Name: DNA 커튼 기법에 의한 히스톤 조립의 분자 메커니즘 해독 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 배우세요 DNA 커튼 기법을 이용한 단일 분자 실시간 영상 분석으로 히스톤 조립 분자 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기법은 단백질-DNA 상호작용을 고해상도로 시각화하여 크로마틴 동역학 연구에 활용됩니다.

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저자들은 한국과학기술원(KAIST)의 송지준 교수, Carol Cho 박사, 장주원 교수의 Abo1 및 Cy5-H3-H4에 대한 친절한 지원에 감사드립니다. 본 연구는 국립연구재단 지원금(NRF-2020R1A2B5B01001792), 울산과학기술원 교내 연구비(1.210115.01), 기초과학연구원(IBS-R022-D1)의 지원을 받고 있다.

1. 플로우 셀(flow cell)의 준비
<ol><li>이전에 발표된 보고서25에 따라 나노 트렌치 패턴을 포함하는 세척된 용융 실리카 슬라이드를 준비합니다.<ol><li>다이아몬드 코팅된 드릴 비트를 사용하여 세척된 용융 실리카 슬라이드(그림 1A)에 직경 1mm의 구멍 두 개를 뚫습니다( 재료 표 참조).</li>
		<li>250mTorr의 아르곤 가스와 함께 DC스퍼터 32 ( 재료 표 참조)를 사용하여 슬라이드에 10nm의 두꺼운 알루미늄(Al)을 증착합니다.</li>
		<li>4% 950K 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA)( 재료 표 참조)의 310nm 두께 층을 4,000rpm에서 1분 동안 스핀 코팅하고 180°C의 열판에서 3분 동안 굽습니다.</li>
		<li>80kV에서 0.724nA 전류로 전자빔(ebeam) 리소그래피(33 )를 사용하여 두 구멍 사이의 PMMA 층 상에 나노 트렌치 패턴을 그립니다. 알림: 나노 트렌치 패턴의 구조와 치수는 그림 1A에 나와 있습니다.</li>
		<li>슬라이드를 현상액(메틸 이소부틸 케톤과 이소프로판올의 1:3 비율, 재료 표 참조)에 2분 동안 담가 ebeam에 노출된 PMMA를 제거합니다.</li>
		<li>염소(Cl2) 및 삼염화 붕소(BCl3) 가스를 사용하는 유도 결합 플라즈마 반응성 이온 에칭(ICP-RIE)이 있는 에칭 Al 층. 알림: 이 두 가스는 ebeam에 노출된 영역에서 Al을 제거할 수 있습니다.</li>
		<li>사불화황(SF4), 테트라플루오로메탄(CF4) 및 산소(O2) 가스를 사용하여 슬라이드에 나노 트렌치를 조각합니다( 재료 표 참조).</li>
		<li>슬라이드를 Al 에칭액(AZ 300 MIF 현상액, 재료 표 참조)에 10분 동안 담가 나머지 Al 층을 제거합니다.</li>
		<li>제작 후 슬라이드를 탈 이온수로 헹구고 목욕 형 초음파 발생기를 사용하여 30 분 동안 아세톤으로 초음파 처리합니다.</li>
		<li>슬라이드를 2% Hellmanex III 용액( 재료 표 참조)에서 자석 교반으로 최소 1일 동안 세척합니다.</li>
		<li>슬라이드를 아세톤으로 30분 동안 초음파 처리하고 1M NaOH에서 30분 동안 연속적으로 초음파 처리합니다.</li>
		<li>슬라이드를 탈이온수로 헹구고 질소(N2) 가스로 건조시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>양면 테이프의 중앙에 깨끗한 용지(5mm x 35mm)를 놓습니다. 슬라이드 위에 테이프를 부착하여 두 개의 구멍과 나노 패턴을 종이로 덮습니다.</li>
	<li>깨끗한 칼날을 사용하여 용지를 절제합니다(그림 1A).</li>
	<li>양면 테이프 위에 유리 커버슬립을 놓고 피펫 팁을 사용하여 커버슬립을 문질러 미세유체 챔버를 형성합니다(그림 1A).</li>
	<li>조립된 플로우 셀을 두 개의 현미경 슬라이드 사이에 놓고 클립으로 고정합니다.</li>
	<li>플로우 셀을 120°C 진공 오븐에서 45분 동안 굽습니다.</li>
	<li>핫 글루건을 사용하여 칩 기반 분석용 유체 커넥터( Nanoport)(재료 표 참조)를 열린 각 구멍에 부착하고 두 줄의 루어 잠금 튜브를 연결합니다.</li>
	<li>탈이온수 3mL가 들어 있는 Luer 잠금 주사기를 연결하고 챔버를 세척합니다.</li>
	<li>드롭 바이 드롭 연결을 통해 3mL의 지질 완충액 (20mM의 Tris-HCl, pH 8.0 및 100mM의 NaCl)으로 챔버를 세척합니다. 참고: 드롭바이드롭(drop-by-drop) 연결은 챔버에 기포가 주입되는 것을 방지하기 위해 모든 주사기를 플로우 셀에 연결합니다.</li>
	<li>지질 완충액에 있는 0.04x 비오틴화 지질 1mL를 샷당 5분 배양하여 두 번에 챔버에 주입합니다. 참고: 1x 비오틴화 지질 스톡의 제조는 이전에 발표된 보고서34에 설명되어 있습니다.</li>
	<li>챔버를 3mL의 지질 완충액으로 세척하고 슬라이드 표면에서 지질 이중층이 성숙되도록 20분 동안 배양합니다.</li>
	<li>BSA 완충액 1mL(Tris-HCl 40mM, pH 8.0, NaCl 50mM, MgCl2 2mM, BSA 0.2mg/mL)를 넣고 5분 동안 배양하여 슬라이드 표면을 부동태화합니다. 참고: 이 단계는 슬라이드 표면에 대한 단백질의 비특이적 결합을 줄일 수 있습니다.</li>
