Name: 호흡기 싱크량 바이러스의 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드의 생성 및 조립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 학습하세요 호흡기 싱크시티얼 바이러스(RSV) 뉴클레오캡시드의 체외 조립 방법을. 인산단백질(P)을 샤페론으로 활용하여 RNA 없는 뉴클레오단백질(N)을 조립하고 전자현미경으로 구조를 확인합니다. 이 기법은 비분절 음성센스 RNA 바이러스 연구에 활용됩니다.

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에모리의 리앙 연구소의 연구 프로그램은 미국 국립 일반 의학 연구소(NIGMS), 국립 보건원(NIH)이 수상 번호 R01GM130950에 따라 지원되며, 에모리 대학 의과 대학의 연구 스타트업 기금이 지원됩니다. 저자는 도움이 지원과 비판적 토론을 위해 Liang 연구소의 구성원을 인정한다.

1. 분자 복제
참고: 리가제 독립 복제(LIC)는 RSV 바이시스트로닉 공동발현 생성물 플라스미드를 만드는 데 사용되었습니다. LIC는 1990년대 초에 개발된 방법으로, T4 DNA 폴리머라제의 3'-5' 엑소 활성을 사용하여 벡터와 DNA인서트(21,22)사이의 상호 보완성을 가진 오버행을 생성한다. 구조는 오픈 리딩 프레임(ORF)(도 1)의 N 단말에서 10배 의 그의 태그로 구성된2BT-10벡터 DNA를 사용하여 만들어졌다.
<ol><li>SSPI 소화를 사용하여 LIC 벡터의 선형화를 수행합니다.<ol>
<li>SSPI 10X 버퍼 10μL, SSPI 효소 4μL을 5 U/μL 의 농도로 결합하고, 벡터 미니렙 DNA의 5 μg, 멸균 ddH2O ~ 100 μL을 결합합니다.</li>
		<li>37°C에서 3시간 동안 소화를 배양합니다.</li>
		<li>벡터 DNA의 추출을 위해 1.0% 아가로즈 젤에서 다이제스트를 실행합니다.</li>
		<li>겔 추출 키트를 사용하여 추출 및 정제를 수행합니다. ddH2O의 30 μL에서 벡터 DNA의 최종 부피를 일시 중단하고 -20 °C에 저장합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>N1-391 포워드 프라이머, N1-391 리버스 프라이머, P 1-126 포워드 프라이머 및 P 1-126 역프라이머(표1)를사용하여 N1-391 및 P1-126에 대한 DNA 삽입을 준비한다. 참고: 55°C와 60°C 사이의 용융 온도를 보장하기 위해 선형화된 벡터와 충분한 중복이 있습니다. 역프라이머의 경우 동일한 이유로 선형화된 벡터의 역 보완 가닥과 충분한 중복이 있습니다.<ol>
<li>표 2 및 표 3의조건을 사용하여 DNA 삽입의 PCR 증폭을 수행한다.</li>
		<li>증폭된 DNA 삽입물을 추출합니다. 1.0% 아가로즈 젤에서 이전 단계에서 PCR 제품을 실행한 다음 젤 추출하여 밴드를 추출하고 정화합니다. ddH2O의 15 μL에서 추출된 DNA의 최종 부피를 일시 중단합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>벡터의 T4 DNA 중합체 치료 및 삽입DNA(표 4). 참고: 벡터 DNA 및 삽입 DNA에 대해 별도로 치료수행해야 합니다.<ol>
<li>상온에서 40분 동안 혼합물을 배양합니다. 이어서, 20분 동안 75°C에서 중합효소를 열비활성화한다. 반응 혼합물을 -20°C에 보관합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>LIC 벡터와 인서드 벡터를 음침합니다.<ol>
<li>LIC 벡터 DNA 2μL 및 멸균 ddH2O의 2 μL로 음수 제어를 설정합니다.</li>
		<li>0.2mL 튜브에서 이전 T4 DNA 폴리머라제 반응으로부터 삽입 DNA 2μL및 LIC 벡터 DNA 2 μL을 결합합니다.</li>
		<li>실온에서 10분 동안 어닐링 반응을 수행합니다.</li>
		<li>25 mM의 농도에서 EDTA의 1.3 μL로 반응을 담금질.</li>
		<li>대장균 Top10 유능한 세포의 100 μL로 반응을 변환하고 암피실린 선택플레이트(23,24)에판판한다.</li>
	</ol></li>
	<li>양수 구문 식별합니다.<ol>
<li>플라스미드 미니프레플 솔루션을 준비합니다. 이것은 LB 매체에 있는 식민지 따기 그리고 접종을 통해 행해질 수 있습니다. 보통, 3 식민지는 충분하다.</li>
		<li>37°C에서 하룻밤 동안 혼합물을 배양한다.</li>
		<li>10 분 동안 4,560 x g에서 혼합물을 원심 분리하고 상체를 폐기하십시오.</li>
		<li>P1 버퍼의 250 μL에서 펠릿을 다시 중단하고 스핀 미니프렙 키트를 사용하여 플라스미드 미니프렙을 준비합니다.</li>
		<li>AseI 또는 기타 제한 효소를 사용하여 미니프준비 제품의 소화 분석을 수행한다.</li>
