Name: 인간 조혈 줄기 및 전구 세포에서 발암성 이형접합체 기능 획득 돌연변이 공학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T14:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 학습하세요 인간 조혈 줄기 및 전구 세포에서 CRISPR/Cas9과 rAAV를 이용한 발암성 이형접합체 기능 획득 돌연변이 공학 방법을. 형광 리포터를 활용한 순수 이형접합체 세포 집단의 식별 및 추적이 가능합니다.

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이 연구는 오스트리아 과학 기금 (FWF, 번호 P32783 및 I5021)의 AR에 대한 보조금으로 지원됩니다. A.R.에 대한 추가 자금은 오스트리아 내과 학회 (Joseph Skoda Fellowship), 오스트리아 혈액 종양 학회 (OeGHO; 임상 연구 보조금) 및 MEFOgraz. T.K.는 백혈병 및 림프종 학회의 특별 펠로우입니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

인간 1차 HSPC의 효율적이고 정확한 유전자 조작은 정상적인 조혈, 그리고 가장 중요한 것은 조혈 세포의 백혈병 변형에 영향을 미치는 과정을 탐구하고 이해할 수 있는 좋은 기회를 나타냅니다.
이 프로토콜에서, 재발성 이형접합체 GOF 돌연변이를 발현하도록 인간 HSPC를 조작하는 효율적인 전략이 설명되었다. 이 절차는 CRISPR/Cas9 기술과 rAAV6 벡터를 DNA 주형의 기증자로 활용하여 WT 및 돌연변이 DNA 서열을 내인성 유전자 좌위에 정확하게 삽입했습니다. 조작된 cDNA(WT 및 돌연변이)를 분리된 형광 리포터 단백질과 결합하면 최종 이형접합체 상태의 세포를 농축하고 추적할 수 있습니다.
이 전략은 자주 사용되는 렌티바이러스(LV) 기반 방법에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 한 가지 주요 이점은 CRISPR/Cas9 기반 시스템이 내인성 유전자좌에서 정밀한 편집을 허용하여 내인성 프로모터 및 조절 요소를 보존할 수 있다는 것입니다. 이것은 세포에서 편집 된 유전자의 발현에서 균질성을 유도하며, LV 기반 방법을 사용할 때 거의 달성 할 수없는 목표입니다. LV 벡터를 사용한 유전자 전달은 전사 활성 부위34에 대한 선호도와 유전자의 반무작위 통합을 유도한다. 이것은 전달 된 유전자의 과발현과 편집 된 세포 간의 이질성으로 해석되어 결국 돌연변이 및 유전자 상호 작용의 역할을 조사하고 분석하는 데 어려움을 초래할 수 있습니다. 두 번째 이점은 설명된 시스템이 부위 특정 편집 시스템이기 때문에 삽입 돌연변이유발(35)의 위험을 제거한다는 것이다.
이중 형광 리포터 전략은 두 대립 유전자에서 성공적으로 편집 된 세포의 정확한 농축 및 추적을 허용하며, 하나의 대립 유전자는 WT cDNA를 통합하고 다른 대립 유전자는 돌연변이 된 cDNA 서열을 통합합니다. 단일 리포터만을 발현하는 세포는 단일 대립유전자 통합 또는 동일한 형광 리포터와의 HDR 템플릿의 이중대립유전자 통합을 나타냅니다. 두 시나리오 모두 단일 세포 유래 클론을 생산하고 개별적으로 분석하는 경우에만 정확하게 구별할 수 있습니다. 그러나 HSPC는 시험관 내에서 증식 능력이 제한적이며, 장기간 배양 상태를 유지하면 HSPC는보다 성숙한 자손으로 분화하기 시작하고자가 재생 및 생착 능력을 잃습니다. 이것은 원하는 이형 접합 돌연변이를 보유하고있는 단일 세포 클론을 선택하고 확장하는 것을 불가능하게 만든다. 이형접합체 돌연변이를 지닌 세포에 대한 이중 형광 단백질 전략 및 유세포분석에 의한 농축의 적용은 연장된 시험관 내 배양에 의해 유도된 문제를 우회할 수 있게 한다.
이 특정 예에서, 이형 접합 CALRDEL / WT 돌연변이를 운반하는 HSPC의 순수한 집단을 얻기 위해 HSPC가 효율적으로 조작되고 분류 될 수 있음을 성공적으로 입증했습니다.
