Name: 대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 학습하세요 대장균 및 다양한 박테리아에서 세포외 소포를 확장 가능하게 분리하고 정제하는 방법을. 여과 및 크기 배제 크로마토그래피를 활용한 이 기술은 재현성 높은 연구와 치료제 개발에 활용됩니다.

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위에서 설명한 연구는 NIH TL1 TR002549-03 교육 보조금의 지원을 받았습니다. 입자 크기 분석기 기기에 쉽게 접근할 수 있도록 해주신 John C. Tilton 박사와 Zachary Troyer 박사(케이스 웨스턴 리저브 대학교)에게 감사드립니다. 입자 크기 분포 데이터의 분석에 대한 기술 지원을 위한 루라다인(Spectradyne); 코넬 대학교의 데이비드 퍼트넘 박사가 pClyA-GFP 플라스미드14를 제공한 공로; 펜실베니아 대학의 Mark Goulian 박사는 대장균 MP113을 제공했습니다.

<ol><li>Yanez-Mo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).</li>
<li>Chatterjee, S. N., Das, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+observations+on+the+excretion+of+cell-wall+material+by+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae.</a> Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).</li>
<li>Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+beta-lactamase+is+packaged+into+membrane+vesicles+and+secreted+from+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).</li>
<li>Yonezawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+of+Helicobacter+pylori+TK1402+are+involved+in+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation.</a> BMC Microbiology. 9, 197(2009).</li>
<li>Mashburn, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+traffic+signals+and+facilitate+group+activities+in+a+prokaryote%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote.</a> Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).</li>
<li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li>
<li>Petousis-Harris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+a+group+B+outer+membrane+vesicle+meningococcal+vaccine+against+gonorrhoea+in+New+Zealand%3A+a+retrospective+case-control+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study.</a> Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).</li>
<li>Kim, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+suppress+tumor+by+interferon-gamma-mediated+antitumor+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response.</a> Nature Communications. 8 (1), 626(2017).</li>
<li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Consortium, E. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EV-TRACK%3A+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li>
<li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+and+enhanced+tumor+delivery+of+engineered+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 105, 195-205 (2016).</li>
<li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable%2C+cGMP-compatible+purification+of+extracellular+vesicles+carrying+bioactive+human+heterodimeric+IL-15%2Flactadherin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088(2018).</li>
<li>Lasaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+isolate+for+studying+colonization+of+the+mouse+intestine+and+its+application+to+two-component+signaling+knockouts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts.</a> Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).</li>
<li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li>
<li>Reimer, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+outer+membrane+vesicle+isolation+methods+with+an+Escherichia+coli+tolA+mutant+reveals+a+hypervesiculating+phenotype+with+outer-inner+membrane+vesicle+content%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628801(2021).</li>
</ol>

저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.

위의 프로토콜에서는 확장 가능하고 다양한 그람 음성/양성 및 호기성/혐기성 박테리아로부터 EV를 안정적으로 분리하는 방법이 설명되어 있습니다. 절차 전반에 걸쳐 몇 가지 잠재적인 정지 지점이 있지만 컨디셔닝된 박테리아 배양 배지에서 EV를 분리하는 데 48시간 이상 걸리지 않는 것이 좋습니다.
첫째, 컨디셔닝 된 박테리아 배양 배지를 생성하기 위해 박테리아를 배양하는 것으로 구성됩니다. 배양 시간을 최소 48시간으로 늘리고 최적의 성장 배지를 사용하면 EV 수율을 극대화하는 데 도움이 되는 것으로 나타났습니다. 각 박테리아 종은이 두 매개 변수와 관련하여 최적화되어야 할 것입니다. 박테리아 배양의 부피는 원하는 응용 분야에 대해 충분한 EV를 분리하는 데에도 중요합니다. 시험관 내 연구의 경우 EV는 일반적으로 최소 100mL에서 분리되는 반면, 생체 내 연구의 경우 EV는 일반적으로 >1L의 배양 배지에서 분리됩니다. 다시 말하지만, 각 박테리아...