		<li>0.8% 아가로즈 젤에 샘플을 적재하고 소화된 플라스미드를 실행합니다. UV 램프 아래에서 젤을 분석합니다.</li>
		<li>시퀀싱 서비스를 사용하여 양수 제품의 시퀀스를 검증합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>공동 발현 DNA 삽입을 가져옵니다.<ol>
<li>PCR을 수행하여 이전에 제작된 2BT-10 N1-391 및 2BT-10 P1-1-126을 템플릿으로 사용하여 N1-391 및 P1-126을 획득한다.</li>
		<li>N1-1-391 포워드 프라이머와 역프라이머 5'GTGAAGATCCTGATGCGGGGGGGGGGGCG와 함께 표 2 및 표 3의 PCR 조건을 사용하여 2BT-10 N1-391 구조에서 N1-391을 획득하기 위해 1st PCR을 수행 CGCCGCGATCGCGGATCC-3'.</li>
		<li>2nd PCR을 수행하여 2BT-10 P1-126 구체에서 포워드 프라이머를 사용하여 P1-126을 획득합니다: 5'-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATTCACTGC AGGACTCGAGTTCTAGA-3'and P1-126 역 프라이머 (표 2 및 표 3에서PCR 조건을 사용).</li>
		<li>마지막으로, N1-391 및 P1-126을병합하기 위해 이전 2 PCR 반응의 혼합 제품에 PCR중복 PCR을 수행한다. N1-391 포워드 프라이머와 P1-126 역 프라이머를 사용합니다. 표 5 및 표 6에서PCR 조건을 사용합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>벡터와 DNA 삽입에 참여합니다.<ol>
<li>1.3 단계에서 프로토콜에 따라 T4 DNA 폴리머라제와 겹치는 PCR 제품을 치료한다.</li>
		<li>1.4 단계에서 프로토콜에 따라 LIC 벡터 및 PCR 제품을 음침합니다.</li>
		<li>1.5 단계에서 프로토콜 에 이어 양수 구문들을 식별합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 단백질 발현 및 정제
참고: 대장균을 사용하여 37°C에서 N 과 P. 배양 세포의 공동 발현을 모두 의한 이중 시스트로닉 구조에 사용하지만, 하룻밤 사이에 감소된 온도(16°C)에서 발현을 수행한다. 코발트 컬럼, 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피(그림2)의조합을 통해 단백질 복합체를 정화한다.
<ol><li>단백질 생산을 위해 대장균 BL21(DE3) 균주를 사용하십시오. ODI600이 0.6에 도달할 때까지 LB(Luria Broth) 배지에서 37°C에서 4L 세포 배양을 성장시다.</li>
	<li>온도를 16°C로 낮춥춥습니다. 한 시간 후, 0.5 mM 이소프로필 1-티오-D-갈라크토피라노사이드(IPTG)로 하룻밤 사이에 식을 유도한다.</li>
	<li>25 분 동안 4,104 x g에서 세포를 원심 분리 한 다음 상체를 폐기하십시오.</li>
	<li>리시스 완충제 A의 200mL에서 세포 펠릿을 재연하여 (50mMM 나트륨 인산염, pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 mM 이미다졸, 10% 글리세롤 및 0.2% NP40). 50mL의 용해 버퍼를 사용하여 세포 배양의 1 L에서 세포 펠릿을 재보일시 합니다.</li>
	<li>15분, 3초, 3초 쉬기 동안 초음파 처리로 셀을 lyse합니다. 그런 다음 원심 분리기 세포는 37,888 x g에서 40 분 동안. 참고: 프로토콜은 -80°C 냉동고에서 초음파 처리 전에 세포를 동결하여 일시 중지할 수 있습니다.</li>
	<li>상체를 코발트 중력 기둥(직경 x 길이: 2.5cm x 10cm)에 로드하고 - 10mL의 비드를 용해 버퍼의 5-10 컬럼 볼륨(CV)으로 미리 평가한다.</li>
	<li>5 CV 버퍼 B(50m Tris-HCl pH 7.4, 1M NaCl, 10% 글리세롤, 5m mM imidazole)와 5 CV(50m Tris-HCl pH 7.4, 500mM MM NaCl, 10% 글리세롤, 5mm imidim)로 컬럼을 세척합니다.</li>
	<li>완충D 2CV(50m Tris-HCl pH 7.4, 500mMM NaCl, 250mM imidazole)를 사용하여 구슬로부터 단백질을 엘테.</li>
	<li>Q 컬럼에 대해 QA 버퍼(50m Tris-HCl pH 8.0, 5% 글리세롤)로 동경의 단백질 5배희석을 희석시켰다.</li>
	<li>Q 컬럼5mL을 QA 버퍼로 세척하여 열을 양립한 다음 연동 펌프(예: 토끼)를 사용하여 희석된 샘플을 Q 컬럼에 로드합니다.</li>
	<li>Q 컬럼을 QA 버퍼 및 QB 버퍼(50m Tris-HCl pH7.4, 1.5M NaCl, 5% 글리세롤)와 함께 HPLC 기계에 로드합니다. 유량을 1mL/분으로 설정합니다.</li>