그러나 이 시스템은 공학적 이형접합체 프레임시프트 돌연변이에 국한되지 않고 미센스 및 넌센스 돌연변이를 포함한 다른 돌연변이 유형을 생성하기 위해 쉽게 채택될 수도 있습니다. WT를 함유하는 AAV의 상이한 조합 또는 상이한 형광 리포터 단백질을 갖는 돌연변이된 서열을 적용함으로써, 이 시스템은 또한 동형접합 돌연변이(돌연변이 cDNA를 운반하지만 상이한 형광 리포터를 운반하는 2개의 rAAV를 사용한 동시 형질도입) 또는 심지어 돌연변이의 교정(WT cDNA를 운반하지만 상이한 형광 리포터를 갖는 2개의 AAV를 사용한 동시 형질도입)의 도입에도 활용될 수 있다. 또한이 전략이 발암 성 GOF 돌연변이의 도입에만 국한되지 않는다는 점을 언급하는 것이 중요합니다. 실제로, 기술된 프로토콜은 유전자 녹아웃, 유전자 대체(36,37), 전이유전자(즉, 키메라 항원 수용체)의 표적화된 녹인(knock-in)38), 심지어 질병을 유발하는 돌연변이(11,39)의 교정을 포함하는 다수의 대안적 전략에 활용될 수 있다.
CRISPR/Cas9 및 AAV6를 다중 형광 리포터와 결합하는 전략은 T 세포, 형질모세포양 수지상 세포, 유도만능줄기세포, 신경 줄기세포 및 기도 줄기 세포를 포함한 다른 많은 세포 유형에도 적용 가능한 것으로 나타났습니다. 24,38,40,41,42,43,44 . 이 전략은 우수한 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포의 생산을 위해 구현될 수 있다. 예를 들어, CAR T 세포에서 TGFBR2 유전자의 CRISPR/Cas9-매개 녹아웃이 억제성 TGF-β 풍부한 종양 미세환경에서 이들의 기능을 크게 증가시킨다는 것이 최근에 발표되었다45. 이러한 접근법은 CAR을 발현하도록 T 세포를 조작하고 TGFBR2 유전자의 두 대립 유전자 모두에 CAR을 특이적으로 삽입함으로써 TGFBR2 유전자를 녹아웃하는 원스텝 프로토콜을 제공할 수 있다. 더욱이, 이러한 접근법은 또한 T 세포 수용체 알파 상수 (TRAC) 유전자46,47에 CAR을 통합함으로써 보편적인 CAR T 세포를 생성하는데 유용할 수 있다.
재현성을 높이고 세포의 효율적인 편집을 보장하려면 몇 가지 중요한 고려 사항을 처리해야 합니다. 세포의 성공적인 편집을 보장하기 위한 주요 중요 포인트는 (i) sgRNA의 선택, (ii) HDR 템플릿의 설계 및 (iii) rAAV6 생산에 있습니다.
우수한 성능의 sgRNA를 선택하는 것은 HDR 템플릿이 통합될 수 있는 최대 대립 유전자 수를 결정하기 때문에 중요합니다. 현재 사용할 수 있는 수많은 소프트웨어로 인해 후보 sgRNA에 대한 검색이 단순화되었습니다. 관심 영역을 선택함으로써, 소프트웨어는 각각 원하는 유전자좌 및 원치 않는 유전자좌에서 편집할 기회를 나타내는 온-타겟 스코어 및 오프-타겟 스코어를 갖는 일련의 sgRNA를 제안할 수 있다. 이러한 점수는 이전에 공개된 점수 모델(48,49)에 기초하여 계산된다. 이것이 우수한 성능의 sgRNA를 선택하기 위한 좋은 출발점이지만, 실리코에서 예측된 성능이 시험관 내에서 효율적인 sgRNA와 항상 일치하는 것은 아니기 때문에 sgRNA의 성능을 확인해야 합니다. 따라서 최상의 sgRNA를 찾을 가능성을 높이기 위해 최소 3개의 sgRNA를 설계하고 테스트하는 것이 좋습니다. 실제로 우수한 성능의 sgRNA가 확인되면 HDR 템플릿의 설계를 진행하는 것이 좋습니다.
