비방사성 철 동위원소를 사용한 생체 내 마우스 태반을 가로지르는 철 수송 정량화

이 프로토콜은 연구자들이 방사능 없이 생체 내에서 철 분포를 추적하고 정량화할 수 있게 해주기 때문에 중요합니다. 동일한 시료 내에서 여러 개의 안정한 철 동위원소를 동시에 검출할 수 있기 때문에 이 기술을 사용하여 다양한 출처에서 철의 흡수, 조절 및 분포를 이해할 수 있습니다. 시작하려면 공급 업체가 제공 한 유리 바이알의 철 -12에 58 개의 일반 염산을 넣고 캡을 느슨하게 교체하십시오.

철분을 녹이려면 섭씨 60도에서 1 시간 동안 용액을 따뜻하게하십시오. 그래도 용해되지 않으면 용액을 흄 후드의 실온에서 밤새 방치하여 용해시킵니다. 그런 다음 염화철 용액을 생성하려면 산화를 촉진하기 위해 캡을 제거한 상태에서 용액을 섭씨 60도까지 예열하여 남아 있는 염화제1철을 산화시킵니다.

산화를 더욱 촉진하기 위해 용액 50 마이크로 리터 당 35 % 과산화수소 1 마이크로 리터를 첨가하십시오. 뚜껑을 닫은 상태에서 후드에 염화철 용액을 섭씨 60도에 그대로 두어 샘플을 증발시킵니다. 그런 다음 염화제이철을 초순수로 100밀리몰로 재구성합니다.

초기 금속 중량을 기준으로 필요한 물의 양을 계산하십시오. 다음으로, 제조된 염화철 용액을 실온에서 5분 동안 20밀리몰 중탄산나트륨의 존재하에 1 내지 5몰비로 니트릴로트리아세테이트와 함께 배양하여 1밀리리터의 제2철 니트릴로트리아세테이트를 제조한다. 그런 다음 500 밀리그램의 아포 트랜스페린을 4 밀리리터의 전달 및 로딩 버퍼에 녹이고,이 아포 트랜스페린 용액 4 밀리리터를 15 밀리리터 튜브의 준비된 철 니트릴로 트리 아세테이트 용액에 첨가한다.

아포 트랜스페린에 철 니트릴로 트리 아세테이트를 최대로 적재하려면 용액이 pH 7.5인지 확인하고 필요한 경우 중탄산 나트륨 또는 염산으로 pH를 조정하십시오. 혼합물을 실온에서 2 1/2 시간 동안 배양한다. 다음으로, 과량의 결합되지 않은 니트릴로트리아세테이트철을 제거하고, 철-58 트랜스페린 용액을 분자량 차단 컬럼으로 옮기고 컬럼을 원심분리함으로써 니트릴로트리아세테이트를 방출한다.

원심분리 후, 10 밀리리터의 트랜스페린 로딩 완충액을 첨가하고 컬럼을 원심분리하여 컬럼을 2회 세척한다. 그런 다음 10 밀리리터의 식염수와 원심 분리기로 컬럼을 다시 씻으십시오. 마지막으로 0.22미크론 주사기 필터를 사용하여 철-58 트랜스페린 용액을 멸균하고 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 4도에서 보관합니다.

식염수에 밀리리터 철 -58 트랜스페린 용액 당 35 밀리그램을 준비하십시오. 그런 다음 마취 된 임신 한 마우스를 가열 패드에 놓고 철 -58 트랜스페린 용액을 천천히 조심스럽게 역와 부비동에 주입하십시오. 주사 후 6 시간 후에 마우스를 안락사시키고 멸균 된 집게와 해부 가위를 사용하여 자궁을 조심스럽게 제거합니다.

자궁의 일부로 둘러싸인 양막 자루에서 단일 태아와 태반으로 구성된 태아 태반 단위를 잘라냅니다. 다음으로, 태아와 태반을 방해하지 않고 자궁과 양막을 조심스럽게 자릅니다. 그런 다음 양막을 껍질을 벗기고 태아와 태반을 제거하십시오.

탯줄을 자른 후 태아와 태반을 깨끗한 작업 닦음으로 닦아 과도한 양수를 제거하고 전체 태반의 무게를 기록합니다. 면도날로 각 태반을 반으로 자릅니다. 각 절반을 2 밀리리터 튜브에 넣고 액체 질소에 스냅 동결시킵니다.

배아 간을 수집하려면 배아를 희생하고 안정화를 위해 배아를 고정하여 복부를 노출시킵니다. 해부 가위를 사용하여 탯줄이 부착 된 곳에 작은 절개를합니다. 해부 가위의 한쪽 끝을 절개 부위에 삽입하고 관상 평면쪽으로 1/4 인치 중앙 평면 절단을 수행합니다.

그런 다음 횡단면 절단을 수행하여 태아 간을 노출시킵니다. 집게를 사용하여 태아 간을 제거하고 전체 배아 간의 무게를 기록합니다. 전체 배아 간을 2 밀리리터 튜브에 넣고 액체 질소에 동결시킵니다.

티슈를 영하 80도에서 무기한 보관하십시오. 태반과 태아 간에서 비헴철을 정량화하려면 태반 반쪽과 전체 태아 간을 해동합니다. 그런 다음 태반 반쪽의 무게를 잰다.

400 마이크로리터의 단백질 침전 용액을 조직 샘플에 첨가하고 전기 균질화를 사용하여 조직을 균질화합니다. 샘플을 섭씨 100도에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 실온의 물에서 2 분 동안 식히십시오.

캡을 열어 압력을 해제하십시오. 그런 다음 튜브를 다시 닫으십시오. 샘플을 원심분리하여 조직 파편을 펠릿화한 후 ICP-MS 분석을 위해 상청액을 새 표지된 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.

헴철을 정량화한 다음, 원심분리 후에 얻어진 펠릿의 중량을 기록한다. 그런 다음 10 밀리리터의 농축 된 70 % 질산에 30 % 과산화수소 1 밀리리터를 보충하여 펠릿을 소화하십시오. ICP-MS 분석을 위해 보내기 전에 샘플을 섭씨 200도까지 15분 동안 가열합니다.

ICP-MS 측정을 통해 두 가지 다른 철 동위 원소를 검출 할 수있었습니다. 가장 풍부한 철 동위 원소 인 철 -56은 조직의 만성 이온 변화를 반영합니다. 또 다른 동위 원소 인 철 -58은 주입 된 철의 분포의 급격한 변화를 반영합니다.

철분-56 측정은 철분 결핍 임신의 배아 간이 철분이 풍부한 임신의 배아 간에 비해 철분 저장량이 감소한 것으로 확인되었습니다. 철분-58 측정은 철분 결핍 임신에서 철분이 풍부한 임신보다 6시간 동안 배아 간으로 옮겨진 철분이 더 적다는 것을 확인했습니다. 절차를 수행하는 동안 조직의 무게를 기록하는 것을 잊지 마십시오.

이 가중치는 철 농도를 계산하는 데 필요합니다. 철-58은 특별한 취급 예방 조치 및 폐기가 필요하지 않기 때문에 처리되지 않은 조직은 웨스턴 블로팅 또는 qPCR을 포함하되 이에 국한되지 않는 다른 분석에 사용할 수 있습니다.