	<li>"펌프 워시" 프로그램을 실행하여 QB 버퍼로 기계를 세척하고 QA 버퍼(각각 1-2CV/각)를 세척합니다. 시스템 흐름을 3mL/분으로 설정합니다.</li>
	<li>UV1을 280nm로 설정하고 UV2를 260 nm로 설정합니다. 96 개의 깊은 우물 플레이트를 사용하여 분획을 수집합니다.</li>
	<li>각 농도의 3-4 CV를 적용한 용출제(QB 버퍼)의 단계별 그라데이션을 사용하는 엘루트 단백질은 0% QB부터 매번 백분율을 5% 증가시다. N0P 단백질 복합체는 15% QB 버퍼로 나올 것입니다.</li>
	<li>모든 단백질이 용출되면 컬럼을 100% QB 버퍼(2 CV)로 세척합니다.</li>
	<li>젤 여과 Superdex 200 증가 10/300 GL 컬럼 (직경 x 길이: 1.0 cm x 30cm) 및 완충 E (20 m M HEPES pH 7.4 및 200 mM NaCl)와 평형.</li>
	<li>SDS-PAGE를 통해 단백질 함유 분수를 분석합니다.</li>
</ol>3. 바이러스 별 NC의 시험관 내 조립
참고: RSV 특이적 NC(N:RNA)의 체외 조립은 RNA 올리고스를 통해 준비된 N0P 콤플렉스를 배양함으로써 수행되었다. 이어서, SEC 크로마토그래피는 N0P 및 과잉 RNA(도2)로부터어셈블리 콤플렉스를 분리하는 데 사용되었다.
<ol><li>1시간 동안 실온에서1:1.5의 분자비를 RNA 올리고와 혼합 및 배양하고, 보통 1 mg/mL의 농도를 가진 단백질 N0P의 1mL은 다음 단계에 충분하다. 동일한 양의 N0P 단백질만 포함하는 대조군 샘플을 설정합니다.</li>
	<li>젤 여과 Superdex 200 버퍼 E (20m HEPES, pH 7.4, 200 mM NaCl)로 10/300 GL 컬럼을 미리 평형화합니다.</li>
	<li>15분 동안 21,130 x g의 샘플을 원심분리하고 침전을 제거하고 SEC 열에 상류체를 로드합니다.</li>
	<li>N:RNA 어셈블리 샘플 및 N0P 대조군 샘플의 SEC 크로마토그래피 이미지를 비교하고, A260/A280 비율을 결합하여 조립된 N-RNA, N0P 및 무료 RNA의 피크를 식별합니다.</li>
	<li>피크 분수를 수집하거나, SDS-PAGE 젤을 실행하거나, 그리드를 만듭니다.</li>
	<li>조립 N-RNA 복합체의 경우, N-RNA 피크의 모든 분획을 수집하고, RNA 추출을 수행하여 요레아 페이지 겔을 실행하여 첫 번째 단계에서 혼합 및 배양과 동일한 특정 RNA의 길이를 다시 확인한다.</li>
</ol>4. 부정적인 얼룩 그리드 만들기
참고: 음의 얼룩 전자 현미경 검사법(EM)은 분자가 탄소 필름에 흡착된 다음 중금속 원자층에 내장되는 방법입니다. 네거티브 스테인 EM은 높은 이미지 콘트라스트를 생성하여 입자를 쉽게 보고 계산적으로 정렬합니다. 또 다른 장점은 탄소 필름에 입자의 흡착은 일반적으로 몇 가지 바람직한 방향으로 그리드에 부착하는 분자를 유도한다는 것입니다. 분자가 유사한 방향으로 있을 때, 구조적으로 구별되는 병과로 분리하는 것은 쉽습니다. 따라서 음의 얼룩 EM은 시료준비(25,26)를 안내하는 적절한기술이다(도 3).
<ol><li>작은 유리 비커에 5mL의 ddH2O를 전자레인지 또는 가열하여 끓일 때까지 가열합니다.</li>
	<li>37.5 mg의 우라젤 포메이트를 계량하고 가열 된 ddH2O5 mL에 추가하여 0.75 % uranyl formate 염색 용액을 만듭니다. 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일 덮인 비커 아래에서 저어주세요.</li>
	<li>염색 용액에 10M NaOH의 4 μL을 추가하고 빛으로부터 보호된 15분 동안 계속 저어줍니다.</li>
	<li>0.22mm 필터를 통해 용액을 테스트 튜브로 필터링합니다.</li>
	<li>연속 탄소 코팅 EM 그리드 를 만들기 위해 글로우 방전을 사용(27) 참고: 그리드는 전원 공급 장치에 연결된 챔버 내부에 배치됩니다. 고전압이 적용되면 챔버 내의 가스가 이온화되고, 음전하 이온이 탄소 그리드에 증착되어 친수성으로 만듭니다.</li>
	<li>파라필름 스트립을 자르고 접습니다. 파라필름 의 한쪽에 버퍼의 40 μL의 파이프 2 방울, 다른 쪽에 염색 용액의 40 μL의 또 다른 2 방울을 피펫.</li>
	<li>EM 탄소 그리드를 만들려면 단백질 샘플 3μL을 1분간 적용하십시오.</li>
	<li>블로팅 용지에 그리드를 블롯합니다. 참고: 그리드는 버퍼로 2배, 각 단계마다 0.75% 우라일 포메이트 스테인링 용액으로 1배 세척됩니다.</li>
	<li>그리드 표면을 0.75% 우라일 포메이트 스테인딩 용액의 두 번째 낙하에서 30초 동안 유지합니다.</li>
	<li>그리드를 블로팅 용지에 블롯하여 과도한 얼룩 용액을 제거하고 그리드가 공기 건조하도록 합니다.</li>
	<li>이미징 하기 전에 그리드 상자에 그리드를 저장 합니다.</li>
</ol>