세포외 소포(EV)는 원핵 세포 및 진핵 세포 모두에서 분비되는 지질, 단백질, 글리칸 및 핵산으로 구성된 나노미터 크기의 리포솜 유사 구조입니다1. 그람 음성 박테리아2에서 EV의 방출을 시각화하는 초기 연구 이후, 박테리아 EV (직경 20-300 nm)에 기인 한 생물학적 기능의 수는 지난 수십 년 동안 지속적으로 증가하고 있습니다. 이들의 기능에는 항생제 내성전달3, 생물막 형성4, 쿼럼 감지5 및 독소 전달6이 포함됩니다. 또한 박테리아 EV를 치료제로 사용하는 것, 특히 백신학7 및 암 치료8에 대한 관심이 증가하고 있습니다.
EV 연구에 대한 관심이 높아지고 있음에도 불구하고 격리 방법에 대한 기술적 과제는 여전히 남아 있습니다. 특히, 재현 가능하고 확장 가능하며 다양한 EV 생산 유기체와 호환되는 분리 방법이 필요합니다. EV 분리 및 연구 방법을 계획하고 보고하기 위한 통일된 원칙을 만들기 위해 국제 세포외 소포 학회는 MISEV 입장 논문9를 발행하고 업데이트합니다. 또한 EV-TRACK 컨소시엄은 투명성을 높이기 위해 출판된 원고에 사용된 EV 격리에 대한 세부 방법론을 보고할 수 있는 개방형 플랫폼을 제공합니다10.
이 프로토콜에서, 포유류 세포 배양으로부터 EV의 분리에 사용된 이전의 방법론은 박테리아 세포 배양으로부터 EV의 분리를 가능하게 하기 위해11,12 조정되었다. 우리는 확장 가능한 다양한 미생물로부터 EV를 분리하고 EV 순도와 수율의 균형을 맞추는 방법을 사용하려고 했습니다(MISEV 입장논문 9에서 논의됨). 원심분리 및 여과로 박테리아 세포 및 파편을 제거한 후, 배양 배지는 원심 장치 한외여과(최대 ~100mL의 부피) 또는 펌프 구동 TFF(더 큰 부피의 경우)에 의해 농축됩니다. 그런 다음 EV는 소형 EV의 정제에 최적화된 컬럼을 사용하여 SEC에 의해 분리됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63155/63155fig01.jpg"> 그림 1: 박테리아 EV 격리 워크플로 회로도 개요. 약어 : EV = 세포 외 소포; TFF = 접선 유동 여과; SEC = 크기 배제 크로마토그래피; MWCO = 분자량 컷오프. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63155/63155fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
Escherichia coli (즉, E. coli MP113)의 마우스-공생 균주를 모델 유기체로서 사용하였고, 이전에 보고된 바와 같이, 세포리신 A에의 융합에 의해 EV-관련 나노루시퍼라제를 발현하도록 변형시켰다14. 여기에 사용 된 방법은 적어도 몇 리터의 박테리아 배양을 처리하고 EV 관련 단백질과 비 EV 관련 단백질을 효과적으로 분리 할 수 있습니다. 마지막으로,이 방법은 다른 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 종에도 사용할 수 있습니다. 보고된 실험의 모든 관련 데이터는 EV-TRACK 지식 베이스(EV-TRACK ID: EV210211)10에 제출되었습니다.