	<li>0.025mg/mL의 스트렙타비딘을 BSA 완충액 1mL에 2회 주입하고 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>잔류 스트렙타비딘을 3mL의 BSA 완충액으로 씻어냅니다.</li>
	<li>BSA 완충액 1mL에 ~300pM(30μL)의 비오틴화된 람다 파지 DNA를 2회 발사하고 10분 배양하여 챔버에 주입합니다. 참고: 비오틴화된 람다 DNA의 제조는 이전에 발표된 보고서34에 기재되어 있다.</li>
</ol>2. 플로우 셀을 미세유체 시스템에 연결하고 현미경에 로딩
<ol><li>Abo1 이미징 완충액(Tris-HCl 50mM, pH 8.0, NaCl 100mM, DTT 1mM, ATP 1mM,MgCl2 2mM, 글루코스 1.6% 및 글록시 0.1x, 재료 표 참조)을 준비합니다. 알림: Gloxy는 형광 염료의 광표백을 줄이는 산소 제거 시스템입니다. 글루코스 산화효소 및 카탈라아제를 이용한 100x 글록시 스톡의 제조는 참고문헌35에 기재되어 있다.</li>
	<li>10mL의 이미징 버퍼가 들어 있는 주사기를 주사기 펌프에 연결하고 미세유체 시스템의 모든 튜브 라인에서 기포를 제거합니다.</li>
	<li>drop-to-drop 연결을 통해 준비된 플로우 셀을 미세유체 시스템과 연결하여 플로우 셀에 기포가 주입되는 것을 방지합니다(그림 1B).</li>
	<li>플로우 셀(flow cell)과 플로우 셀(flow cell) 홀더를 조립하고 맞춤형 TIRF 현미경에 어셈블리를 장착합니다(그림 1C). 주의: 플로우 셀(flow cell)을 현미경 아래에 놓을 때 대물렌즈의 높이를 조심스럽게 설정하십시오. 플로우 셀이 대물렌즈에 닿지 않아야 합니다. 렌즈가 손상될 수 있습니다.</li>
	<li>플로우 셀(flow cell)의 중앙에 인덱스 매칭 오일을 떨어뜨리고 오일 드롭(oil drop)에 맞춤형 dove 프리즘( 재료 표 참조)을 놓습니다.</li>
</ol>3. DNA 커튼을 이용한 Abo1에 의한 히스톤 조립
<ol><li>150μL의 이미징 버퍼에 5nM의 Abo1과 12.5nM의 Cy5 표지된 H3-H4 히스톤 이량체(Cy5-H3-H4)( 재료 표 참조)를 혼합합니다. 모든 단백질은 이전에 발표된 보고서17에 따라 제조되었습니다.</li>
	<li>혼합물을 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 알림: Cy5의 광표백을 방지하려면 어둠 속에서 배양을 해야 합니다.</li>
	<li>100μL의 샘플 루프를 통해 이미징 버퍼에 ~20pM(2μL)의 YOYO-1 염료를 주입하여 람다 DNA 분자를 염색합니다.</li>
	<li>이미징 소프트웨어( 재료 표 참조)를 실행하고 488nm 레이저를 켜서 DNA 커튼이 잘 형성되었는지 확인합니다. 참고: DNA 커튼이 잘 형성된 경우, YOYO-1로 염색된 DNA 분자는 흐름이 있는 장벽에서 정렬된 선으로 표시됩니다. 늘어난 선은 흐름이 꺼지면 반동하고 장벽에서 멀리 확산됩니다.</li>
	<li>고염 완충액 2mL(NaCl 200mM 및MgCl2 40mM)를 주입하여 DNA에서 YOYO-1 염료를 제거합니다.</li>
	<li>YOYO-1 염료를 제거한 후, 미리 배양된 단백질 시료를 주입합니다.</li>
	<li>단백질이 DNA 커튼에 도달하면 주사기 펌프를 끄고 차단 밸브를 끄고 Abo1에 의한 히스톤 로딩을 위해 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>결합되지 않은 Abo1과 히스톤 단백질을 5분 동안 씻어냅니다.</li>
	<li>차단 밸브를 켜고 유량 주입을 재개합니다.</li>
	<li>637nm 레이저를 켜고 버퍼 흐름이 켜져 있는 동안 형광 단백질을 이미지화합니다.</li>
	<li>히스톤 단백질이 DNA에 로드되었는지 확인하기 위해 버퍼 흐름을 일시적으로 끕니다(그림 2C).</li>
	<li>이미지 획득 프로그램으로 DNA 커튼 이미지를 수집합니다( 재료 표 참조). 참고: 완충액 흐름이 일시적으로 멈추면 DNA는 전체 내부 반사의 소멸장에서 반동하고 DNA에 결합된 형광 표지 단백질이 사라집니다.</li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>이미지 획득 프로그램으로 촬영한 이미지를 이미지 시퀀스로 TIFF 형식으로 변환합니다. 참고: 모든 데이터는 참고 문헌20에 설명된 대로 이미지 J(NIH)를 사용하여 분석되었습니다.</li>
	<li>이미지 염기서열에서 단일 DNA 분자를 선택하고 카이모그래프를 그립니다. 참고 : kymograph는 시간의 함수로 단일 DNA 분자에 결합 된 각 히스톤 단백질의 형광 강도 변화를 보여줄 수 있습니다.</li>
	<li>카이모그래프에서 형광 강도 프로파일을 생성하고 여러 가우스 함수에 맞춥니다.</li>
	<li>형광 강도 프로파일에서 피크의 중심 좌표를 수집합니다. 이 단계에서 히스톤 형광의 최소 강도를 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>프로파일에서 수집된 모든 피크 강도를 최소 강도로 나눕니다. 이 단계에서 DNA에 결합된 H3-H4 이량체의 수를 추정합니다.</li>
	<li>다른 DNA 분자에 대해 4.2-4.5단계를 수행합니다.</li>
	<li>Bin 크기가 1kbp인 H3-H4 이량체의 결합 분포에 대한 히스토그램을 생성합니다. 분석된 분자의 수는 300개 이상입니다.</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

