과립 세포 전구체에서 1 차적인 실륨 의존적 신호 경로를 연구하는 효율적이고 비용 효율적인 전기 포기법
2021년 11월 30일
여기서, 우리는 비용 효율적이고 효율적이며 실행 가능한 1 차성 과립 세포 전구체 (GCP)의 유전 조작을 위한 시험관 내 전기화 프로토콜을 제시합니다. 더욱이, 이 프로토콜은 또한 1 차적인 GCP 세포에 있는 1 차적인 고슴도치 신호 통로의 분자 연구를 위한 간단한 방법을 보여줍니다.
이 프로토콜은 1 차과립 세포 전구체 배양에서 1 차적인 cilium 의존적인 신호 통로의 분자 연구를 위한 간단한 체외 유전 수정 방법을 보여줍니다. 현재 의 경질 전환 방법의 비용, 낮은 생존력 및 효율성 저하로 인해, 우리는 1 차 적인 GCP 배양에서 cilium 의존적인 신호 경로를 조사하기 위한 간단하고 비용 효율적이며 효율적인 전기 기법을 소개합니다. 우선, 코팅된 커버 슬립이 들어있는 24웰 배양판의 각 웰에 0.5 밀리리터의 배양 배지를 추가하고 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 따뜻하게 유지하십시오.
필요한 수의 세포를 멸균 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 파이프하고 실온에서 5분 동안 200x G에서 회전합니다. 상체를 버리고 Opti-MEM의 200 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 이 절차를 두 번 반복하여 잔류 배양 배지가 튜브에 존재하지 않도록 합니다.
전자기화 매개 변수를 나열된 대로 설정합니다. 파이펫 은 전자 기화 반응을 부드럽게 잘 혼합하고 긴 P200 파이펫 팁을 사용하여 혼합물의 100 마이크로 리터의 정확한 부피를 2 밀리미터 갭 큐벳으로 전송합니다. 큐벳이 큐벳 챔버 내부에 들어가면 전기포레이터의 오메가 버튼을 누르고 100 마이크로리터의 정확한 볼륨을 고수하여 임피던스 값을 기록하십시오.
임피던스 값의 범위는 약 30 및 35여야 합니다. 시작 버튼을 눌러 펄스를 시작합니다. 판독 프레임에 표시된 줄에 측정된 전류 값을 기록합니다.
챔버에서 큐벳을 제거합니다. 즉시 100 마이크로리터의 미리 따뜻해지는 배양 배지를 큐벳에 넣고 2~3회 위아래로 피펫팅하여 재장매합니다. 셀 서스펜션을 이전에 준비한 24웰 플레이트로 즉시 전송합니다.
이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 다음 날 형광 현미경의 밑에 세포를 관찰하십시오. 본 연구에서는, DMSO 및 SAG 처리군의 전기기화 효율이 비교되는 것으로 나타났다.
1차 실슘 마커 Arl13b의 면역염색은 차량과 SAG 처리된 그룹 모두에서 배양의 div-2에서 GCP의 모양 속도를 입증한다. 섬광 속도는 div-2 후 전기포화에서 세포 표면에 1차 실슘을 베어링하는 GCP를 발현하는 Pax6의 백분율을 보여줍니다. 이 수치는 Pax6 발현 GCP 세포의 1차 실륨 액소네메에 대한 부드러운 EGFP 국소화가 SAG 후 24시간 동안 유의하게 증가하여 1차 고슴도치 신호 경로의 심오한 활성화를 나타낸다.
더 높은 전기포기 효율을 달성하기 위해서는 사용되는 플라스미드의 고순도를 보장해야 하며, 잔류물 배양 매체는 플라스미드 전기포기 혼합물에 존재하지 않는다. 이 프로토콜은 뉴런과 인간이 유발한 만능 줄기 세포를 포함하여 트랜스펙트하기 어려운 1 차 배양 및 세포 유형에 대한 체외 유전자 변형 실험에 직접적으로 적용되고 유익해야 합니다.
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개요
본 연구는 일차 소뇌 과립세포 전구체(GCPs)의 유전자 조작을 위해 설계된 재현 가능한 인 비트로(in vitro) 전기천공법 프로토콜을 제시합니다. 본 프로토콜은 일차 섬모 의존적 Hedgehog 신호 전달 경로를 연구하는 데 있어 비용 효율적이고 효율적인 방법에 집중합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 유전자 조작
- 세포 신호 전달
배경
- 1차 소뇌 과립세포 전구체(GCPs)는 신경 발달 연구에 매우 중요합니다.
- 현재의 형질전환 방법들은 흔히 효율이 낮고 비용이 많이 듭니다.
- 일차 섬모는 Hedgehog 신호 전달을 포함한 다양한 신호 전달 경로에 필수적입니다.
- 전기천공법은 이러한 문제들에 대한 잠재적인 해결책을 제공합니다.
연구 목적
- GCP 배양을 위한 효율적인 전기천공법(electroporation) 기술을 소개합니다.
- 일차 섬모 의존적 신호 전달 연구를 용이하게 합니다.
