얻은 비강 상피 세포, 조직 배양 인서트로 확장 및 전송됩니다. 포화 상태에 도달하면, 세포는 섬모와 비 섬모 세포의 문화를 산출, 공기 액체 계면에서 재배되고 있습니다. 차별화 된 비강 상피 세포 배양은 호흡기 점막을 공부 가능한 실험 모델을 제공합니다.

에어 리퀴드 인터페이스에서 인간의 비강 상피 세포의 배양

이 간행물은 어린이의 코 상피 점막을 성공적으로 샘플링 및 배양하고 이러한 세포를 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 방법을 보여줍니다.

어린이에서 차 비강 상피 세포를 배양 및 유도 다 능성 줄기 세포로 재 프로그램

피부 종양은 모스 (Mohs) 현미경 수술 후 폐기됩니다. 임상 지원 직원이 임상 작업을 방해하지 않고 하류 실험실 응용을위한 피부 종양 ( 예 : 편평 세포 암종, 기저 세포 암종 및 흑색 종) 샘플을 효과적으로 처리하고 저장할 수있는 프로토콜이 여기에 설명되어 있습니다.

클리닉 기반 생물 저장소의 설립

여기 우리 인간의 비 강 상피 세포의 3 차원 회전 타원 체 문화를 생성 하는 방법을 설명 합니다. Spheroids는 다음 드라이브 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR) 자극-종속 이온 및 액체 분 비, CFTR 함수에 대 한 프록시로 회전 타원 체 luminal 크기의 변화를 측정.

개별된 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 연구에 대 한 인간의 비 강 상피 세포 Spheroids의 생성

상세한 프로토콜이 인간 비강 상피 세포로부터의 시험관내 오가노이드 모델을 기술하기 위해 여기에 제시된다. 이 프로토콜에는 표준 실험실 장비가 필요한 측정 옵션이 있으며 특수 장비 및 소프트웨어에 대한 추가 가능성이 있습니다.

인간 비강 상피 오가노이드의 문화와 이미징

이 프로토콜은 비강 상피 세포 수집, 확장 및 기관형 기도 상피 세포 모델로의 분화와 라이브 셀 이미징 및 맞춤형 스크립트를 통한 섬모 박동 빈도의 정량화를 설명합니다.

섬모 박동 빈도의 정량화를 위한 1차 인간 비강 상피 세포 모델의 수집, 확장 및 분화

인간 유도 만능 줄기 세포 분화 프로토콜의 최근 발전은 기관 특이적 세포 유형의 단계적 유도를 허용한다. 여기에서, 우리는 iPSC 유래 기도 기저 세포의 유지 및 확장과 공기-액체 계면 배양물에서 점막 상피로의 분화를 위한 상세한 단계를 제공한다.

인간 다능성 줄기 세포로부터의 기도 상피 세포 공기-액체 계면 배양물의 생성

비강 상피는 모든 호흡기 병원체가 만나는 주요 장벽 부위입니다. 여기에서는 생리학적으로 관련된 시스템에서 인간 코로나바이러스-숙주 상호 작용을 특성화하기 위해 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양으로 성장한 일차 비강 상피 세포를 사용하는 방법을 간략하게 설명합니다.

인간 코로나바이러스-숙주 상호작용을 특성화하기 위해 공기-액체 계면에서 성장한 일차 비강 상피 세포의 감염

여기에 제시된 것은 장기 바이오뱅킹을 위한 원발성 기관지 상피 세포의 분리 및 확장과 공기-액체 계면에서 배양에 의한 분화된 상피 세포의 생성을 위한 재현 가능하고 저렴하며 강력한 방법입니다.

바이오뱅킹을 위해 절제된 폐 조직에서 기관지 상피 세포를 분리하고 잘 분화된 공기-액체 계면 배양을 확립합니다.

배우세요 일차 인간 비강 상피 세포의 증폭, 분화 및 동결보존 방법을 통해 낭포성 섬유증 맞춤 치료를 위한 CFTR 활성 평가 기술을 익히세요.

일차 인간 비강 상피 세포 : 정밀 의학의 맥락에서 바이오 뱅킹

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