<table><tbody><tr><td>0.5 mL 플랫 캡, 얇은 벽 PCR 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>3430</td> Qubit 16% 파라포름알데히드(포름알데히드) 수용액<td>으로 정확한 판독값을 얻기 위해 얇은 벽 PCR 튜브를 사용하는 것이 중요합니다</td></tr><tr><td></td><td>전자 현미경 과학</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Fiberlite 폴리프로필렌 원심분리기 병</td><td>ThermoFisher</td><td>010-1495</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Fiberlite 폴리프로필렌 원심분리기 병</td><td>ThermoFisher</td><td>010-1493</td><td></td></tr><tr><td>65 mm 폴리프로필렌 둥근 바닥/원뿔형 병 어댑터</td><td>Beckman Coulter</td><td>392077</td><td>Vivacell을 로터</td></tr><tr><td>Akkermansia mucinophila</td><td>ATCC</td>에 넣을 수 있음<td>, BAA-835</td><td></td></tr><tr><td>Amicon-15 (100 kDa MWCO)</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-20 XPI 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Beckman에서 더 이상 판매하지 않습니다. Avanti J-26XP는 가장 가까운 현대 모델입니다.</td></tr><tr><td>Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482</td><td>ATCC</td><td>29148</td><td></td></tr><tr><td>Bifidobacterium breve</td><td>NCIMB</td><td>B8807</td><td></td></tr><tr><td>Bifidobacterium dentium</td><td>ATCC</td><td>27678</td><td></td></tr><tr><td>뇌 심장 주입(BHI) 육수</td><td>Himedia</td><td>M2101</td><td>오토클레이빙 후, BHI 육수와 한천을 모두 혐기성 챔버에 도입하고 메나디온(1 &micro; g/L), 헤마틴(1.2 &micro; g/L) 및 L-시스테인 염산염(0.05%). 그런 다음 혐기성 박테리아 균주를 접종하기 전에 혐기성 조건에서 최소 24시간 동안 배양했습니다.</td></tr><tr><td>C-300 미세유체 카트리지</td><td>Spectradyne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN19032105</td><td></td></tr><tr><td>전자 현미경</td><td>FEI 회사</td><td>Tecnai G2 SpiritBT</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)</td><td>Takara</td><td>636763</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli MP1</td><td>Dr. Mark Goulian (선물)</td><td></td><td>쥐의 장에서 유래한 공생 박테리아</td></tr><tr><td>Fiberlite 500 mL - 250 mL 어댑터</td><td>ThermoFisher</td><td>010-0151-05</td>는 <td>Fiberlite 로터와 함께 사용되어 250 mL 병을 더 작은 크기의 박테리아 배양 시작에 사용할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>Fiberlite 고정각 원심분리 로터 ThermoFisher</td><td></td><td>F12-6x500-LEX</td><td>는 6 x 500 mL 병에 맞습니다</td></tr><tr><td>Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper</td><td>Electron microscopy sciences</td><td>FCF-400-CU</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution)</td><td>Electron microscopy sciences</td><td>16100</td><td></td></tr><tr><td>Hematin</td><td>ChemCruz</td><td>207729B</td><td>스톡 용액은 0.2 M L-histidine 용액으로 만들어졌습니다. 1.2 mg/mL</td></tr><tr><td>Infinite M Nano+ Microplate reader</td><td>Tecan</td><td></td><td>이 equibment는 mCherry 형광</td></tr><tr>In-Fusion을 측정하는 데 사용되었습니다<td>. HD 클로닝 플러스</td><td>Takara</td><td>638909</td><td>PCR 라인라화 벡터로의 PCR fragements의 클로닝을 위해</td></tr><tr><td>JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>Lauria Bertani (LB) broth, Miller</td><td>Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine Hydrochloride</td><td>J.T. Baker</td><td>2071-05</td><td>무게를 측정하여 혐기성 내부의 오토클레이브 BHI 매체에 직접 첨가해야 합니다. 챔버</td></tr><tr><td>Masterflex 피팅, 폴리프로필렌, 직선, 여성 루어에서 호스 바브 어댑터, 1/8" ID; 25/PK</td><td>콜-파머 - 특수</td><td>HV-30800-08</td><td>여과 튜빙 회로용 연결 어댑터</td></tr><tr><td>Masterflex 피팅, 폴리프로필렌, 스트레이트, 남성 루어에서 호스 바브 어댑터, 1/8" ID; 25/PK</td><td>콜-파머 - 특수</td><td>HV-30800-24</td><td>여과 튜빙 회로</td></tr><tr><td>용 연결 어댑터Masterflex L/S 아날로그 가변 속도 콘솔 드라이브, 20-600rpm</td><td>Masterflex</td><td>HV-07555-00</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 이지로드 헤드 정밀 튜빙, 4롤러, PARA 하우징, SS 로터</td><td>Masterflex</td><td>EW-07514-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 정밀 펌프 튜빙, PharmaPure, L/S 16; 25피트</td><td>Cole Palmer</td><td>EW-06435-16</td><td>저바인딩/저침출 튜빙</td></tr><tr><td>메나디온(비타민 K3)</td><td>MP</td><td>102259</td><td>원액은 1 mg/mL</td></tr><tr><td>MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK</td><td>Repligen</td><td>D04-E100-05-N</td> TFF 장치로 에탄올로 만들어졌으며 <td>최대 2L의 대장균 배양 상등액</td></tr><tr><td>Nano-Glo Luciferase 분석 시스템</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td>이 분석 키트는 nluc 리포터 단백질</td></tr><tr><td>NanoLuc (Nluc) Luciferase 항체의 발광을 측정하는 데 사용되었습니다. 클론 965808</td><td>R& D Systems</td><td>MAB10026</td><td></td></tr><tr><td>nCS1 미세유체역학 저항 펄스 감지 기기</td><td>Spectradyne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nCS1 Viewer</td><td>입자 크기 분포를 위한</td><td>Spectradyne</td><td></td> 분석 소프트웨어</tr><tr>집<td>락 검사를 위한 일상적인 PCR 반응을 수행하는 데 사용되는</td><td>표준 버퍼</td><td>NEB</td><td>M0482</td> DNA 중합효소 마스터 믹스</tr><tr><td>Protein LoBind, 2.0 mL, PCR 클린 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>30108450</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492</td><td>DNA 중합효소 마스터 믹스 qEV 오리지널, 35 nm Izon 클로닝에 필요한 PCR 반응 수행에 사용</td></tr> qEV 오리지널<tr><td>, 35 nm</td><td>Izon</td><td></td> 최대 <td>로딩 부피 0.5 mL</td></tr><tr><td>qEV 랙</td><td>qEV-original</td><td></td><td>SEC 컬럼</td></tr><tr><td>qEV-2, 35 nm</td><td>Izon</td><td></td><td>과 함께 사용2 mL</td></tr><tr><td>Qubit 형광측정기</td>의 최대 로딩 부피 <td>ThermoFisher</td><td></td><td>Item은 더 이상 사용할 수 없습니다. 사용 가능한 제품 중 가장 가까운 제품은 Qubit 4.0 형광측정기(cat. 아니요. Q33238)</td></tr><tr><td>Qubit 단백질 어세이 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33211</td><td>키트를 실온에서 보관하십시오. 표준은 4°C에 저장됩니다.</td></tr><tr><td>Sorvall Lynx 4000 원심분리기</td><td>ThermoFisher</td><td>75006580</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax i3x 마이크로플레이트 리더</td><td>분자 장치</td><td></td><td>이 장비는 나노루시퍼라아제 생물 발광을 측정하는 데 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250 or 500 mL)</td><td>MilliporeSigma</td><td>S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE</td><td>작업량을 수용하기 위해 하나 또는 여러 개의 필터를 사용할 수 있습니다. 경험상 제품 크기에 표시된 볼륨의 두 배를 필터링할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>우라닐 아세테이</td>트 <td>전자 현미경 과학</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>비닐 혐기성 챔버</td><td>Coy Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vivacell 100, 100,000 MWCO PES</td><td>Sartorius</td><td>VC1042</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Anotop 10 Plus 주사기 필터(0.02 미크론)</td><td>MilliporeSigma</td><td>WHA68093002</td><td>MRPS 희석제 필터링</td></tr></tbody></table>

