호흡기 싱크량 바이러스의 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드의 생성 및 조립
2021년 7월 27일
호흡기 싱크량 바이러스(RSV) RNA 합성의 심층 기계분석의 경우, 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드(NC)의 후속 체외 조립을 위해 RNA-프리 뉴클레오프로틴(N0)의 공동발현을 위해 샤페론 인포단(P)을 활용하는 프로토콜을 보고한다.
이 방법은 RNA가 없는 N 단백질을 얻기 위해 또 다른 바이러스 단백질 N'을 위한 샤페론으로서 하나의 바이러스 성 단백질 P'를 사용하여 재조합 바이러스 단백질 발현 문제를 해결하는 다양한 방법을 활용합니다. RNA-free RSV N 단백질은 바이러스 특이적 RNA를 체외에서 뉴클레오캡시드로 조립하기 전에 수득된다. 이 방법은 또한 다른 비분할 음성 감각 RNA 바이러스와 함께 사용될 수 있다.
리칭 독립적 복제 방법은 공동 식 구문 수집을 위한 빠른 기술입니다. 왜 또는 선택 얼룩 전자 현미경은 원시 세포에서 큰 어셈블리를 확인하는 빠른 방법입니다. 우리는 당신에게 두 가지 팁을 제공하고 싶습니다.
먼저 다음 단계로 이동하기 전에 각 단계에 대해 높은 수율과 견고한 결과를 얻을 수 있습니다. 둘째, 크로마토그래피를 위한 적절한 프로그램을 설정하고 집게로 그리드를 픽업하는 연습을 실시합니다. N 및 P 공동 발현의 바이-시스트로닉 시공의 경우, LB 배지에서 E coli BL21DE3 균주 세포의 4리터 배양을 섭씨 37도에서 성장시킵니다.
600 나노미터의 광학 밀도가 0.6에 도달하면 온도를 섭씨 16도로 낮춥니다. 1 시간 후, 하룻밤 0.5 밀리머 IPTG로 치료에 의해 단백질 발현을 유도한다. 다음 아침, 원심분리에 의해 세포를 수집하고 리시스 버퍼의 200 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단.
3초, 펄스에서 3초 동안 초음파 처리로 셀을 lyse합니다. 그리고 원심분리에 의해 용액을 수집합니다. 상체를 2.5~10센티미터 코발트 중력 기둥에 적재하고 약 10밀리리터의 구슬을 장착합니다.
리시스 버퍼의 5 ~10 열 볼륨으로 미리 평형. 그리고 5개의 컬럼 부피의 완충B와 5권의 완충C로 컬럼을 세척하여 2량의 완충제 D를 사용하여 구슬에서 단백질을 엘로우트한다. 그리고 QA 버퍼의 5 밀리리터 볼륨으로 Q 열을 평형화합니다.
연동 펌프를 사용하여 희석된 샘플을 컬럼에 로드합니다. 로드된 Q 컬럼을 HPLC 기계에 녹여 신선한 QA 및 QB 버퍼를 사용할 수 있습니다. 펌프 세척을 실행하여 1~2권의 QB 및 QA 버퍼로 기계를 성공적으로 세척합니다.
마지막 세척 후, 분당 1 밀리리터로 유량을 설정하고 UV1을 280 나노미터 및 UV2내지 260 나노미터로 설정하고, 96 개의 깊은 우물 판을 사용하여 분획을 수집합니다. 그런 다음 용출제의 각 농도의 3 ~4 권의 단계적 그라데이션 응용 을 사용하여 단백질을 엘로우고 0 %QB 농도에서 시작하여 매번 비율을 5 %씩 증가시면 됩니다. N-0 P 단백질 복합체는 15% QB 완충농도로 응루된다.
젤 여과에 의해 단백질을 분리하고, 완충E로 평형화된 30센티미터 의 작은 스케일 정제 컬럼으로 SDS 페이지에 의해 분획을 함유한 단백질을 분석한다. 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드 어셈블리의 경우, 1시간 동안 실온에서 1:1.5 분자 비에서 RNA 올리고를 가진 정제된 N-0 P 콤플렉스를 혼합 및 배양한다. 버퍼 E.와 작은 규모의 정화 젤 여과 열을 미리 평형 및 원심분리에 의해 어떤 침전물을 제거합니다.