단일 분자 이미징 기술로서, DNA 커튼은 DNA 대사 반응을 조사하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다43. DNA 커튼은 지질 유동성, 미세유체역학 및 TIRFM을 연결하는 하이브리드 시스템입니다. 다른 단일 분자 기술과 달리 DNA 커튼은 단백질-DNA 상호 작용의 고처리량 실시간 시각화를 가능하게 합니다. 따라서 DNA 커튼 기술은 염기서열 특이적 연관성, DNA와 함께 단백질 이동, DNA 17,20,26에 대한 단백질-단백질 충돌을 포함한 분자 상호 작용의 메커니즘을 조사하는 데 적합합니다. 또한 DNA 커튼의 고처리량 특성으로 인해 통계적 신뢰성을 보장하기에 충분한 데이터를 수집할 수 있습니다. DNA 커튼은 운동 매개 변수, 확산 계수, 속도 및 진행도 17,26,27,30을 포함하여 단백질의 생체 물리 화학적...

진핵생물 DNA는 염색질 1,2로 알려진 고차원 구조로 포장되어 있습니다. 뉴클레오솜은 크로마틴의 기본 단위로, 팔각형 코어 히스톤 3,4를 감싸고 있는 약 147bp DNA로 구성됩니다. 염색질은 진핵 세포에서 중요한 역할을합니다. 예를 들어, 조밀한 구조는 내인성 요인과 외인성 위협으로부터 DNA를 보호한다5. 염색질 구조는 세포주기 단계와 환경 자극에 따라 동적으로 변화하며, 이러한 변화는 복제, 전사 및 복구와 같은 DNA 거래 중에 단백질 접근을 제어한다6. 염색질 역학은 게놈 안정성과 후성유전학적 정보에도 중요합니다.
염색질은 히스톤 꼬리 변형 및 염색질 리모델러, 폴리콤 그룹 단백질 및 히스톤 샤페론과 같은 염색질 조직자를 포함한 다양한 요인에 의해 동적으로 조절됩니다7. 히스톤 샤페론은 코어 히스톤의 증착 또는 분리를 통해 뉴클레오솜의 조립 및 분해를 조정합니다 8,9. 히스톤 샤페론의 결함은 게놈 불안정성을 유발하고 발달 장애와 암을 유발한다 9,10. 다양한 히스톤 샤페론은 뉴클레오솜 9,11,12,13을 조립하거나 분해하기 위해 ATP 가수 분해와 같은 화학적 에너지 소비가 필요하지 않습니다. 최근 연구자들은 브로모도메인 함유 AAA+(다양한 세포 활동과 관련된 ATPase) ATPase가 히스톤 샤페론 14,15,16,17로 염색질 역학에서 역할을 한다고 보고했습니다. 인간 ATAD2(ATPase 계열 AAA 도메인 함유 단백질 2)는 염색질 접근성을 촉진하여 유전자 발현을 향상시킵니다18. 전사 공동-조절자로서, ATAD2는 발암성 전사인자(oncogenic transcriptional factor)의 염색질을 조절하며(14), ATAD2의 과발현은 많은 유형의 암에서 나쁜 예후와 관련이 있다19. ATAD2의 맥주효모균(S. cerevisiae) 상동체인 Yta7은 염색질15의 뉴클레오솜 밀도를 감소시킵니다. 대조적으로, ATAD2의 Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) 상동체인 Abo1은 뉴클레오솜 밀도16을 증가시킨다. 독특한 단일 분자 이미징 기술인 DNA 커튼을 사용하여 Abo1이 뉴클레오솜 조립 또는 분해에 기여하는지 여부를 다룹니다17,20.
전통적으로 생체 분자의 생화학적 특성은 많은 수의 분자를 조사하는 EMSA(electrophoretic mobility shift assay) 또는 co-immunoprecipitation(co-IP)과 같은 벌크 실험에 의해 조사되어 왔으며 평균 특성은21,22를 특성화합니다. 대량 실험에서 분자 하위 상태는 앙상블 평균 효과에 의해 가려지며 생체 분자 상호 작용 조사가 제한됩니다. 대조적으로, 단일 분자 기술은 대량 실험의 한계를 우회하고 생체 분자 상호 작용의 상세한 특성 분석을 가능하게 합니다. 특히, 단일 분자 이미징 기술은 DNA-단백질 및 단백질-단백질 상호 작용을 연구하는 데 널리 사용되었습니다23. 그러한 기술 중 하나는 DNA 커튼, 미세 유체 역학 및 전체 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM) 24,25을 기반으로 한 독특한 단일 분자 이미징 기술입니다. DNA 커튼에서는 수백 개의 개별 DNA 분자가 지질 이중층에 고정되어 지질 유동성으로 인해 DNA 분자의 2차원 운동을 허용합니다. 유체역학적 흐름이 적용되면 DNA 분자는 이중층의 흐름을 따라 이동하고 확산 장벽에 갇혀 정렬되고 늘어납니다. DNA가 삽입제로 염색되는 동안 형광 표지된 단백질이 주입되고 TIRFM을 사용하여 단일 분자 수준23에서 실시간으로 단백질-DNA 상호 작용을 시각화합니다. DNA 커튼 플랫폼은 확산, 전위 및 충돌과 같은 단백질 이동의 관찰을 용이하게 합니다 26,27,28. 또한, DNA 커튼은 정의된 위치, 방향 및 토폴로지를 가진 DNA에 대한 단백질 매핑에 사용되거나 단백질과 핵산의 상 분리 연구에 적용될 수 있습니다 29,30,31.
이 연구에서 DNA 커튼 기술은 특정 단백질의 직접적인 시각화를 통해 샤페론의 기능에 대한 증거를 제공하는 데 사용됩니다. 또한, DNA 커튼은 처리량이 많은 플랫폼이기 때문에 통계적 신뢰성에 충분한 데이터 수집을 용이하게 합니다. 여기에서는 S. pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase Abo1의 분자 역할을 조사하기 위해 DNA 커튼 분석을 수행하는 방법을 자세히 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>1 mL 루어락 주사기</td><td>BecktonDickinson</td><td>301321</td><td></td></tr><tr><td>1' x 3' 융합 실카 슬라이드 유리</td><td>G. Finkenbeiner</td><td></td><td>1 인치 x 3 인치 직사각형 및 1 mm 두께</td></tr><tr><td>10 mL 루어락 주사기</td><td>BecktonDickinson</td><td>302149</td><td></td></tr><tr><td>18:1 (&Delta; 9-Cis) PC (DOPC)</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td>이것은 비오틴화된 지질 스톡</td></tr><tr><td>18:1의 구성 요소입니다 비오티닐 캡 PE</td><td>Avanti</td><td>870273</td><td>이것은 비오틴화된 지질 스톡</td></tr><tr><td>18:1 PEG2000 PE</td><td>Avanti</td><td>880130</td>의 <td>구성 요소입니다 이것은 비오틴화된 지질 스톡</td></tr><tr><td>3 mL 루어락 주사기</td><td>BecktonDickinson</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>6방향 샘플 주입 밸브의 구성 요소입니다.