전장 단백질의 발현을 유지하면서 mRNA로부터 내부 번역 개시 부위의 제거
2022년 3월 16일
본 프로토콜은 Gja1에서 전장 Connexin43 생성을 유지하지만 더 작은 GJA1-20k 내부 번역 이소형의 번역을 방지하는 단일 M213L 돌연변이를 기술한다.
단일 잔기 치환의 어려움은 단일 잔기의 차이에도 불구하고 동물을 효율적으로 유전자형화하는 것이다. 제한 효소의 특별한 사용은 일반적인 PCR 기반 유전자형에 단 하나의 신속하며 저렴한 단계만을 추가합니다. 이 프로토콜은 표적 서열이 제한 효소에 의해 인식되는 경우 돌연변이점을 갖는 임의의 다른 마우스 모델에 적용될 수 있으며, 이는 보통 경우이다.
깨끗한 가위로 꼬리 끝을 하나 ~ 세 밀리미터 자르고 0.2 밀리리터 8 스트립 PCR 튜브로 옮깁니다. 원고에 기재된 꼬리 샘플을 함유한 후, 추출될 때까지 섭씨 20도에서 약 일주일 정도까지 보관한다. 튜브 당 100 마이크로리터의 조직 용해 용액을 첨가하고 잘 섞은 다음, 실온에서 10초 동안 2, 200배 G에서 탁상 미니원심분리기를 사용하여 스핀 다운하였다.
꼬리 샘플이 용액에 잠겨 있는지 확인하십시오. 조직 용해, 불활성화 및 유지를 위한 파라미터를 프로그래밍하여 설정된 열 사이클러 상에 튜브를 설정하십시오. PCR을 즉시 수행할 수 없는 경우 조직 용해물을 섭씨 네 도에서 최대 일주일 동안 보관하십시오.
5 마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물, 0.75 마이크로리터의 10-마이크로몰 정방향 및 역방향 프라이머, 및 샘플 당 7.5 마이크로리터의 PCR 마스터 믹스를 포함하는 PCR 용액을 새로운 PCR 튜브에 넣는다. 이전에 준비된 조직 용해물 중 한 마이크로리터를 PCR 용액에 첨가한다. PCR 용액을 잘 혼합하고 실온에서 10초 동안 2, 200배 G에서 탁상 미니원심분리기로 스핀다운한다.
튜브를 프로그래밍된 열 사이클러에 놓으십시오. 반응이 완료되면 PCR 산물을 섭씨 네 도에서 한 두 달 동안 또는 영하 20도에서 약 일년 동안 보관하십시오. 7 마이크로 리터의 뉴클레아제가없는 물, 10X 강도의 CutSmart 버퍼 두 마이크로 리터 및 NlaIII 제한 효소 1 마이크로 리터를 포함하는 효소 용액을 준비하십시오.
여러 샘플이있는 경우 각 내용물을 곱하여 혼합물을 만들고 튜브 당 분취량을 10 마이크로 리터로 만듭니다. 이전에 수득한 PCR 생성물 10 마이크로리터를 튜브당 효소 용액에 첨가한다. 잘 섞어서 이전에 시연 된 것처럼 탁상 미니 원심 분리기로 스핀 다운하십시오.
튜브를 프로그래밍된 열 사이클러 또는 열 블록에 놓으십시오. 추운 조건에서 배양 한 후 제품을 보관하십시오. 단일 강도 TAE 버퍼 50 밀리리터에 0.75 그램의 아가로스를 넣으십시오.
완전히 용해 될 때까지 전자 레인지에 아가로스를 혼합하고 가열하십시오. 그것을 식힌 후, 다섯 마이크로 리터의 DNA 얼룩을 넣고 부드럽게 섞으십시오. 25 밀리리터의 아가로스 젤을 젤 몰드에 붓고 젤이 응고되도록하십시오.
소화된 PCR 산물 10마이크로리터를 우물에 적재합니다. 젤을 35 분 동안 100 볼트로 실행하십시오. 자외선 하에서 아가로스 젤을 이미지화하십시오.
소화된 PCR 산물을 사용하여 수행된 아가로스 전기영동은 각 유전자형에서 서로 다른 크기의 여러 밴드를 생성했으며, 야생형의 두 밴드, 이형접합체에서 세 밴드, 동형접합체에서 각각 하나의 밴드를 가졌다. 배반포 분석을 통한 시험 주사는 공여체 올리고의 마이크로리터 당 50 나노그램을 주입할 때 76.9%의 성공률을 보였고, 동일한 공여체 올리고의 마이크로리터 당 25나노그램을 주입할 때 각각 25%의 성공률을 보였다. 마지막으로, 공여체 올리고의 마이크로리터 당 50 나노그램을 에탄올 침전으로 주입하여 50%의 성공률을 갖는 창시자 동물을 얻었다.
에탄올 침전에 의한 올리고 공여체의 정제는 높은 게놈 편집 효율을 유지하면서 독성을 낮췄다. 조심스럽게 취급하고 소량의 시약을 첨가하는 것은 매우 중요합니다. 올바르게 추가되고 잘 혼합되어 있는지 확인하십시오.