상체를 제외 크로마토그래피 컬럼 크기로 로드합니다. 그리고 단백질의 크기 배제 크로마토그래피 이미지를 RNA 어셈블리및 단백질 단독 대조시와 비교하여 핵산 순도 비율을 결합하여, 조립된 N RNA, N-0 P 및 자유 RNA의 피크를 식별한다. N RNA 복합체를 조립하기 위해, 모든 N RNA 피크 분획을 수집하고 RNA 추출을 수행하며, 특정 RNA의 길이를 다시 확인하기 위해 우레아 페이지 젤을 실행한다.
음의 얼룩 전자 현미경 검사법을 위한 음극그리드를 준비하려면 열판을 사용하여 5mL의 이중 증류수를 가열하여 끓이고 물에 37.5 밀리그램의 소라일 포메이트를 추가하여 0.75%의 uranyl 포메이트 염색 용액을 얻습니다. 용액을 알루미늄 호일 덮인 비커로 옮기. 그리고 10 개의 어금니 나트륨 수산화나트륨의 4 개의 마이크로 리터를 추가합니다.
빛으로부터 보호되는 15분 의 교반 후 0.22 미크론 필터를 통해 용액을 테스트 튜브로 필터링합니다. 연속 탄소 코팅 전자 현미경 그리드를 친성하게 만들기 위해 전력 공급 장치에 연결된 챔버에 그리드를 배치하고 음하전이 온기를 그리드에 적용합니다. 잘라 2 인치 파라필름 스트립으로 두 개를 접습니다.
스트립의 한쪽 끝에 증류수 40방울을 넣습니다. 그리고 다른 쪽 끝에 0.75%의 우라일 퍼메이트 스테인딩 용액의 2개의 40 마이크로리터 방울. 각 그리드에 3개의 마이크로리터단백질 샘플을 추가합니다.
1분 후, 그리드를 블로팅 용지에 대고 증류수 물방울에 두 번 담급하십시오. 그리고 첫 번째 염색 용액 방울에 한 번. 그런 다음 그리드를 두 번째 염색 솔루션 액적액에 30초 동안 담그고, 그리드를 블로팅 페이퍼에 대고 과도한 얼룩 용액을 제거하고 이미징 전에 그리드가 공기 건조하도록 합니다.
이 프로토콜을 이용하여, 대규모 수용성 이종염 기질 호흡기 동기화 바이러스 N0 P 복합체를 얻을 수 있다. 대장균에서는, P 단백질의 N 및 N단 부분의 전체 길이는 N 단백질에 대한 10 X His 태그로 공동 발현된다. UV 흡광도 핵산 순도비에 기초하여, N0 P는 전체 길이 N 및 N 단말 P를 모두 포함하지만 세포 RNA를 포함하지 않았다.
정제된 N0 P는 특정 RNA 올리고를 통해 배양을 통해 전자 현미경 그리드의 입자와 같은 뉴클레오캡시드로 자극되고 조립될 수 있다. 단백질을 정화할 때 컬럼 정화 시 기포를 피하고 샘플을 QA 버퍼로 희석하여 샘플을 컬럼에 적재하기 전에 pH 및 염 농도를 조절한다. 그리드를 오염하지 않도록 외부 가장자리에 전자 현미경 검사격자를 고정하십시오.
이것은 우리가 왼손잡이 또는 오른손잡이 발등 구조인지, 비 양성 RSV 게놈 포장 질문을 결정하는 것을 도울 것입니다. 이러한 절차및 RSV 중합효소 활성 분석법에 대한 RNA 템플릿을 본시 수행할 수 있다. 그리고 이러한 RSV 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드는 고분해능 극저온 EM 분석을 위해 사용될 수 있다.