대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

다양한 박테리아 종은 지질, 단백질, 핵산, 글리칸 및 모 세포에서 파생된 기타 분자로 구성된 ~20-300nm의 세포외 소포(EV)를 분비합니다. EV는 종내 및 종간 통신 벡터로 기능하는 동시에 감염 및 식민지화의 맥락에서 박테리아와 숙주 유기체 간의 상호 작용에 기여합니다. 건강 및 질병에서 EV에 기인하는 다양한 기능을 감안할 때 체외 및 생체 내 연구를 위해 EV를 분리하는 데 대한 관심이 증가하고 있습니다. 물리적 특성, 즉 크기에 기반한 EV의 분리는 다양한 박테리아 배양에서 소포의 분리를 용이하게 할 것이라는 가설이 세워졌습니다. 
분리 워크플로우는 박테리아 배양에서 EV를 분리하기 위한 원심분리, 여과, 한외여과 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 구성됩니다. 펌프 구동 접선 유동 여과(TFF) 단계를 통합하여 확장성을 향상시켜 시작 세포 배양 리터에서 물질을 분리할 수 있습니다. 대장균 은 EV 관련 나노루시퍼라제 및 비EV 관련 mCherry를 리포터 단백질로 발현하는 모델 시스템으로 사용되었습니다. 나노루시페라아제는 N-말단을 사이토리신 A와 융합하여 EV를 표적으로 삼았습니다. 관련 사이토리신 A-나노루크와 함께 20-100nm EV를 포함하는 초기 크로마토그래피 분획은 유리 단백질을 포함하는 후기 분획과 구별되었습니다. EV-관련 나노루시퍼라제의 존재는 면역금 표지 및 투과 전자 현미경에 의해 확인되었다. 이 EV 분리 워크플로우는 다른 인간 장 관련 그람 음성 및 그람 양성 박테리아 종에 적용할 수 있습니다. 결론적으로, 원심분리, 여과, 한외여과/TFF 및 SEC를 결합하면 다양한 박테리아 종에서 EV를 확장 가능한 분리할 수 있습니다. 표준화된 분리 워크플로우를 사용하면 종 간 미생물 EV의 비교 연구가 용이해질 것입니다.