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비분할 음성 감지(NNS) RNA 바이러스의 공지된 뉴클레오캡시드 형 입자(NCLP) 구조는 조립된 NCLP가 세균성 또는 진핵발현시스템(15,16,17,18,19)에서과발현될 때 숙주 세포 RNA를 가진 복잡한 N임을 보여준다. 이전 연구는 RNase A 소화, 높은 염분 세척, 또는 비특이적 세포RNA(28,29)를제거하기 위해 상이한 pH 버퍼를 조정하는 등 다양한 방법으로 RNA 무료 N을 얻으려고 시도했다. 그러나, 상기 방법 중 어느 것도 바이러스 특이적 NC의 어셈블리에 성공적으로 사용될 수 없다. RNA 가 없는 RSV N...

비분할 음성 감각(NNS) RNA 바이러스는 광견병, 에볼라 및 호흡 싱크바이러스(RSV)1,2와같은 많은 중요한 인간 병원균을 포함한다. RSV는 전 세계3명의어린이와 노인의 기관지염 및 폐렴과 같은 호흡기 질환의 주요 원인입니다. 현재, RSV4를예방하거나 치료하기 위해 효과적인 백신이나 항바이러스 요법을 사용할 수 없다. 수명 주기의 일환으로, RSV 게놈은 RSV RNA 의존RNA 폴리머라제에 의한 복제를 위한 템플릿으로서 작용하여 항게놈을 생성하며, 이는 차례로 자손 게놈을 생성하는 템플릿으로서 작용한다. 게놈 및 항게놈 RNA는 뉴클레오캡시드(N)를 형성하기 위해 뉴클레오프로틴(N)에 의해 완전히 캡슐화되어3. NC는 RSV 폴리머라제에 의한 복제 및 전사 모두에 대한 템플릿역할을 하기 때문에, 적절한 NC 어셈블리는 중합체가 RNA 합성5에대한 템플릿에 접근하는 것이 중요하다. 흥미롭게도, NNS 바이러스 성 중합체의 구조적 분석에 기초하여, 몇몇 N 단백질이 RNA 합성 후 RNA에 중합효소의 접근을 허용하고 RNA에 재결합하기 위해여러 N 단백질이 과도하게 해리되고 RNA6,7,8,9,10,11,12가가설된다.
현재, RSV RNA 중합 분석은 짧은 알몸 RNA템플릿(13,14)에정제된 RSV 폴리머라제를 사용하여 확립되었다. 그러나, RSV 폴리머라제의 활동은 알몸 RNA 템플릿을 사용할 때 RSV 폴리머라제에 의해 생성된 비공정 및 중단 성 제품에서 관찰된 바와 같이 최적에 도달하지 못한다. 바이러스 특이적 RNA를 가진 NC의 부족은 RSV RNA 합성의 추가 기계론적인 이해를 위한 1 차적인 장벽입니다. 따라서, 본격적인 RNA 템플릿을 사용하는 것은 RSV RNA 합성의 근본적인 지식을 발전시키기 위하여 중요한 필요가 된다. RSV 및 기타 NNS RNA 바이러스로부터뉴클레오캡시드 유사 입자(NCLPs)의 공지된 구조는 NCLP내의 RNA가 임의의 세포 RNA 또는 평균 바이러스 게놈 RNA15,16,17,18,19임을드러낸다. 함께, 주요 장애물은 N이 호스트 세포에서 과발현될 때 N이 NCLP를 형성하기 위하여 세포 RNA에 비특이적 결합한다는 것입니다.
이러한 장애물을 극복하기 위해, 우리는 먼저 RNA가없는 (N0)을얻고 NCLPs20에정통 바이러스 게놈 RNA와 N0을 조립하는 프로토콜을 설립했다. 이 프로토콜의 원리는 RSV 인포프로틴(PNTD)의N-단자 도메인인 샤페론과 N을 공동 발현함으로써 다량의 재조합 RNA-free N(N0)을획득하는 것이다. 정제된 N0P는 RSV 특이적 RNA 올리고를 첨가하여 NCLPs로 자극및 조립될 수 있으며, 조립 과정에서, 샤페론 PNTD는 RNA 올리고스의 첨가시 변위된다.
여기서는 RSV RNA 특이적 NC의 생성 및 조립을 위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 분자 복제, 단백질 제제, 시험관 내 조립 및 복잡한 조립의 유효성검사를 설명합니다. 분자 복제를 위한 단백질 공동발현을 위한 바이-시스트로닉 구조를 생성하는 복제 전략을 강조합니다. 단백질 제제를 위해, 우리는 세포 배양, 단백질 추출 및 단백질 복합체의 정제의 절차를 설명합니다. 그런 다음 RSV RNA 특이적 종크의 체외 조립 방법을 논의합니다. 마지막으로, 당사는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)와 음수 얼룩 전자 현미경(EM)을 사용하여 조립된 NCLP의 특성화 및 시각화를 합니다.