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개요
이 기사는 RNA가 없는 핵단백질(N)의 채퍼론으로 인산 단백질(P)을 사용하여 호흡기 합병증 유발 바이러스(RSV) 핵심단백질체의 시험관 내 조립 방법을 제시합니다. 이 접근법은 재조합 바이러스 단백질 발현의 문제를 해결하며, 다른 비분절 음성 감각 RNA 바이러스에도 적용할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 바이러스학
- 분자 생물학
- 바이러스 단백질 발현
배경
- 호흡기 합병증 유발 바이러스(RSV)는 중요한 호흡기 병원체입니다.
- RSV RNA 합성을 이해하는 것은 치료 전략을 개발하는 데 중요합니다.
- 채퍼론 단백질은 바이러스 단백질의 적절한 접힘과 조립을 촉진할 수 있습니다.
- 재조합 바이러스 단백질을 효과적으로 발현하는 데 어려움이 있습니다.
연구 목적
- RSV 핵심단백질체 조립 프로토콜을 개발합니다.
- RNA가 없는 핵단백질(N)의 채퍼론으로 인산 단백질(P)을 사용합니다.
- 다른 비분절 음성 감각 RNA 바이러스에 적용 가능한 방법을 제공합니다.
사용된 방법
- 인산 단백질(P)과 RNA가 없는 핵단백질(N)의 동시 발현.
- 바이러스 특이적 핵심단백질체의 시험관 내 조립.
- 동시 발현 구성물 획득을 위한 연결 독립 클로닝.
- 조립된 구조를 시각화하기 위한 전자 현미경.
주요 결과
- RNA가 없는 RSV 핵단백질의 핵심단백질체 조립에 성공했습니다.
- P를 채퍼론으로 사용하는 효과를 입증했습니다.
- 이 방법은 다른 바이러스에 적용할 잠재력을 보여주었습니다.
- 전자 현미경으로 대형 구조의 조립을 확인했습니다.
결론
- 이 연구는 RSV 연구를 위한 귀중한 프로토콜을 제공합니다.
- 채퍼론 단백질을 사용하면 바이러스 단백질 발현을 향상시킬 수 있습니다.
- 이 방법은 비분절 음성 감각 RNA 바이러스에 대한 추가 연구를 촉진할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Authentic assembly of virus-specific nucleocapsids for respiratory syncytial virus (RSV) enables mechanistic interrogation of viral RNA synthesis, directly impacting early-stage target validation and assay development in antiviral R&D. This protocol overcomes longstanding challenges in generating RNA-free nucleoprotein complexes, supporting predictive confidence in virology workflows. The approach is broadly relevant for nonsegmented negative-sense RNA virus research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic dissection of viral RNA synthesis using authentic nucleocapsid substrates.
- Supports functional target validation by providing native-like ribonucleoprotein complexes.
- Facilitates biological de-risking for antiviral target selection and pathway analysis.
- Improves predictive confidence in early-stage virology research portfolios.
Screening & Assay Development
- Provides validated nucleocapsid complexes for downstream polymerase activity assays.
- Enables standardization and reproducibility in in vitro viral replication assays.
- Supports quantitative readouts for compound screening and mechanistic studies.
- Prepares robust biological systems for scalable assay platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro systems with disease-relevant viral replication mechanisms.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of antiviral strategies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by reducing mechanistic ambiguity.
- Facilitates high-resolution structural studies for translational biomarker identification.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and assay development, enabling transition from mechanistic hypothesis testing to quantitative screening and preclinical validation.
- Discovery Biology: Provides authentic nucleocapsid substrates for hypothesis-driven interrogation of viral replication.
- Screening: Delivers reproducible, standardized complexes for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurement of nucleocapsid assembly and RNA incorporation.
- Translational Research: Supports alignment with disease-relevant viral processes for preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for multiple nonsegmented negative-sense RNA viruses.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in antiviral target validation.
- Operational Value: Standardizes nucleocapsid preparation for reproducible, scalable workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of antiviral discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in recombinant protein expression and purification.
- Demands access to chromatography and electron microscopy infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducibility in complex assembly.
- Adaptable to other nonsegmented negative-sense RNA virus systems with protocol optimization.
- Dependent on precise control of RNA and protein stoichiometry for authentic assembly.