EV에 대해 어떤 SEC 크로마토그래피 분획이 농축되었는지 평가하기 위해 SEC 컬럼에 TFF에 의해 1,000배 농축된 대장균 MP1 조절 배양액 2mL를 로드하고 순차적 분획을 수집했습니다. MRPS를 사용하여 분획 1-6에 가장 많은 EV가 포함되어 있음을 알 수 있습니다(그림 2A). 후속 분획에는 EV가 없는 단백질 대신 포함된 EV가 거의 포함되어 있지 않았습니다(그림 2B). EV는 주로 직경이 &lt;100nm였습니다(그림 2C). TEM은 특히 분획 2-6에서 EV 농축 및 크기를 확인했습니다(그림 2D).
상기 방법이 비 EV 관련 단백질로부터 EV를 분리 할 수 있는지 확인하기 위해, 세포 리신 A- 나노 루시퍼 라제 융합 단백질과 ...

박테리아는 생리 활성 생물학적 분자를 운반하는 나노 미터 크기의 세포 외 소포 (EV)를 분비합니다. EV 연구는 생물 발생, 미생물-미생물 및 숙주-미생물 상호 작용 및 질병에서의 역할, 잠재적 인 치료 응용 프로그램을 이해하는 데 중점을 둡니다. EV 연구의 표준화를 촉진하기 위해 다양한 박테리아로부터 EV를 확장 가능한 분리를 위한 워크플로우가 제시됩니다.