<table><tbody><tr><td>아가로스</td><td>SIgma</td><td>A9539-500G</td><td>LIC 방법을 사용한 구조물</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 원심 필터 유닛</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td>단백질 시료</td></tr><tr><td>암피실린 나트륨</td> 농축 <td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>5118.111317A</td><td>세포 배양을 위한 항생제</td></tr><tr><td>AseI</td><td>NEB</td><td>R0526S</td><td>LIC 요법</td></tr><tr><td>코발트 제조용 구조물 (고밀도) Agarose Beads</td><td>Gold Bio</td><td>H-310-500</td><td>His-tag 단백질의 정제를 위해</td></tr><tr><td>Corning LSE 디지털 드라이 배스 히터</td><td>CORNING</td><td>6885-DB</td><td>Heate 샘플</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Invitrogen</td><td>10217016</td><td>LIC 방법을 사용하여 구조물</td></tr><tr><td>dGTP</td><td>Invitrogen</td><td>10218014</td><td>LIC 방법을 사용하여 구조물</td></tr><tr><td>제작 Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516-4L</td><td>용액</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-100G</td><td>제조 용액</td></tr><tr><td>HiTrap Q HP</td><td>Sigma</td><td>GE29-0513-25</td><td>단백질 정제</td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>Sigma</td><td>I5513-100G</td><td>용액</td></tr><tr><td>IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)</td> <td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>1116.071717A</td>는 단백질 마이크로 원심 분리기 튜브<td>의 발현을 유도</td></tr>합니다<tr><td>.</td><td>PCR용</td> <td>VWR</td><td>47730-598</td></tr><tr><td>Misonix Sonicator XL2020 초음파 액체 프로세서</td><td>SpectraLab</td><td>MSX-XL-2020</td><td>세포 용해용 초음파 발생기</td></tr><tr><td>음성 염색 그리드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>CF400-Cu-TH</td><td>음성 염색 그리드 제작용</td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 44/44R</td><td>eppendorf</td><td>M1282-0000</td><td>Shaker 세포 배양용</td></tr><tr><td>Nonidet P 40 대체</td><td>Sigma</td><td>74385-1L</td><td>제조 용액</td></tr><tr><td>OneTaq DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0480L</td><td>PCR</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td>Purify DNA</td></tr><tr><td>SSPI-HF</td><td>NEB</td><td>R3132S</td><td>LIC 방법을 사용하여 제작</td></tr><tr><td>구조 Superose 6 Increase 10/300 GL</td><td>Sigma</td><td>GE29-0915-96</td><td>단백질 정제</td></tr><tr><td>T4 DNA 중합효소</td><td>Sigma</td><td>70099-3</td><td>LIC 방법을 사용하여 구성</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus 원심분리기</td><td>Fisher Scientific</td><td>36-101-0816</td><td>원심분리기, 최고 속도 20,000rpm</td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>T3253-250G</td><td>제조 용액</td></tr><tr><td>Uranyl Formate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22451</td><td>음성 염색 용액 만들기</td></tr></tbody></table>

