표적 하에서 초저 입력 절단을 이용한 크로마틴에 대한 단일 세포 인자 국소화 및 뉴클레아제를 이용한 방출

CUT&RUN은 크로마틴에 대한 단백질 국소화를 결정하는 강력한 기술이며, 여기서는 이 기술의 단일 세포 버전을 수동 96웰 형식으로 설명합니다. ChIP-seq와 같은 대부분의 단백질 국소화 기술은 높은 세포 투입이 필요하며 완료하는 데 약 사흘이 걸립니다. CUT&RUN은 높은 신호와 낮은 배경으로 인해 로우 셀 및 단일 셀 애플리케이션에 최적화되어 있으며 하루 만에 완료 할 수 있습니다.

우리는이 기술이 거의 모든 생물학적 샘플에 적용될 수 있으며 귀중한 환자 샘플과 같은 희귀하고 저농축 샘플에서 인자 현지화를 결정하는 데 특히 강력 할 수 있다고 생각합니다. 단일 세포 실험을 수행하기 전에 많은 수의 귀중하지 않은 세포에 대한 항체 및 기술을 테스트하십시오. 이 실험의 주요 한계는 강건한 항체에 대한 의존성이다.

이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 숙련 된 연구 전문가 인 Santana Lardo입니다. 단일 세포를 분류하고 핵을 비드에 결합시킨 후, 96-웰 플레이트를 96-웰 마그네틱 랙 상에 놓고 비드가 최소 5분 동안 결합하도록 한다. 그런 다음 상청액을 제거하고 버립니다.

핵 결합 비드에 블로킹 버퍼 100 마이크로리터를 첨가하고, 부드러운 피펫팅과 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 96웰 마그네틱 랙에 놓고 상층액을 최소 다섯 분 동안 맑게 합니다. 그런 다음, 비드를 방해하지 않고 상층액을 제거하고 버린다.

마그네틱 랙에서 플레이트를 제거하고 부드러운 피펫팅으로 반응 당 100 마이크로 리터의 세척 버퍼에 비드를 재현탁하십시오. 플레이트를 96웰 마그네틱 랙에 다시 놓고 상층액을 맑게 한 다음 상층액을 제거하고 버립니다. 부드러운 피펫팅으로 반응 당 25 마이크로 리터의 세척 완충액에 비드를 재현탁하십시오.

반응 당 25 마이크로리터의 세척 완충액을 분취하여 일차 항체 마스터 혼합물을 만든 다음, 반응 당 0.5 마이크로리터의 항체를 첨가한다. 25.5 마이크로리터의 항체 세척 완충액 믹스를 첨가하고, 이어서 관심있는 단백질을 표적화하는 항체로 처리되는 각 샘플에 부드럽게 피펫팅하였다. 실온에서 한 시간 동안 배양한다.

그런 다음 샘플을 다시 96웰 마그네틱 랙에 놓습니다. 상층액이 맑아지면 구슬을 방해하지 않고 제거하고 버리십시오. 마그네틱 랙에서 플레이트를 제거한 후, 비드를 100 마이크로리터의 세척 완충액으로 세척하고 피펫팅으로 재현탁시킨다.

플레이트를 다시 96-웰 마그네틱 랙 상에 놓고 이전에 입증된 바와 같이 상청액을 폐기한 후, 각 샘플을 25 마이크로리터의 세척 완충액에 재현탁시킨다. 반응 당 25 마이크로리터의 세척 완충액 및 최적화된 양의 단백질 A MNase를 첨가하여 단백질 A MNase 마스터 혼합물을 만든다. 25 마이크로리터의 단백질 A MNase 마스터 혼합물을 대조군 샘플을 포함한 각 샘플에 첨가한다.

샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 96웰 마그네틱 랙에 놓습니다. 상청액을 최소 다섯 분 동안 맑게 한 다음 비드를 방해하지 않고 상층액을 제거하고 버립니다.

마그네틱 랙에서 플레이트를 제거한 후, 비드를 100 마이크로리터의 세척 완충액으로 세척하고 부드러운 피펫팅으로 재현탁시킨다. 플레이트를 96웰 마그네틱 랙에 놓고 앞서 시연한 바와 같이 상층액을 버립니다. 이어서, 마그네틱 랙으로부터 샘플을 제거하고, 부드러운 피펫팅에 의해 50 마이크로리터의 세척 완충액에 비드를 재현탁시킨다.

샘플을 다섯 분 동안 얼음물 혼합물에서 섭씨 영도로 평형화시킨 다음, 샘플을 빙수 욕조에서 제거한다. 다채널 피펫을 사용하여 100 밀리몰 염화칼슘 1 마이크로 리터를 추가하십시오. 대용량 다중 채널 피펫을 사용하여 부드러운 피펫팅으로 세 번에서 다섯 번 잘 섞은 다음 샘플을 섭씨 영도로 되돌립니다.