</td><td>IDEX</td><td>MX 시리즈 II</td><td></td></tr><tr><td>950K PMMA</td><td>전체 저항</td><td>671.04</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>SAMCHUN</td><td>A1759</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 5'-트리포스페이트 디소듐 염 수화물(ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄(Al)</td><td>TASCO, 대한민국</td><td>LT50AI414</td><td>직경 4인치, 두께 1/4인치</td></tr><tr><td>Amicon 초원심 필터, MWCO 10kDa</td><td>Millipore</td><td>Z648027</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Mbcell</td><td>MB-A4128</td><td>항생제</td></tr><tr><td>AZ 300 MIF 개발자</td><td>Merck</td><td>10454110521</td><td>알루미늄 블레이드</td></tr><tr><td></td><td>DORCO</td><td>DN52</td><td>12mm x 6m</td></tr><tr><td>삼염화붕소 (BCl3)</td><td>UNIONGAS</td><td></td><td>순도: >99.99%</td></tr> <tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C40-1g</td><td>이것은 100x gloxy stock</td></tr><tr><td>염소 (Cl2)</td><td>UNIONGAS</td><td></td>의 구성 요소입니다. <td>순도: >99.99%</td></tr><tr><td>Clear 양면 테이프</td><td>3M</td><td>313770</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DC sputter</td><td>Sorona</td><td>SRM-120</td><td>슬라이드의 알루미늄 증착에 사용</td></tr><tr><td>다이아몬드 코팅 드릴 비트</td><td>Eurotool</td><td>DIB-211.00</td><td>fusced 실리카 슬라이드에 구멍을 뚫는 데 사용</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Dove-prism</td><td>Korea Electro-Optics Co., Ltd.</td><td>1906-106</td><td>반사 방지 코팅이 된 맞춤형 용융 실리카 비둘기 프리즘</td></tr><tr><td>드릴</td><td>Dremel Dremel</td><td>3000</td><td>fusced 실리카 슬라이드에 구멍을 뚫는 데 사용</td></tr><tr><td>Electron Bean Lithography</td><td>Nanobeam Ltd.</td><td>NB3</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 - 디아민 - 테트라 아세트산 (EDTA)</td> <td>시그마</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>핑거 타이트 피팅</td><td>IDEX</td><td>F-300</td><td>그것은 "PFA 튜빙 자연"과 연결되어 루어 잠금 튜브</td></tr><tr><td>플랜지리스 수 너트</td><td>IDEX</td><td>P-235</td>를 형성하기 <td>위해 "PFA 튜브 자연"과 연결되어 루어 잠금 튜브</td></tr><tr><td>동결 건조기, HyperCOOL</td><td>Labogene</td>을 형성합니다<td>HC3110</td><td>액체 단백질 동결 건조에 사용</td></tr><tr><td>포도당 산화 효소</td><td>시그마</td><td>G2133-50KU</td><td>이것은 100x gloxy stock</td></tr><tr><td>Guanidinium hydrochloride</td><td>Acros Organics</td><td>364790025</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 주사기</td><td>Hamilton Company</td><td>80065</td>의 구성 요소입니다 이 <td>주사기는 샘플 주입에 사용됩니다</td></tr><tr><td>Hellmanex</td><td>III Sigma</td><td>Z805939</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg</td><td>Cytiva</td><td>28-9893-36</td><td>FPLC에 사용 (크기 제외)</td></tr> <tr><td>핫 플레이트 교반기</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Sigma</td><td>H1759</td><td>Tris-HCl</td></tr><tr><td>Index 매칭 오일</td>에 사용 <td>ZEISS</td><td>444970-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>유도 결합 플라즈마 반응성 이온 에칭</td><td>Top Technology Ltd.