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개요
본 프로토콜은 Gja1 유전자에 M213L 단일 돌연변이가 발생하여 GJA1-20k 소형 동형 단백질(isoform)의 번역은 억제하고 전장(full-length) Connexin43의 생성만 유도하는 동물의 유전형 분석 방법을 설명합니다. 이 방법은 PCR 기반 유전형 분석에 제한 효소를 사용하여 효율성과 비용 효율성을 높이는 데 중점을 둡니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 유전학
- 분자생물학
- 동물 모델
배경
- 유전자 변이 식별의 중요성
- 단일 잔기 치환의 어려움
- 제노타이핑에서 제한 효소의 활용
사용된 방법
- PCR 기반 유전형 분석
- 점 돌연변이 마우스 모델
- DNA 분석을 위한 아가로스 겔 전기영동
주요 결과
- 뚜렷한 밴딩 패턴을 가진 유전자형의 성공적인 식별
- 파운더 동물 생성의 높은 성공률
- 유전자 분석을 위해 기술된 방법들의 검증된 효율성
결론
- 본 연구는 마우스 모델의 돌연변이 유전형 분석을 위한 효율적인 프로토콜을 제시합니다.
- 본 연구는 발생 생물학의 유전 연구를 위한 가치 있는 방법론을 제공합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
본 프로토콜은 마우스 모델에서 점 돌연변이의 정밀한 유전자형 분석을 가능하게 하여, 아이소폼 특이적 단백질 발현을 분석해야 하는 표적 검증 연구를 지원합니다. 이 방법은 전체 길이 단백질의 기능은 유지하면서 혼란을 주는 절단된 아이소폼을 제거함으로써, 초기 발견 단계에서의 기전적 리스크 제거(de-risking) 능력을 향상시킵니다. 또한, Connexin 43 생물학 및 관련 갭 결합 경로와 관련된 치료 가설의 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: N-말단 절단 동형 단백질(isoform)과 구별하여 전체 길이 Cx43의 기능적 기여도를 분리함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 대규모 코호트에서 야생형, 이형 접합 및 동형 접합 돌연변이 대립유전자를 구별할 수 있는 확장 가능한 유전형 분석 방법을 제공합니다.
- 예측적 가치: 관찰된 표현형이 전체 길이 단백질의 소실에서 비롯된 것인지 아니면 동형 단백질 특이적 기전으로 인한 것인지를 명확히 하여 포트폴리오 분류 및 우선순위 결정을 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 고처리량 스크리닝 워크플로우에 적합한 제한효소 절단 단편 패턴을 가진 DNA 샘플을 생성합니다.
- 정량적 결과: PCR-제한효소 절단 단편 길이 다형성 분석을 통해 대립유전자 특이적 정량이 가능합니다.
- 재현성: 기존 PCR 프로토콜에 저비용의 단일 효소를 추가함으로써 실험실 간 유전자형 분석을 표준화합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질환 관련성: Cx43 트래픽킹 및 갭 결합 조립이 심장, 신경 또는 종양성 질환과 연관된 전임상 모델 연구를 용이하게 합니다.
- 중개 연구의 연속성: GJA1-20k를 감소시키면서 전장 Cx43 발현을 유지함으로써 분자적 유전자형과 표현형 결과 사이의 연결 고리를 제공합니다.
- 위험 조정 결정: 생체 내(in vivo)에서 아이소폼 발현 수준과 기능적 판독 값 간의 상관관계를 분석할 수 있게 하여 go/no-go 결정 기준에 정보를 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
이 방법은 초기 타겟 검증부터 전임상 효능 시험까지의 발굴 연속 과정에 적합하며, 특히 isoform 특이적 단백질 기능을 분석해야 하는 경우에 유용합니다.
- 발견 생물학: 전장 단백질 기능과 절단된 동형 단백질(isoform) 활성을 구분하는 유전자 모델을 가능하게 하여 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: CRISPR 검증이나 번식 군집 관리와 같은 하위 응용 분야에 즉시 사용할 수 있는 분석용 게놈 DNA를 제공합니다.
- 분석: 아가로스 겔 상에서 명확하고 점수화 가능한 밴딩 패턴을 제공하여, 시퀀싱 없이도 신속하게 유전자형을 지정할 수 있게 합니다.
- 중개 연구: Cx43 막 국소화 및 세포 간 통신이 핵심 기전적 종점인 전임상 연구를 가능하게 합니다.
- 기업적 재사용: 제한 효소 인식 부위를 도입하거나 파괴할 수 있는 모든 점 돌연변이에 적용 가능하여, 재사용 가능한 유전자형 분석 플랫폼을 제공합니다.
운영 및 기업적 영향
- 과학적 가치: 동형 단백질(isoform)별 기여도를 분리하여 표적 검증의 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 단일 PCR 후 제한효소 처리 단계를 통해 처리량을 높이고 샘플당 비용을 절감합니다.
- 전략적 가치: 유전자형-표현형 관계를 명확히 함으로써 리드 최적화의 결정 신뢰도를 향상시킵니다.
- 포트폴리오 영향: Cx43 의존성 경로를 표적으로 하는 후보 물질의 위험 조정된 개발 진행을 가능하게 합니다.
구현 고려 사항
- PCR 프라이머 설계 및 제한 효소 선택에 관한 분자 생물학적 전문 지식이 필요합니다.
- 열 순환기(thermal cycler), 아가로스 겔 전기영동 시스템 및 UV 이미징 장비의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 일관된 결과를 얻기 위해서는 사용자 간 조직 용해 및 PCR 조건의 표준화가 필수적입니다.
- 대체 모델 시스템으로의 적용은 서열 맥락 및 제한 효소 호환성에 따라 달라집니다.
- 제한 효소 인식 부위를 변경하거나 생성하는 돌연변이로 제한되며, 침묵 돌연변이(silent mutation)의 경우 다른 전략이 필요할 수 있습니다.