- 형질전환이 어려운 세포 유형에서 유전자 조작 결과를 개선합니다.
사용된 방법
- 본 실험에서는 일차 GCP의 in vitro 배양을 이용하였습니다.
- 전기천공 프로토콜에는 효과적인 유전자 변형을 위한 특정 파라미터가 포함되었습니다.
- 해당 연구에서 멀티오믹스 접근법은 언급되지 않았습니다.
- 핵심 단계에는 세포 재현탁 및 전기천공 순서가 포함되었습니다.
- 섬모 형성률과 신호 전달 경로의 활성화를 평가하기 위해 면역염색법이 사용되었습니다.
주요 결과
- 해당 프로토콜은 처리된 GCP에서 Hedgehog 신호 전달 경로의 활성화가 유의미하게 증가했음을 입증했습니다.
- 면역 염색 결과, 전기 천공 후 GCP의 섬모 형성률이 눈에 띄게 증가한 것으로 나타났습니다.
- 본 연구는 전통적인 방법과 비교하여 전기 천공의 효율성에 대한 통찰을 제공했습니다.
- 결론적으로, 전기 천공의 성공을 위해서는 높은 플라스미드 순도가 매우 중요하다는 점이 밝혀졌습니다.
결론
- 본 연구는 일차 GCP의 유전적 조작을 위한 가치 있는 프로토콜을 제시합니다.
- 본 연구 결과는 일차 섬모 의존적 신호 전달 메커니즘에 대한 이해를 높여줍니다.
- 향후 응용 분야에는 형질전환이 까다로운 다양한 세포 유형이 포함될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
일차 과립세포 전구체(GCP)의 효율적인 유전자 조작은 신경 발달 및 질환 경로의 기초가 되는 섬모 의존적 신호 전달 기전을 규명하는 데 필수적입니다. 본 전기천공법 프로토콜은 높은 형질전환 효율과 세포 생존율을 제공하여, 질환 관련 시스템 내 Hedgehog 경로 역학에 대한 강력한 조사를 가능하게 합니다. 이 방법은 신호 전달 경로 조절제의 초기 발견 및 타겟 검증에 있어 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 일차 GCP에서 섬모 의존적 Hedgehog 신호 전달의 기능적 유전학적 분석을 가능하게 합니다.
- 경로 구성 요소의 국소화를 직접 시각화함으로써 메커니즘적 위험 제거를 지원합니다.
- 질환 관련 세포에서 신호 전달 노드를 재현성 있게 조작하여 표적 검증을 용이하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 경로 조절제의 하위 스크리닝을 위해 검증된 1차 세포 시스템을 준비합니다.
- 정량적 분석 결과를 위해 높은 형질전환 효율(~80-90%)과 재현성을 제공합니다.
- 형질전환이 어려운 신경세포 모델을 대상으로 확장 가능하고 비용 효율적인 분석법 개발을 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- in vitro 연구 결과를 질병 관련 세포 표현형과 연계하여 중개 연구의 연속성을 확보합니다.
- 신호 전달 단백질 위치의 동적 추적을 가능하게 하여 바이오마커 발굴을 지원합니다.
- 강력한 기전 데이터를 제공함으로써 전임상 단계의 생물학적 리스크를 감소시킵니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 프로토콜은 초기 발견 및 표적 검증 단계에 통합되어, 일차 신경세포 시스템에서 유전자 조작과 정량적 경로 분석을 연결합니다.
- 발견 생물학: 일차 GCP에서의 가설 검증 및 경로 규명을 용이하게 합니다.
- 스크리닝: 분석 준비 및 정량적 판독을 위해 재현성 있고 효율적인 고효율 transfection을 제공합니다.
- 분석: 면역 염색 및 형광 현미경을 통해 섬모 형성률과 경로 활성 측정을 가능하게 합니다.
- 중개 연구: in vitro 기전적 통찰력을 질병 관련 세포 환경과 연결합니다.
- 기업적 재사용: 다루기 어려운 일차 세포 유형의 유전자 변형에 광범위하게 적용 가능한 플랫폼을 제공합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 경로 연구에서 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 높은 재현성과 확장성을 갖춘 유전자 조작을 표준화합니다.
- 전략적 가치: 견고한 초기 단계 데이터를 확보함으로써 go/no-go 결정 및 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 신호 전달 경로 표적 및 조절제에 대한 위험 조정 우선순위 결정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 일차 뉴런 배양 및 전기천공법 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 분석을 위해 전기천공 장비 및 형광 현미경을 사용할 수 있어야 합니다.
- 플라스미드 순도 및 배지 제거 프로토콜에 대한 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- 프로토콜 최적화를 통해 형질전환이 어려운 다른 일차 세포 유형에도 적용 가능합니다.
- 효율성은 전기천공 매개변수와 시료 준비의 정밀한 제어에 달려 있습니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Day In Vitro (DIV) 0: Electroporation for Overexpression of Hedgehog Receptor: pEGFP-Smo
2:28
Results: Assessment of Overexpression Efficiency and the Effects of SAG Treatment on Primary Cilium-Dependent Hedgehog Signaling Pathway
3:23
Conclusion