</td><td>FabStar</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Glentham Life Sciences</td><td>GC6586-100g</td><td>&beta;-galactosidase 활성 유도에 사용</td></tr><tr><td>Lambda phage DNA</td><td>NEB</td><td>N0311</td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>BD difco</td><td>244610</td><td>E.coli 세포 성장용</td></tr><tr><td>배지 Luer adapter 10-32</td><td>IDEX</td><td>P-659</td><td>이것은 luer-lock을 연결합니다. 주사기 및 튜빙</td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>피셔 생물 시약</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>메틸 이소부틸 케톤(MIBK)</td>KAYAKU <td>용액 개발에 사용되는</td> <td>고급 재료</td><td></td></tr><tr><td>현미경(Eclipse Ti2)</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti2</td><td>도립 형광 현미경</td></tr><tr><td>현미경 유리 커버슬립</td><td>MARIENFELD</td><td>101142</td><td>22 x 50mm(No. 1)</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>DURAN GROUP</td><td>DU.2355013</td><td>슬라이드 유리 접지 가장자리 45°, 일반 26 x 76mm</td></tr><tr><td>Nanoport</td><td>IDEX</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td>대물 렌즈</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apochromat VC 60XC WI</td><td>침수 유형: 물, 배율: 60배, 보정: 18, 작동 거리: 0.29 (0.31-0.28)</td></tr><tr><td>One Shot BL21 (DE3)pLysS 화학적 유능 대장균</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C6060-03</td><td>단백질 과발현 가능 세포</td></tr><tr><td>산소(O2)</td><td>NOBLEGAS, 대한민국</td><td></td><td>순도: >99.99%</td></tr><tr><td>PFA 튜빙 천연</td><td>IDEX</td><td>1512L</td> 루어락 튜빙 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)로슈 11359061001 프로테아제 억제제를 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>형성하기 위해 "핑거타이트 피팅"과 연결됩니다.Sephacryl S-200 High Resolution</td><td>Cytiva</td><td>17-0584-01</td><td>FPLC에 사용 (크기 제외)</td></tr><tr><td>차단 밸브</td><td>IDEX</td><td>P-732</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>나트륨 시그마</td><td>791741</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td><td>시그마</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨 (NaOH)</td><td>시그마</td><td>s5881</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 분자다공성 멤브레인 튜브, MWCO 6-8 kDa</td><td>Spectrum laboratories</td><td>132660</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S888</td><td></td></tr><tr><td>황테트랄플루오라이드(SF4)</td><td>NOBLEGAS, 대한민국</td><td></td><td>순도: >99.99%</td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>KD Scientific</td><td>78-8210</td><td></td></tr><tr><td>테트라플루오로메탄(CF4)</td><td>NOBLEGAS, 대한민국</td><td></td><td>순도 : >99.99 %</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Tris-HCl</td></tr><tr><td>TSKgel SP-5PW</td><td>TOSOH</td><td>14715</td><td>FPLC (이온 교환)에 사용</td></tr> Union <tr><td>assembly</td><td>IDEX</td><td>P-760</td><td>이것은 튜빙</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>진공 오븐</td><td>Jeio Tech</td><td>OV-11</td><td></td></tr>을 연결합니다.<tr><td>YOYO-1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Y3601</td><td>이 인터칼레이션 염료는 DMSO</td></tr><tr><td>&베타;-메르캅토에탄올(BME)</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr>에 희석됩니다</tbody></table>.