호흡기 싱크량 바이러스의 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드의 생성 및 조립

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

본격적인 RNA 템플릿의 사용은 바이러스학의 기계성 발견과 분석 개발을 모두 안내 할 수있는 바이러스 RNA 합성의 기본 지식을 발전시키는 데 중요합니다. 호흡기 싱크로바이러스(RSV)와 같은 비분할 음성감각(NNS) RNA 바이러스의 RNA 템플릿은 RNA 분자만이 아니라 오히려 리보뉴클레오단백질 복합체를 캡슐화한 뉴클레오단백질(N)이다. 본격적인 RNA 템플릿의 중요성에도 불구하고, 이러한 리보뉴클레오단백질 복합체의 생성 및 조립은 정교하게 유지되고 심층적인 용해가 필요합니다. 주요 과제는 과발현된 RSV N이 임의의 뉴클레오캡시드 와 같은 입자(NCLPs)를 형성하기 위해 세포 RNA에 비특이적 결합한다는 것입니다. 여기서, 먼저 n을 샤페론 인포단(P)으로 공동 발현한 다음, RNA 올리고스와 함께N0을 조립하여 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드(NC)를 획득하는 프로토콜을 확립하였다. 이 프로토콜은 이 전통적으로 도전적인 바이러스성 리보뉴클레오단백질 복합체의 준비에 있는 어려움을 극복하는 방법을 보여줍니다.

RNA 가 없는 N0P 단백질의 정제 이 프로토콜을 사용하면 대규모 용해성 RSV N0P 복합체를 얻을 수 있습니다. P 단백질의 N 및 N 말단 부분의 전체 길이는 대장균에서N 단백질에 대한 10배 의 His-Tag로 공동 발현되었다. N0P는 코발트 컬럼, 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. N0P는 전길이 N 및 N 단자 P를 모두 포함하지만 UV 흡광도 A260/A 280비20(도 4)에기초한 세포 RNA를 포함하지 않았다.
N-RNA의 조립 및 부정적인 얼룩으로 확인 그런 다음 정제된 N0P가 특정 RNA 올리고를 배양하여 Nuceloplasmid와 ...

호흡기 싱크량 바이러스(RSV) RNA 합성의 심층 기계분석의 경우, 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드(NC)의 후속 체외 조립을 위해 RNA-프리 뉴클레오프로틴(N0)의 공동발현을 위해 샤페론 인포단(P)을 활용하는 프로토콜을 보고한다.