HDR 템플릿을 디자인할 때 예방 조치를 고려해야 합니다. 왼쪽 및 오른쪽 상동성 암(각각 LHA 및 RHA)은 각각 sgRNA 절단 부위의 업스트림 및 다운스트림에 걸쳐 있어야 하며, HA가 짧을수록 HDR 주파수가 감소할 수 있습니다. HDR을 통해 도입할 수 있는 cDNA의 크기는 AAV의 패키징 기능에 따라 달라지며, 이는 약 4.7kb입니다. HDR 템플릿 내에 필수적인 수많은 요소 (LHA, RHA, SA, PolyA, 프로모터 및 형광 리포터 서열)로 인해, 돌연변이 또는 WT cDNA를 위한 나머지 공간은 제한적이다. 이것은 원하는 돌연변이가 유전자의 3' 말단 근처 또는 전체적으로 짧은 CDS를 갖는 유전자에 위치하는 경우에는 문제가 되지 않는다. 그러나, 돌연변이가 긴 CDS (AAV의 나머지 패킹 공간 초과)를 갖는 유전자의 전사 개시 측 (TSS) 근처에있는 경우,이 설명 된 접근법은 실현 가능하지 않을 수있다. 이 문제를 피하기 위해 HDR 템플릿을 두 개의 AAV로 분할하는 전략이 최근 Bak과 동료들에 의해 개발되었습니다. 이 전략은 큰 유전자(50)의 최종 원활한 통합을 얻기 위해 2개의 개별 HDR-매개 통합에 의존한다.
바이러스의 품질과 역가는 세포의 성공적인 게놈 공학을 만들거나 깨뜨릴 수 있는 추가 요소입니다. 최적의 수율을 위해서는 HEK293T가 배양 상태를 유지하면서 완전한 컨플루언스에 도달하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이상적으로는 HEK293T 세포가 70%-80% 컨플루언시에 도달할 때 분할되어야 합니다. 또한 HEK293T는 바이러스 생성 능력을 감소시킬 수 있으므로 장기간 배양해서는 안 됩니다. 새로운 HEK293T 세포는 20 회 계대 후에 해동해야합니다. 높은 바이러스 역가를 얻는 것은 실험의 효율성과 재현성을 높이는 데 중요합니다. 낮은 바이러스 역가는 HSPC의 형질도입에 필요한 대량의 rAAV 용액으로 해석됩니다. 일반적으로, 핵 제거된 세포에 첨가된 rAAV 용액은 HSPC 머무름 배지의 총 부피의 20%를 초과해서는 안 된다. 더 많은 양의 AAV 용액은 세포 사멸 증가, 증식 감소 및 형질 도입 효율 장애로 이어질 수 있습니다. 따라서 바이러스 역가가 낮은 경우 바이러스를 더욱 집중시키는 것이 좋습니다.
요약하면, 이 프로토콜은 추가 이중 형광 리포터와 함께 CRIPSR/Cas9 및 rAAV6 공여체 템플릿을 동시에 사용하여 인간 HSPC를 정확하고 효율적으로 조작할 수 있는 재현 가능한 접근 방식을 제공합니다. 이 접근법은 정상적인 조혈 줄기 세포 생물학과 돌연변이가 백혈구 생성에 기여하는 것을 연구하는 데 훌륭한 도구임이 입증되었습니다.

클러스터형 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복(CRISPR)/Cas9 기술의 개발로 새롭고 매우 강력한 기기가 과학자 툴킷에 추가되었습니다. 이 기술은 게놈의 정밀한 엔지니어링을 가능하게 하며 연구 목적(Hsu et al.1에서 검토됨)뿐만 아니라 최근에는 임상 환경 2,3,4로 성공적으로 번역된 것으로 입증되었습니다. CRISPR/Cas9 편집 전략은 Cas9 단백질과 단일 가이드 RNA(sgRNA)5,6,7의 활성에 의존합니다. 숙주 세포에서 Cas9 단백질은 sgRNA 서열과 상보적인 DNA의 특정 부위로 안내되고 DNA 이중 가닥 절단(DSB)을 도입합니다. DSB가 생성되면 발생할 수 있는 두 가지 주요 및 경쟁 복구 메커니즘, 즉 비상동 말단 접합(NHEJ)과 상동성 지향 복구(HDR)가 있습니다. NHEJ는 오류가 발생하기 쉽고 주로 사용되는 복구 메커니즘으로 삽입 및 삭제 (indels)로 이어지는 반면, HDR은 자매 염색 분체를 복구 템플릿으로 사용하여 매우 정확하지만 세포주기8의 S 또는 G2 단계로 제한됩니다. 게놈 엔지니어링에서 HDR은 Cas9 유도 DSB의 양쪽 DNA 말단과 동일한 상동성 팔에 의해 측면에 있는 기증자 주형을 제공함으로써 DNA의 표적 변형에 활용될 수 있습니다(그림 1). HDR에 사용되는 기부자 템플릿 유형은 편집 효율성에 큰 영향을 줄 수 있습니다. 인간 HSPC의 유전 공학을 위해, 아데노-관련 바이러스 혈청형 6 (AAV6)은 최근 단일-가닥DNA 주형의 전달을 위한 우수한 매개체로 기술되었다 9,10.