dna 커튼 기법에 의한 히스톤 조립의 분자 메커니즘 해독

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

크로마틴은 진핵생물 DNA를 포장하는 고차원 구조입니다. 크로마틴은 세포 주기 단계와 환경 자극에 대한 반응에 따라 동적 변화를 겪습니다. 이러한 변화는 게놈 무결성, 후성유전학적 조절 및 복제, 전사 및 복구와 같은 DNA 대사 반응에 필수적입니다. 염색질 조립은 염색질 역학에 매우 중요하며 히스톤 샤페론에 의해 촉매됩니다. 광범위한 연구에도 불구하고 히스톤 샤페론이 염색질 조립을 가능하게 하는 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵습니다. 더욱이, 히스톤 샤페론(histone chaperone)에 의해 조직된 뉴클레오솜(nucleosome)의 전반적인 특징은 잘 이해되지 않고 있다. 이 문제를 다루기 위하여는, 이 일은 히스톤 chaperones에 의하여 뉴클레오솜 집합의 분자 세부사항의 수사를 촉진하는 DNA 커튼이라고 지명된 유일한 단 하나 분자 화상 진찰 기술을 기술합니다. DNA 커튼은 지질 유동성, 미세유체역학 및 전반사 형광 현미경(TIRFM)을 결합하여 다양한 단백질-DNA 상호 작용의 실시간 이미징을 위한 범용 플랫폼을 제공하는 하이브리드 기술입니다. DNA 커튼을 사용하여 Abo1의 히스톤 샤페론 기능, Schizosaccharomyces pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase를 조사하고 Abo1의 히스톤 조립의 기저에 있는 분자 메커니즘을 밝힙니다. DNA 커튼은 염색질 역학을 연구하기 위한 독특한 접근 방식을 제공합니다.

이 작업은 DNA 커튼 분석을 위한 플로우 셀 준비 절차를 설명합니다(그림 1A). DNA 커튼 분석은 Abo1에 의한 DNA에 대한 히스톤 H3-H4 이량체 조립의 연구를 촉진했습니다. 먼저, 삽입 염료인 YOYO-1로 DNA 분자를 염색하여 DNA 커튼 형성을 확인했습니다. 녹색 선은 병렬 배열로 표시되었는데, 이는 YOYO-1이 DNA 분자에 삽입되어 유체역학적 흐름 하에서 확산 장벽에서 잘 정렬되고 늘어났음을 나타냅니다(그림 2A). YOYO-1이 DNA와 히스톤 단백질의 상호작용을 방해할 가능성을 배제하기 위해, 히스톤 단백질을 첨가하기 전에 고염 완충액으로 DNA에서 YOYO-1을 제거하였다. Abo1이 없는 상태에서 Cy5-H3-H4 이량체를 DNA 커튼에 주입했을 때 Cy5-H3-H4는 DNA에 결합하지 않았으며, 이는 H3-H4 이량체가 DNA에 자발적으로 결합하지 않았음을 나타냅니다(<strong clas...

고처리량 단일 분자 이미징 기술인 DNA 커튼은 다양한 단백질-DNA 상호 작용의 실시간 시각화를 위한 플랫폼을 제공합니다. 본 프로토콜은 DNA 커튼 기술을 활용하여 Schizosaccharomyces pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase인 Abo1의 생물학적 역할과 분자 메커니즘을 조사합니다.