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

이 프로토콜은 재현성이 높은 방식으로 다양한 박테리아로부터 세포외 소포를 분리하는 방법을 제공하기 때문에 중요합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 박테리아 배양의 상당히 큰 환경에서 EV를 분리하는 데 사용할 수 있어 생체 내 연구가 가능하다는 것입니다. 우리가 보여주는 데이터는 전임상 응용 프로그램을 반영하지만, 이 프로토콜은 치료제용 박테리아 EV 제조에 적용될 수 있을 것으로 예상됩니다.이 방법은 약간의 수정으로 확장 가능한 모든 세포 배양 시스템에 적용할 수 있습니다. 프로토콜 확장성 때문에 박테리아 세포 배양의 원하는 시작 부피를 처리하기 위해 적절한 크기의 필터와 SEC 컬럼을 갖는 것이 중요합니다. 절차를 시연하는 것은 저스틴 라티아 박사 연구실의 보조 기술자 인 새디 존슨, 저스틴 라시아 박사 연구실의 종양학 펠로우 인 디오니시우스 왓슨, 내 연구실의 연구 기술자 인 아킴 산토스입니다.멸균 루프를 사용하여 대장균의 단일 콜로니를 250-1000 밀리리터의 Luria-Bertani 또는 LB 국물에 접종하여 시작하십시오. 그런 다음 진탕 인큐베이터에서 분당 300회전 및 섭씨 37도의 호기성 배양액을 배양합니다. 배양 48 시간 후, 세포 배양 물을 깨끗한 500 밀리리터 폴리 프로필렌 원심 분리기 병으로 옮겨 섭씨 4도 및 5, 000 배 G에서 대용량 고정각 로터에서 15 분 동안 원심 분리하여 박테리아 배양 배지를 정화합니다.상층액을 15분 동안 10, 000회 G로 조심스럽게 원심분리기에 부어 세척한 원심분리기 병으로 옮긴다. 다음으로, 상청액을 적절한 크기의 0.2-마이크론 폴리에테르설폰 진공 구동 필터 장치로 옮기고 여과 장치를 진공 벽 공급 장치에 연결합니다. 여과율이 크게 떨어지면 여과되지 않은 재료를 새 장치로 옮기십시오.여과된 배지는 섭씨 4도에서 밤새 보관하거나 즉시 추가 처리할 수 있습니다. 생존 가능한 세포의 완전한 제거를 확인하기 위해, 여과된 상청액의 분취량을 적합한 한천 플레이트에 퍼뜨리고 박테리아 균주에 대한 최적 조건에서 배양한 후 임의의 콜로니가 없는지 확인한다. 여과된 배지를 100밀리리터의 부피로 농축하기 위해, 여과된 배양 배지 90밀리리터를 100킬로달톤의 분자량 차단을 갖는 원심 한외여과 장치의 저장소에 로딩하고, 스윙 버킷 로터에서 배지를 섭씨 4도에서 원심분리하고 2, 000배 G 상단 저장소의 부피가 0.5밀리리터 미만으로 농축될 때까지 15 내지 30분 간격으로 사용한다.남아 있는 여과된 배양 배지로 저장소를 채우려면 장치 바닥의 플로우 스루를 제거하여 균형을 재조정합니다. 저장소에서 농축된 배지의 점도가 눈에 띄게 증가하면 배지를 PBS로 희석하고 원심분리로 재농축하여 분자량 컷오프인 100킬로달톤보다 작은 비세포외 소포 또는 EV 단백질을 줄입니다. 그런 다음 농축된 배지를 저단백질 결합 튜브로 옮겨 섭씨 4도에서 밤새 보관합니다. 100밀리리터보다 큰 부피로 여과된 배지를 농축하려면 분자량 컷오프가 100킬로달톤인 적절한 크기의 접선 유동 여과 또는 TFF 장치를 선택합니다.원고에 설명 된대로 여과 회로를 조립 한 후 200ml의 PBS를 눈금이있는 용기에 펌핑하여 원하는 유량에 해당하는 적절한 속도를 결정합니다. 속도가 설정되면, 여과된 조절 배지를 실온에서 분당 약 200 밀리리터로 순환시키고, 100 킬로달톤보다 작은 분자를 수집하고, 한외여과막을 가로질러 별도의 용기에서 폐기물로서 컨디셔닝 배지의 부피가 100 내지 200 밀리리터로 감소될 때까지. 여과된 부피를 PBS로 2배 순차적으로 희석하고 더 작은 용기에서 펌프로 배지를 계속 순환시켜 부피를 75 내지 100 밀리리터로 농축한 다음 25 밀리리터 및 10 밀리리터로 농축합니다.시료 저장소에서 공급 튜브를 들어 올리고 펌프를 펌핑하여 필터를 퍼지하여 시료의 최대량을 회수합니다. 농축 된 샘플을 분자량 컷오프가 100 킬로 달톤 인 15 밀리리터 원심 한외 여과 장치로 옮기고 섭씨 4도 및 2, 000 배 G의 스윙 버킷 로터에서 원심 분리기를 상단 저장소의 배지 부피가 2 밀리리터 미만이 될 때까지 15-30 분 간격으로 이동합니다. 