CRISPR/Cas9 게놈 공학은 유해한 돌연변이(11)를 교정하기 위해 치료적으로 사용될 수 있지만, 암 발생을 모델링하기 위해 DNA에 병원성 돌연변이를 도입하는 데에도 활용될 수 있다(12). 백혈병과 같은 혈액 암은 건강한 HSPC에서 체세포 돌연변이의 순차적 획득을 통해 발생합니다13,14. 초기 유전적 사건은 클론 증식 이점으로 이어져 불확정 전위(CHIP)의 클론 조혈을 초래합니다.15,16. 돌연변이의 추가 획득은 결국 백혈병 변형과 질병의 발병으로 이어질 것입니다. 체세포 돌연변이는 자가 재생, 생존, 증식 및 분화를 제어하는 유전자에서 찾을 수 있습니다17.
게놈 엔지니어링을 통해 개별 돌연변이를 건강한 HSPC에 도입하면 이 단계적 백혈구 발생 과정을 정확하게 모델링할 수 있습니다. 급성 골수성 백혈병(AML)18,19과 같은 골수성 신생물에서 발견되는 제한된 수의 재발성 돌연변이로 인해 이 질병은 특히 게놈 엔지니어링 도구를 사용하여 요약하기 쉽습니다.
체세포 돌연변이는 하나의 대립 유전자 (단일 대립 유전자 / 이형 접합 돌연변이) 또는 두 대립 유전자 (이중 대립 유전자 / 동형 접합 돌연변이)에서만 나타날 수 있으며 유전자의 기능에 중대한 영향을 미칠 수 있으며, 이는 기능 상실 (LOF) 또는 기능 획득 (GOF)을 유발할 수 있습니다. LOF 돌연변이는 유전자의 LOF를 감소(하나의 대립유전자가 영향을 받는 경우) 또는 완전(두 대립유전자가 모두 영향을 받는 경우)으로 이어지는 반면, GOF 돌연변이는 유전자의 활성화 또는 새로운 기능을 증가시킵니다. GOF 돌연변이는 전형적으로 이형접합체20이다.
중요하게도, 접합성 (이종 접합체 대 동형 접합체)은 돌연변이를 충실하게 모델링하려는 시도에 중요한 영향을 미칩니다. 따라서, 이형접합체 핫스팟 GOF 돌연변이를 조작하기 위해서는 유전자의 단 하나의 대립유전자만을 표적화하는 조작이 필요하다. 오류가 발생하기 쉬운 NHEJ는 다양하고 예측할 수없는 생물학적 결과를 초래할 수있는 다양한 길이21의 indels로 이어집니다. 그러나 NHEJ는 DSB 도입 후 세포에 의해 사용되는 주된 복구 프로그램이기 때문에 현재 HSPC를 조작하는 데 사용되는 대부분의 CRISPR / Cas9 플랫폼은 유전 적 결과를 정확하게 예측할 수 없습니다22,23. 대조적으로, HDR을 통한 게놈 엔지니어링을 위한 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터 기반 DNA 공여체 템플릿의 사용과 결합된 CRISPR/Cas9-매개 이중 가닥 절단(DSB)의 도입은 인간 HSPC에서 돌연변이의 대립유전자 특이적 삽입을 허용합니다(11,24). 개별 대립유전자에 대한 별개의 형광 리포터와 결합된 돌연변이 및 야생형(WT) 서열의 동시 통합을 수행하여 이형접합체 유전자형을 선택할 수 있습니다(그림 2). 이 전략은 재발성, 백혈병, 이형접합체 GOF 핫스팟 돌연변이가 HSPC 기능, 질병 시작 및 진행에 미치는 영향을 정확하게 특성화하는 강력한 도구로 활용할 수 있습니다.
