전장 단백질의 발현을 유지하면서 mRNA로부터 내부 번역 개시 부위의 제거

본 프로토콜은 Gja1에서 전장 Connexin43 생성을 유지하지만 더 작은 GJA1-20k 내부 번역 이소형의 번역을 방지하는 단일 M213L 돌연변이를 기술한다.

단일 잔기 치환의 어려움은 단일 잔기의 차이에도 불구하고 동물을 효율적으로 유전자형화하는 것이다. 제한 효소의 특별한 사용은 일반적인 PCR 기반 유전자형에 단 하나의 신속하며 저렴한 단계만을 추가합니다. 이 프로토콜은 표적 서열이 제한 효소에 의해 인식되는 경우 돌연변이점을 갖는 임의의 다른 마우스 모델에 적용될 수 있으며, 이는 보통 경우이다.

깨끗한 가위로 꼬리 끝을 하나 ~ 세 밀리미터 자르고 0.2 밀리리터 8 스트립 PCR 튜브로 옮깁니다. 원고에 기재된 꼬리 샘플을 함유한 후, 추출될 때까지 섭씨 20도에서 약 일주일 정도까지 보관한다. 튜브 당 100 마이크로리터의 조직 용해 용액을 첨가하고 잘 섞은 다음, 실온에서 10초 동안 2, 200배 G에서 탁상 미니원심분리기를 사용하여 스핀 다운하였다.

꼬리 샘플이 용액에 잠겨 있는지 확인하십시오. 조직 용해, 불활성화 및 유지를 위한 파라미터를 프로그래밍하여 설정된 열 사이클러 상에 튜브를 설정하십시오. PCR을 즉시 수행할 수 없는 경우 조직 용해물을 섭씨 네 도에서 최대 일주일 동안 보관하십시오.

5 마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물, 0.75 마이크로리터의 10-마이크로몰 정방향 및 역방향 프라이머, 및 샘플 당 7.5 마이크로리터의 PCR 마스터 믹스를 포함하는 PCR 용액을 새로운 PCR 튜브에 넣는다. 이전에 준비된 조직 용해물 중 한 마이크로리터를 PCR 용액에 첨가한다. PCR 용액을 잘 혼합하고 실온에서 10초 동안 2, 200배 G에서 탁상 미니원심분리기로 스핀다운한다.

튜브를 프로그래밍된 열 사이클러에 놓으십시오. 반응이 완료되면 PCR 산물을 섭씨 네 도에서 한 두 달 동안 또는 영하 20도에서 약 일년 동안 보관하십시오. 7 마이크로 리터의 뉴클레아제가없는 물, 10X 강도의 CutSmart 버퍼 두 마이크로 리터 및 NlaIII 제한 효소 1 마이크로 리터를 포함하는 효소 용액을 준비하십시오.

여러 샘플이있는 경우 각 내용물을 곱하여 혼합물을 만들고 튜브 당 분취량을 10 마이크로 리터로 만듭니다. 이전에 수득한 PCR 생성물 10 마이크로리터를 튜브당 효소 용액에 첨가한다. 잘 섞어서 이전에 시연 된 것처럼 탁상 미니 원심 분리기로 스핀 다운하십시오.

튜브를 프로그래밍된 열 사이클러 또는 열 블록에 놓으십시오. 추운 조건에서 배양 한 후 제품을 보관하십시오. 단일 강도 TAE 버퍼 50 밀리리터에 0.75 그램의 아가로스를 넣으십시오.

완전히 용해 될 때까지 전자 레인지에 아가로스를 혼합하고 가열하십시오. 그것을 식힌 후, 다섯 마이크로 리터의 DNA 얼룩을 넣고 부드럽게 섞으십시오. 25 밀리리터의 아가로스 젤을 젤 몰드에 붓고 젤이 응고되도록하십시오.

소화된 PCR 산물 10마이크로리터를 우물에 적재합니다. 젤을 35 분 동안 100 볼트로 실행하십시오. 자외선 하에서 아가로스 젤을 이미지화하십시오.

소화된 PCR 산물을 사용하여 수행된 아가로스 전기영동은 각 유전자형에서 서로 다른 크기의 여러 밴드를 생성했으며, 야생형의 두 밴드, 이형접합체에서 세 밴드, 동형접합체에서 각각 하나의 밴드를 가졌다. 배반포 분석을 통한 시험 주사는 공여체 올리고의 마이크로리터 당 50 나노그램을 주입할 때 76.9%의 성공률을 보였고, 동일한 공여체 올리고의 마이크로리터 당 25나노그램을 주입할 때 각각 25%의 성공률을 보였다. 마지막으로, 공여체 올리고의 마이크로리터 당 50 나노그램을 에탄올 침전으로 주입하여 50%의 성공률을 갖는 창시자 동물을 얻었다.

에탄올 침전에 의한 올리고 공여체의 정제는 높은 게놈 편집 효율을 유지하면서 독성을 낮췄다. 조심스럽게 취급하고 소량의 시약을 첨가하는 것은 매우 중요합니다. 올바르게 추가되고 잘 혼합되어 있는지 확인하십시오.