농축된 배지를 저단백 결합 튜브로 옮겨 섭씨 4도에서 밤새 보관합니다.EV의 분리를 위해 100밀리리터 미만의 출발 물질에 대해 10밀리리터 베드 부피의 작은 컬럼과 100밀리리터 이상의 출발 물질에 대해 47밀리리터 베드 부피를 갖는 더 큰 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 수행합니다. 실험 전 몇 시간에 걸쳐 SEC 컬럼과 PBS를 실온으로 가져온 다음 표준 실험실 스탠드 및 홀더를 사용하여 수직 위치에서 컬럼을 안정화합니다. SEC 컬럼에 연결하기 전에 5밀리리터의 PBS가 프릿을 통해 폐기물 용기로 흐르도록 하여 샘플 저장소에 수분을 공급합니다.그런 다음 컬럼의 입구 캡을 풀어 샘플 저장소에 2밀리리터의 PBS를 추가하고 PBS가 프릿을 통해 떨어지므로 저장소를 컬럼에 조심스럽게 연결합니다. 컬럼의 평형을 위해 샘플 저장소에 47ml의 PBS를 추가한 다음 SEC 컬럼의 하단을 풉니다. 그런 다음 로드된 모든 샘플 버퍼가 컬럼을 통과하도록 하고 플로우 스루를 폐기합니다.2밀리리터의 시료를 시료 저장소에 넣은 후 시료가 컬럼에 완전히 들어가도록 하고 플로우 스루를 수집합니다. PBS를 시료 부피를 뺀 14.25ml의 부피로 시료 저장소에 즉시 추가하여 용액이 컬럼을 통해 흐를 수 있도록 하고 컬럼 빈 부피와 동일한 양을 폐기합니다. 다음으로, 2밀리리터의 저결합 마이크로튜브를 SEC 컬럼 바로 아래에 위치시켜 2밀리리터의 PBS가 컬럼을 통과하도록 허용한 후 첫 번째 플로우 스루 또는 분획 1을 수집합니다.샘플 저장소에 2 밀리리터의 PBS를 계속 추가하여 각 후속 분획을 수집합니다. 수집 된 분획을 단기 보관의 경우 섭씨 4도, 장기 보관의 경우 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 수집된 EV 분획의 무균 테스트를 위해 3밀리리터의 배양 배지에 분석에 사용할 100마이크로리터의 분획을 접종합니다.이어서, 배지를 최적 조건 하에서 배양하면서 적어도 3일 동안 탁도를 관찰하였다. 또는 분획 샘플을 생산 박테리아를 성장시키는 데 사용되는 배지가 포함된 한천 플레이트에 적용한 다음 콜로니 형성을 확인할 수 있습니다. 다음으로, 동결-해동 주기를 피하기 위해 개별 또는 풀링된 분획의 25-50%를 섭씨 영하 80도의 저단백 결합 튜브로 옮겨 EV를 보관하십시오.대표적인 분석은 초기 크로마토그래피 분획에서 대장균 MP1 EV의 용출을 보여줍니다. 분획 1에서 6까지는 평균 직경이 100나노미터 미만인 가장 많은 EV를 포함했습니다. 동시에, 후속 분획에는 EV가없는 단백질과 매우 적은 EV가 포함되었습니다.EV 농축 및 크기는 투과 전자 현미경에 의해, 특히 분획 2 내지 6에서 확인되었다. EV가 풍부한 분획 2 내지 7은 높은 나노루시퍼라제 활성을 갖는 것으로 관찰되었지만, 이후 분획에 비해 비 EV-관련 mCherry로부터의 형광 신호는 매우 낮았다. 면역금 표지는 분획 2 내지 5에서 나노루시퍼라아제의 EV 결합을 확인하였다.다른 박테리아 종에 대한 프로토콜의 적용 가능성은 다양한 혐기성 박테리아의 배양물에서 EV를 분리함으로써 평가되었습니다. 초기 크로마토그래피 분획 1에서 4는 직경 크기가 100나노미터 미만인 EV에 대해 농축된 것으로 관찰되었습니다. 복잡한 뇌-심장 주입 또는 BHI는 총 EV 수율의 25 % 미만으로 EV 크기의 입자를 포함했습니다.박테리아 세포 배양의 시작 부피를 처리 할 수있는 TFF 장치를 사용하는 것이 중요합니다. 이 기술을 통해 복잡한 동물 모델에서 기능에 대한 생물학적 질문을 할 수있는 충분한 EV를 생성 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: 왓슨, DC, et.al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 유전자 조작 박테리아의 외막에서 파생된 세포외 소포(EV)의 분리 및 농축을 보여줍니다. 이 과정에는 박테리아를 배양하여 EV를 방출한 다음 세포와 잔해물을 제거하기 위한 순차적 원심분리 및 여과 단계가 포함됩니다. 마지막으로, 한외여과는 다운스트림 분석을 위해 EV를 농축하는 데 사용됩니다.