DNA 커튼 기법에 의한 히스톤 조립의 분자 메커니즘 해독

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

이 프로토콜은 DNA 커튼 기술이 염색질 역학을 연구하는 방법, 특히 히스톤 샤페론의 분자 기능을 조사하는 방법을 보여줍니다. 고처리량 단일 분자 이미징 기술 DNA 커튼은 대량 실험의 한계를 극복하고 실시간 이미징을 용이하게 하여 생체 분자 상호 작용의 상세한 특성 분석을 가능하게 합니다. 양면 테이프의 중앙에 치수 5 x 35mm의 깨끗한 용지를 놓습니다.슬라이드 위에 테이프를 부착하여 두 개의 구멍과 나노 패턴을 종이로 덮습니다. 그런 다음 깨끗한 칼날을 사용하여 종이를 절제하십시오. 양면 테이프 위에 유리 커버 슬립을 놓고 피펫 팁을 사용하여 커버 슬립을 문질러 미세유체 챔버를 형성합니다.조립된 플로우 셀을 두 개의 현미경 슬라이드 사이에 놓고 클립으로 고정합니다. 플로우 셀을 섭씨 120도의 진공 오븐에서 45분 동안 굽습니다. 핫 글루건을 사용하여 칩 기반 분석을 위한 유체 커넥터를 열린 각 구멍에 부착합니다.그리고 두 줄의 루어 잠금 튜브를 연결하십시오. 탈이온수 3밀리리터가 들어 있는 루어 잠금 주사기를 연결하고 챔버를 세척합니다. 드롭 바이 드롭 연결을 통해 3m리터의 지질 완충액으로 챔버를 다시 세척합니다.지질 완충액에 0.04x 비오틴화 지질 1mL를 챔버에 2회 주입하고 샷당 5분 동안 배양합니다. 스트렙타비딘 1밀리리터당 0.025밀리그램을 BSA 1밀리리터에 2회 주입하고 10분 동안 배양합니다. BSA 완충액 1밀리리터에 약 30피코몰의 비오틴화된 람다 파지 DNA를 챔버에 2회 주입하고 10분씩 배양합니다.10mL의 이미징 버퍼가 들어 있는 주사기를 주사기 펌프에 연결하고 미세유체 시스템의 모든 튜브 라인에서 기포를 제거합니다. drop-to-drop 연결을 통해 준비된 플로우 셀을 미세유체 시스템과 연결하여 플로우 셀에 기포가 주입되는 것을 방지합니다. 플로우 셀(flow cell)과 플로우 셀(flow cell) 홀더를 조립하고, 맞춤형으로 제작된 전반사 형광 현미경(total internal reflection fluorescence microscope)에 어셈블리를 장착합니다.100 마이크로리터의 샘플 루프를 통해 이미징 버퍼에 200 마이크로리터의 YOYO-1 염료를 주입하여 Lambda DNA 분자를 염색합니다. 이미징 소프트웨어를 실행하고 488나노미터 레이저를 켜서 DNA 커튼이 잘 형성되었는지 확인합니다. YOYO-1 염료를 제거한 후, 미리 배양된 단백질 시료를 주입합니다.단백질이 DNA 커튼에 도달하면 주사기 펌프를 끄고 차단 밸브를 끄고 Abo1에 의한 히스톤 로딩을 위해 15분 동안 배양합니다. 결합되지 않은 Abo1과 히스톤 단백질을 5분 동안 씻어냅니다. 히스톤 단백질이 DNA에 로드되었는지 확인하기 위해 버퍼 흐름을 일시적으로 끕니다.DNA 커튼 형성은 보간 염료로 DNA 분자를 염색하여 확인했습니다. 평행 배열로 표시된 녹색 선은 DNA 분자에 삽입된 YOYO1이 유체역학적 흐름 하에서 확산 장벽에서 잘 정렬되고 늘어났음을 나타냅니다. Abo1이 없는 상태에서 Cy5-H3-H4 이량체를 DNA 커튼에 주입했을 때, Cy5-H3-H4는 DNA에 결합하지 않았으며, 이는 H3-H4 이량체가 DNA에 자발적으로 결합하지 않았음을 나타냅니다.Cy5-H3-H4에 Abo1을 주입했을 때 DNA 분자에서 적색 형광 반점이 보였는데, 이는 Abo1이 H3-H4 이량체를 DNA에 로드한다는 것을 시사합니다. 형광 신호는 완충액 흐름이 없을 때 사라졌다가 흐름이 재개되었을 때 다시 나타나 H3-H4 이량체가 DNA에 결합한다는 것을 시사합니다. H3-H4 이량체가 DNA에 결합하는 것은 카이모그래프에 의해서도 확인되었는데, 이 카이모그래프에서는 흐름이 꺼질 때마다 형광 신호가 사라졌습니다.뉴클레오티드가 없거나 ADP가 있는 경우 DNA 커튼에 형광 반점이 거의 나타나지 않았으며, 이는 H3-H4 이량체가 Apo 상태 또는 ADP의 존재 하에서 DNA에 거의 결합하지 않음을 나타냅니다. 정량 분석은 DNA에 결합된 H3-H4 이량체의 수가 ATP의 존재 하에서 증가한다는 것을 보여줍니다. 결과는 ATP 가수분해가 Abo1에 의해 DNA에 H3-H4 로딩에 필수적임을 시사합니다.플로우 셀(flow cell)에 기포가 주입되는 것을 방지하는 것이 모든 단계에서 가장 중요합니다. 따라서 이 프로토콜에서는 드롭 바이 드롭 연결을 강조합니다. DNA 커튼 분석은 이중 나노 패턴이 있는 이중 테더 DNA 커튼으로 확장할 수 있습니다.또한 단일 가닥 DNA, RNA 또는 액틴 필라멘트로 다른 유형의 DNA 커튼을 만들 수 있습니다. DNA 커튼은 DNA의 단백질 움직임을 시각화하고 표적 검색 메커니즘에 대한 연구를 용이하게 합니다. DNA 커튼은 복제 및 전사를 포함한 DNA 대사를 연구하기 위해 확장될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

히 - C 방식은 염색질 상호 작용 (1) 편견, 게놈 차원의 식별이 가능합니다. 히 - C의 커플 근접 결합 및 대규모 병렬 시퀀싱합니다. 그 결과 데이터가 여러 스케일에서 게놈 구조를 연구하는 데 사용할 수 있습니다 : 초기 결과는 같은 염색체 지역, 개방적이고 닫힌 염색질의 분리 및 megabase 규모의 염색질 구조와 같은 기능을 확인.