접시가 얼음 물 욕조에 돌아 오자마자 10 분 타이머를 시작하십시오. RSTOP+의 두 배 농도를 함유하는 용액 50 마이크로리터를 피펫팅하여 반응을 중지시키고 염화칼슘과 동일한 순서로 각 웰에 완충액을 첨가하였다. 샘플을 섭씨 37도에서 20분 동안 인큐베이션한다.

플레이트를 섭씨 4도에서 5분 동안 16, 000배 G로 회전시킵니다. 플레이트를 96웰 마그네틱 랙에 놓습니다. 상청액을 최소 다섯 분 동안 맑게하십시오.

그런 다음 상청액을 신선한 96-웰 플레이트로 옮기고 비드를 버립니다. DNA 추출을 위해, 각 샘플에 밀리리터 당 20밀리그램의 10%SDS 및 0.83 마이크로리터의 프로테이나제 K를 첨가하고 부드러운 피펫팅으로 샘플을 혼합한다. 샘플을 섭씨 70도에서 10분 동안 인큐베이션한다.

플레이트를 실온으로 되돌립니다. 46.6 마이크로 리터의 5 몰 염화나트륨과 90 마이크로 리터의 50 % PEG4000을 넣고 부드러운 피펫팅으로 혼합하십시오. 33 마이크로리터의 폴리스티렌 마그네타이트 비드를 각 샘플에 첨가하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다.

플레이트를 마그네틱 랙에 놓고 상층액이 약 다섯 분 동안 맑아지도록하십시오. 그런 다음 구슬을 방해하지 않고 조심스럽게 상청액을 버리십시오. 구슬을 방해하지 않고 150 마이크로 리터의 80 % 에탄올로 두 번 헹구십시오.

플레이트를 1000 배 G에서 30 초 동안 잠깐 회전시킵니다. 플레이트를 96웰 마그네틱 랙에 다시 놓고 비드를 방해하지 않고 잔류 에탄올을 모두 제거합니다. 샘플을 약 두 분에서 다섯 분 동안 공기 건조시킵니다.

비드를 pH 8의 10-밀리몰 TRIS 하이드로클로라이드의 37.5 마이크로리터에 재현탁시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 마그네틱 랙에 다시 놓고 비드가 다섯 분 동안 결합되도록 합니다. 36.5 마이크로리터의 상청액을 신선한 열순환기 호환 96웰 플레이트로 옮기고 비드를 버립니다.

세포 품질 평가를 수행 한 후, 세포 외관과 백분율을 조사하여 품질이 낮은 배아 줄기 세포를 사용해서는 안된다는 것을 보여주었습니다. 단일 세포 분류는 Hoechst 33342 염색을 사용하여 수행되었으며, 시험 세포를 계수하여 각 웰에서 제로 또는 하나의 세포가 발견됨을 확신시켰다. 아가로스 겔 분석은 저분자량 사다리와 개별 단일 세포 uliCUT&RUN 라이브러리를 밝혀냈다.

차선의 최적 라이브러리 분석은 저분자량 사다리, 비효율적인 Mnase 소화로 인한 차선의 라이브러리 및 적절한 소화를 통한 성공적인 라이브러리를 보여줍니다. 단편 분석기 분포는 단일 세포의 예상 크기가 150 내지 500 염기쌍 범위임을 보여준다. 그러나 큰 단백질에서 DNA는 약 270 염기 쌍을 가질 것입니다.

높은 세포 수 또는 음성 대조군을 묘사하는 단일 유전자좌 게놈 브라우저를 사용한 단백질 점유 및 단일 세포 CTCF uliCUT&RUN은 단일 세포가 주로 높은 세포 uliCUT&RUN과 유사한 강한 피크를 나타냄을 밝혀냈다. 단일 세포 CTCF 또는 음성 대조군의 열 지도는 세포 내에 확립된 CTCF 결합 부위에 직접 판독 농축의 명확한 패턴을 밝혀냈다. 일차원 열 지도는 주변 영역 및 무항체 대조군에 비해 단일 세포 라이브러리에서 확립된 CTCF 결합 부위에 비해 더 높은 판독 밀도를 보여주며, 확립된 결합 부위에서 항체 특이적 농축을 입증한다.

빙수 욕조 상에서 비드 결합된 핵을 평형화시키고 염화칼슘 첨가시 샘플을 과열시키지 않는 것은 크로마틴의 과소화를 방지하는 데 중요하다.