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

이 방법은 RNA가 없는 N 단백질을 얻기 위해 또 다른 바이러스 단백질 N'을 위한 샤페론으로서 하나의 바이러스 성 단백질 P'를 사용하여 재조합 바이러스 단백질 발현 문제를 해결하는 다양한 방법을 활용합니다. RNA-free RSV N 단백질은 바이러스 특이적 RNA를 체외에서 뉴클레오캡시드로 조립하기 전에 수득된다. 이 방법은 또한 다른 비분할 음성 감각 RNA 바이러스와 함께 사용될 수 있다.리칭 독립적 복제 방법은 공동 식 구문 수집을 위한 빠른 기술입니다. 왜 또는 선택 얼룩 전자 현미경은 원시 세포에서 큰 어셈블리를 확인하는 빠른 방법입니다. 우리는 당신에게 두 가지 팁을 제공하고 싶습니다.먼저 다음 단계로 이동하기 전에 각 단계에 대해 높은 수율과 견고한 결과를 얻을 수 있습니다. 둘째, 크로마토그래피를 위한 적절한 프로그램을 설정하고 집게로 그리드를 픽업하는 연습을 실시합니다. N 및 P 공동 발현의 바이-시스트로닉 시공의 경우, LB 배지에서 E coli BL21DE3 균주 세포의 4리터 배양을 섭씨 37도에서 성장시킵니다.600 나노미터의 광학 밀도가 0.6에 도달하면 온도를 섭씨 16도로 낮춥니다. 1 시간 후, 하룻밤 0.5 밀리머 IPTG로 치료에 의해 단백질 발현을 유도한다. 다음 아침, 원심분리에 의해 세포를 수집하고 리시스 버퍼의 200 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단.3초, 펄스에서 3초 동안 초음파 처리로 셀을 lyse합니다. 그리고 원심분리에 의해 용액을 수집합니다. 상체를 2.5~10센티미터 코발트 중력 기둥에 적재하고 약 10밀리리터의 구슬을 장착합니다.리시스 버퍼의 5 ~10 열 볼륨으로 미리 평형. 그리고 5개의 컬럼 부피의 완충B와 5권의 완충C로 컬럼을 세척하여 2량의 완충제 D를 사용하여 구슬에서 단백질을 엘로우트한다. 그리고 QA 버퍼의 5 밀리리터 볼륨으로 Q 열을 평형화합니다.연동 펌프를 사용하여 희석된 샘플을 컬럼에 로드합니다. 로드된 Q 컬럼을 HPLC 기계에 녹여 신선한 QA 및 QB 버퍼를 사용할 수 있습니다. 펌프 세척을 실행하여 1~2권의 QB 및 QA 버퍼로 기계를 성공적으로 세척합니다.마지막 세척 후, 분당 1 밀리리터로 유량을 설정하고 UV1을 280 나노미터 및 UV2내지 260 나노미터로 설정하고, 96 개의 깊은 우물 판을 사용하여 분획을 수집합니다. 그런 다음 용출제의 각 농도의 3 ~4 권의 단계적 그라데이션 응용 을 사용하여 단백질을 엘로우고 0 %QB 농도에서 시작하여 매번 비율을 5 %씩 증가시면 됩니다. N-0 P 단백질 복합체는 15% QB 완충농도로 응루된다.젤 여과에 의해 단백질을 분리하고, 완충E로 평형화된 30센티미터 의 작은 스케일 정제 컬럼으로 SDS 페이지에 의해 분획을 함유한 단백질을 분석한다. 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드 어셈블리의 경우, 1시간 동안 실온에서 1:1.5 분자 비에서 RNA 올리고를 가진 정제된 N-0 P 콤플렉스를 혼합 및 배양한다. 버퍼 E.와 작은 규모의 정화 젤 여과 열을 미리 평형 및 원심분리에 의해 어떤 침전물을 제거합니다.상체를 제외 크로마토그래피 컬럼 크기로 로드합니다. 그리고 단백질의 크기 배제 크로마토그래피 이미지를 RNA 어셈블리및 단백질 단독 대조시와 비교하여 핵산 순도 비율을 결합하여, 조립된 N RNA, N-0 P 및 자유 RNA의 피크를 식별한다. N RNA 복합체를 조립하기 위해, 모든 N RNA 피크 분획을 수집하고 RNA 추출을 수행하며, 특정 RNA의 길이를 다시 확인하기 위해 우레아 페이지 젤을 실행한다.음의 얼룩 전자 현미경 검사법을 위한 음극그리드를 준비하려면 열판을 사용하여 5mL의 이중 증류수를 가열하여 끓이고 물에 37.5 밀리그램의 소라일 포메이트를 추가하여 0.75%의 uranyl 포메이트 염색 용액을 얻습니다. 용액을 알루미늄 호일 덮인 비커로 옮기. 그리고 10 개의 어금니 나트륨 수산화나트륨의 4 개의 마이크로 리터를 추가합니다.빛으로부터 보호되는 15분 의 교반 후 0.22 미크론 필터를 통해 용액을 테스트 튜브로 필터링합니다. 연속 탄소 코팅 전자 현미경 그리드를 친성하게 만들기 위해 전력 공급 장치에 연결된 챔버에 그리드를 배치하고 음하전이 온기를 그리드에 적용합니다. 잘라 2 인치 파라필름 스트립으로 두 개를 접습니다.스트립의 한쪽 끝에 증류수 40방울을 넣습니다. 그리고 다른 쪽 끝에 0.75%의 우라일 퍼메이트 스테인딩 용액의 2개의 40 마이크로리터 방울. 각 그리드에 3개의 마이크로리터단백질 샘플을 추가합니다.1분 후, 그리드를 블로팅 용지에 대고 증류수 물방울에 두 번 담급하십시오. 그리고 첫 번째 염색 용액 방울에 한 번. 그런 다음 그리드를 두 번째 염색 솔루션 액적액에 30초 동안 담그고, 그리드를 블로팅 페이퍼에 대고 과도한 얼룩 용액을 제거하고 이미징 전에 그리드가 공기 건조하도록 합니다.이 프로토콜을 이용하여, 대규모 수용성 이종염 기질 호흡기 동기화 바이러스 N0 P 복합체를 얻을 수 있다. 대장균에서는, P 단백질의 N 및 N단 부분의 전체 길이는 N 단백질에 대한 10 X His 태그로 공동 발현된다. UV 흡광도 핵산 순도비에 기초하여, N0 P는 전체 길이 N 및 N 단말 P를 모두 포함하지만 세포 RNA를 포함하지 않았다.정제된 N0 P는 특정 RNA 올리고를 통해 배양을 통해 전자 현미경 그리드의 입자와 같은 뉴클레오캡시드로 자극되고 조립될 수 있다. 단백질을 정화할 때 컬럼 정화 시 기포를 피하고 샘플을 QA 버퍼로 희석하여 샘플을 컬럼에 적재하기 전에 pH 및 염 농도를 조절한다. 그리드를 오염하지 않도록 외부 가장자리에 전자 현미경 검사격자를 고정하십시오.이것은 우리가 왼손잡이 또는 오른손잡이 발등 구조인지, 비 양성 RSV 게놈 포장 질문을 결정하는 것을 도울 것입니다. 이러한 절차및 RSV 중합효소 활성 분석법에 대한 RNA 템플릿을 본시 수행할 수 있다. 그리고 이러한 RSV 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드는 고분해능 극저온 EM 분석을 위해 사용될 수 있다.

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연구

JoVE Journal

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리프트 밸리 열병 바이러스 MP - 12 백신 스트레인에 대한 역방향 유전 시스템은 증가 감쇄 및 immunogenicity로 추가 MP - 12 돌연변를 만들기위한 유용한 도구입니다. 우리는 NSS 돌연변이 변종을 생성하고 특성화 프로토콜을 설명합니다.