박테리아로부터 외막 유래 세포외 소포의 분리 및 농축

출처: Watson, DC, et al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 박테리아 배양 여과액에서 박테리아 세포외 소포(EV)를 분리하기 위해 다공성 수지 비드를 사용한 크기 배제 크로마토그래피를 사용하는 방법을 보여줍니다. 더 큰 EV는 수지 기공을 우회하여 조기에 용리되는 반면, 더 작은 단백질은 기공으로 들어가 나중에 용리됩니다.

크기배제 크로마토그래피를 이용한 박테리아 세포외 소포의 분리 

이 동영상은 특성화 연구에 적합한 세포외 소포체의 하위 집단을 분리하기 위한 밀도 구배 초원심분리 기반 정제 방법을 보여줍니다.

Purification of subpopulations of extracellular vesicles: A technique to purify subpopulations of extracellular vesicles using Density Gradient Ultracentrifugation(밀도 구배 초원심분리를 사용하여 세포외 소포의 하위 집단을 정제하는 기술)

이 비디오에서는 박테리아에서 유래한 외막 소포 또는 OMV의 이질적인 집단을 분리하는 기술(크기 배제 크로마토그래피)을 시연합니다. 이러한 소포는 나노 크기의 구형 구조이며 크기 배제 크로마토그래피를 통해 크기에 따라 크고 작은 하위 모집단으로 분리됩니다.

Size Exclusion Chromatography Based Separation of Bacterial Extracellular Vesicles: A technique to separateing of gram-negative bacterial outer membrane vesicles (박테리아 세포외 소포체의 이질성 집단을 크기에 따라 분리하는 기술)

이 동영상은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)의 배양 여과액에서 박테리아 세포외 소포체(EV)를 정제하기 위한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 기술을 보여줍니다. 이 기술은 다공성 수지 충전 컬럼을 사용하여 EV의 정제된 분획을 얻습니다. 다공성 입자는 더 작은 단백질이 기공으로 들어가도록 선택적으로 허용하여 용리 속도를 늦춥니다. 동시에 EV는 크기가 크기 때문에 모공으로 들어가는 것이 배제되고 먼저 용출됩니다.

Mycobacterial Extracellular Vesicles를 정제하기 위한 크기 배제 크로마토그래피 기술

다양한 응용 분야에 걸쳐 구현하기 위해 향상된 효소 안정성을 제공하는 효소 포장 외막 소포체(OMV)의 생산, 정제 및 사용을 위한 프로토콜이 제시됩니다.

에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장<em&gt; 대장균</em&gt; : 디자인, 생산 및 정제

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세균성 소포는 병인에 중요한 역할을 하고 유망한 생명 공학 응용 프로그램이 있습니다. 소포의 이질성은 분석과 사용을 복잡하게 합니다. 따라서 다양한 크기의 소포를 분리하는 간단하고 재현 가능한 방법이 필요합니다. 여기에서, 우리는 Aggregatibacter actinomycetemcomitans에의해 생성된 이기종 소포를 분리하기 위하여 크기 배제 크로마토그래피의 사용을 보여줍니다.

크기 배제 크로마토그래피는 세균 외부 막 소포 이질성을 분석

여기서 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 세포외 소포가 컨디셔닝 세포 배양 배지로부터 적절하게 분리될 수 있음을 보여줍니다.

조절된 세포 배양 배지에서 세포외 소포를 분리하기 위한 크기 배제 크로마토그래피

본 프로토콜은 세포외 막 결합 소포 내부에 포장된 전형적으로 불용성 또는 이황화 결합 함유 단백질을 포함하는 재조합 단백질의 박테리아 생산을 위한 상세한 방법을 설명합니다. 이것은 응용 생명 공학 및 의학을 포함한 과학 연구의 다양한 영역에 적용될 가능성이 있습니다.

E. coli의 재조합 단백질 충전 소포의 최적화된 생산 및 분석

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Density Gradient Centrifugation을 사용한 인간 대변에서 박테리아 세포외 소포의 분리 및 정제

학습하세요 대장균 및 다양한 박테리아에서 세포외 소포를 확장 가능하게 분리하고 정제하는 방법을. 여과 및 크기 배제 크로마토그래피를 활용한 이 기술은 재현성 높은 연구와 치료제 개발에 활용됩니다.

대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제

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