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

3DNA 소프트웨어 패키지, 분석 구축, 3 차원 핵산 구조를 시각화하는 기능을 갖춘 인기있는 다양한 생물 정보학 도구입니다. 이 문서에서는 각각의 구조 및 관련 구조의 앙상블에 모두 적용 3DNA에서 사용할 수있는 새로운 대중적인 기능의 하위 집합에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

3DNA과 핵산의 구조를 분석하고 구축

이 비디오는 단일 분자 이미징을 사용하여 특정 유전자 자리에서 DNA 분자의 융합 단백질 응축물 어셈블리를 시각화하는 방법을 설명합니다. 이러한 응축물은 LCD-LCD 및 LCD-DBD 상호 작용으로 인해 형성되며, 이를 통해 RNA 중합효소 II를 동원하고 유전자 전사를 향상시킬 수 있습니다.

DNA 커튼에서 융합 단백질 응축물 어셈블리를 시각화하기 위한 단일 분자 이미징

방법은 재조합 핵심 히스톤에서 모델 뉴 클레오 어레이의 재구성 및 tandemly 반복 뉴 클레오 솜 위치의 DNA에 표시됩니다. 또한 분석에서 초 원심 침강 속도 실험, 및 원자 힘 현미경 (AFM)을 재구성 후의 뉴 클레오 배열 포화 정도를 모니터링하는 데 사용되는 방법을 설명한다.

재조합 핵심 히스톤에서 뉴 클레오 배열과 뉴 클레오 솜 위치 DNA의 조립

표적 DNA 손상은 DNA 손상제를 삼중 형성 올리고뉴클레오티드(TFO)에 묶음으로써 달성할 수 있습니다. 변형된 TFO를 사용하여, DNA 손상 특이적 단백질 결합, 및 DNA 토폴로지 변형은 본원에 기술된 변형된 염색질 면역침전 분석 및 DNA 슈퍼코일링 분석의 활용에 의해 인간 세포에서 연구될 수 있다.

도구 나선 왜곡, 사이트 별 DNA Interstrand 가교의 처리에 건축 단백질 HMGB1의 역할을 연구하는

여기, 우리는 프로토콜 nucleosome 정적 및 시간 경과 원자 힘 현미경 (AFM) 이미징 기술을 사용 하 여 단일 분자 수준에서 입자의 특성을 제시. 설명 된 표면 기능화 방법 구조의 캡처 및에 nucleosomes의 역학에 대 한 수는 nanoscale에 고해상도.

구조와 원자 힘 현미경 이미징 사용 하 여 Nucleosomes의 역학 조사

여기에서는 DNA에 조립되는 EWS-FLI1 응축수의 생물물리학적 메커니즘을 연구하기 위해 단일 분자 이미징 방법인 DNA 커튼의 사용에 대해 설명합니다.

DNA에 조립되는 EWS-FLI1 응축수의 단일 분자 이미징

DNA 리간드를 이용한 ATP 의존형 크로마틴 리모델링기의 상호 작용은 CD 분광법을 사용하여 설명된다. 생성된 봉우리에 의해 분석된 유전자 프로모터에 대한 유도된 변형 변화는 전사 조절의 메커니즘을 이해하는 데 사용될 수 있다.

DNA 단백질 상호 작용을 연구하는 CD 분광법

이 프로토콜은 위상 연관 도메인(TAD)의 경계 및 조절 및 기타 DNA 서열 요소 간의 장거리 염색질 상호 작용을 포함하여 고해상도에서 메가 기반 크기의 표적 게놈 영역의 3D 조직을 특성화하는 데 사용되는 Capture Hi-C 방법을 설명합니다.

Capture Hi-C를 통한 고분해능 3D 염색질 조직 해독

이 기사에서는 단일 분자 상관력 및 형광 현미경을 위해 뉴클레오솜 함유 DNA 테더를 재구성하는 자세한 실험 절차를 제시합니다. 또한 염색질 상호 작용 단백질의 결합 거동을 시각화하고 뉴클레오솜의 물리적 특성 변화를 분석하기 위해 수행할 수 있는 여러 다운스트림 실험에 대해 설명합니다.

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

배우세요 DNA 커튼 기법을 이용한 단일 분자 실시간 영상 분석으로 히스톤 조립 분자 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기법은 단백질-DNA 상호작용을 고해상도로 시각화하여 크로마틴 동역학 연구에 활용됩니다.

DNA 커튼 기법에 의한 히스톤 조립의 분자 메커니즘 해독

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