리프트 밸리 열병 바이러스 백신 안전 및 효능을 향상하기 위해 MP - 12 스트레인의 NSS 진을 조작하는 역방향 유전자를 사용하여

를 통해 식물 세포에 여러 바이러스 구성 요소의 배포를 동기화하는 간단하고 효율적이며 강력한...

간편하고 강력한 생체내에서과 체외에서</em바이러스 조립 유학을위한> 접근법

이 비디오는 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 대한 중화 항체를 측정하기 위한 분석을 보여줍니다. RSV 중화 항체가 포함된 혈청을 사용한 사전 배양은 바이러스 입자를 중화하여 세포 감염 및 플라크 형성을 줄입니다. 그런 다음 바이러스에 감염된 세포는 플라크 시각화를 위해 고정, 차단 및 형광단 접합 항체 표지를 받습니다. 이 과정을 통해 RSV의 50%를 중화하는 가장 높은 혈청 희석액을 식별할 수 있으며, 이는 중화 역가를 나타냅니다.

호흡기 세포융합 바이러스에 특이적인 중화항체 역가를 측정하기 위한 분석

인간 호흡기 세포융합 바이러스(HRSV)는 어린 유아에게 심각한 세기관지염을 유발할 수 있습니다. 중증 HRSV 질환의 발병 기전 중 일부는 숙주 면역 반응에 의해 발생합니다. HRSV를 이용한 일차 인간 면역 세포의 자극은 염증 경로 및 감염의 활성화를 연구하기 위한 빠르고 재현 가능한 모델 시스템을 제공합니다.

인간 호흡기 세포융합 바이러스 감염에 대한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 면역 반응을 연구하기 위한 체외 모델

여기에서는 일본뇌염 바이러스의 양성 가닥 게놈 RNA의 전체 길이 cDNA를 포함하는 감염성 박테리아 인공 염색체를 만들기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 다른 양성 가닥 RNA 바이러스의 기능적 cDNA를 구성하는 데 사용할 수 있어 바이러스 생물학 연구를 위한 강력한 게놈 도구입니다.

세균 인공 염색체 : RNA 바이러스 양성 가닥의 연구에 대한 기능 유전체학 도구

여기서는 배큘로 바이러스 또는 포유류 발현 시스템, 및 초 원심 정제를 사용하여 바이러스 입자의 합성을위한 프로토콜을 제시한다. 이것은 매우 최적화 방법은 안전하고 유연하게 타겟으로 백신 바이러스 항원을 확인하는 데 사용된다.

표현과 예방 접종에 대한 바이러스 입자의 정제

여기, 우리가 현재 높게 병원 성 바이러스 중동 호흡기 증후군, 중증 급성 호흡기 증후군 coronaviruses의 스파이크 단백질을 통합 하는 BSL-2 설정에 pseudotyped 입자를 생성 하는 프로토콜. 이러한 pseudotyped 입자 포함 대상 호스트 세포에 바이러스 항목의 정량화를 허용 luciferase 취재 원 유전자.

Biosafety 수준 2 설정에 높게 병원 성 Coronaviruses 공부 Pseudotyped 입자의 생산

높은 처리량,이 연구에 설명 합니다 호흡 syncytial 바이러스 (RSV)에 대 한 특정 중화 항 체 titer를 확인 하려면 이미징 기반 마이크로 중화 분석 결과. 이 분석 결과 형식은 다른 샘플 형식에 대해 테스트 되었습니다.

향상 된 높은 처리량 호흡 Syncytial 바이러스 (RSV) 마이크로 중화 분석 결과

우리를 생성 하는 방법을 설명 하 고 RSVs에 대 한 호흡 syncytial 바이러스 (RSVs)와 최적화 된 패 분석 결과 수정 유전자 증폭. 우리는 두 재조합 바이러스는 각각 RSV 복제의 정량화를 허용 하 고 라이브 RSV 포함 몸과 포함 시체 관련 된과 립 역동성의 분석을 생성 하 여이 프로토콜을 설명 합니다.

생성, 증폭 및 재조합 호흡 Syncytial 바이러스의 적정

우리는 실제 바이러스를 밀접하게 모방한 SARS-CoV-2 바이러스 유사 입자를 생성하기 위해 최적화된 체외 프로토콜을 제시합니다. 이 접근 방식을 사용하면 생물 안전성 레벨 3 실험실이 필요한 제약 없이 바이러스 감염, 조립 및 배출 메커니즘을 조사할 수 있습니다.

In Vitro 바이러스 수명 주기를 조사하기 위한 입자 시스템과 같은 SARS-CoV-2 바이러스 생산

학습하세요 호흡기 싱크시티얼 바이러스(RSV) 뉴클레오캡시드의 체외 조립 방법을. 인산단백질(P)을 샤페론으로 활용하여 RNA 없는 뉴클레오단백질(N)을 조립하고 전자현미경으로 구조를 확인합니다. 이 기법은 비분절 음성센스 RNA 바이러스 연구에 활용됩니다.

호흡기 싱크량 바이러스의 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드의 생성 및 조립

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