이 기사에서는 1 차 인간 HSPC에서 반복적으로 돌연변이 된 이형 접합체 GOF 돌연변이의 효율적인 엔지니어링을위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다. 이 전략은 CRISPR/Cas9와 이중 AAV6 형질도입의 사용을 결합하여 이형접합체 GOF 돌연변이의 전향적 생성을 위한 WT 및 돌연변이 DNA 기증자 템플릿을 제공합니다. 예로서, 칼레티큘린(CALR) 유전자에서 재발성 제1형 돌연변이(52 bp 결실)의 공학은도 25를 나타낼 것이다. CALR의 엑손 9에서 이형 접합체 GOF 돌연변이는 본 태성 혈소판 증가증 (ET) 및 원발성 골수 섬유증 (PMF)26과 같은 골수 증식 성 장애에서 반복적으로 발견됩니다. CALR은 새로 합성 된 단백질의 접힘 과정에서 주로 품질 관리 기능을 갖는 소포체 상주 단백질입니다. 그 구조는 단백질의 샤페론 기능에 관여하는 아미노 (N) 말단 도메인과 프롤린이 풍부한 P 도메인, 칼슘 저장 및 조절27,28에 관여하는 C- 도메인의 세 가지 주요 도메인으로 나눌 수 있습니다. CALR 돌연변이는 +1 프레임 시프트를 일으켜 새로운 확장 된 C- 말단 말단의 전사와 소포체 (ER)- 머무름 신호 (KDEL)의 손실로 이어집니다. 돌연변이 CALR은 트롬보포이에틴 (TPO) 수용체에 결합하여 증식 증가와 함께 TPO 비의존적 신호전달을 유도하는 것으로 나타났습니다29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig01v2.jpg"> 그림 1: NHEJ 및 HDR 복구. DNA에 이중 가닥 절단이 도입된 후 NHEJ 및 HDR 복구 메커니즘의 단순화된 개략적 표현. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig01largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig02.jpg"> 그림 2: 이대립유전자 HDR 편집 전략의 개략도. 기증자 주형을 표적 대립 유전자에 통합 한 후 기능하는 mRNA로 번역하는 것을 보여주는 개략적 표현. 주황색 점선 상자는 왼쪽 상동 팔 (LHA) 및 오른쪽 상 동성 팔 (RHA)에 해당하는 영역을 나타냅니다. HA의 이상적인 크기는 각각 400bp입니다. 녹색 점선 상자는 SA 시퀀스에 해당하는 영역을 나타냅니다. SA의 크기는 150bp입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>175 cm2 세포 배양 플라스크, 벤트 캡, TC 처리</td><td>Corning</td><td>431080</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 25 mm 접시</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>293T</td><td>DSMZ</td><td>ACC 635</td><td>https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635</td></tr><tr><td>4D Nucleofector Core Unit</td><td>Lonza</td><td>-</td><td>인간 HSPC의 핵 발굴을 위해 DZ-100 프로그램을 사용하십시오.</td></tr><tr><td>4D 뉴클레오펙터 X 유닛</td><td>Lonza-500</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ml 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>431123</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>AAVpro 정제 키트</td><td>Takara</td><td>6666</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>Avanti JXN-30 Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter-Benchling</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>sgRNA 설계 도구</td><td></td><td></td><td>sgRNA 설계를 위한 온라인 도구:</td></tr><tr><td>http://www.benchling.com/crispr 소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>C1000 터치 열 순환기</td><td>Bio-Rad-Chemically</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>modified synthetic sgRNA</td><td>Synthego</td><td></td><td>웹사이트: CALR의 인트론 7을 표적으로 하는 sgRNA에 대한 https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna 염기서열: 5'-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3' &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 80 nucleotide SpCas9 scaffold를 20 nucleotide RNA sequence에 추가하여 sgRNA를 완성합니다. 2'-O-Methyl의 화학적 변형은 첫 번째와 마지막 3개의 염기에 추가되고, 3' 포스포로티오에이트 결합은 처음 3개와 마지막 2개의 염기에 추가됩니다. &nbsp; &nbsp; &nbsp; *IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) 및 Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos)</td> CHOPCHOP sgRNA 설계 도구에서 화학적으로 변형된 합성 sgRNA를 얻을 수</tr> 있습니다. <tr><td></td><td>sgRNA 설계를 위한 온라인 도구: http://chopchop.cbu.uib.no</td>Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3526 CRISPick sgRNA 설계 도구 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>sgRNA 설계를 위한 온라인 도구: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public</td></tr><tr><td>CRISPOR sgRNA 설계 도구</td><td></td><td></td><td>sgRNA 설계를 위한 온라인 도구: http://crispor.tefor.net</td></tr><tr><td>ddPCR 96-웰 플레이트</td><td>프로브용 Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix(dUTP 없음)</td><td></td>QX200/QX100 액적 발생기용 <td>Bio-Rad</td> 1863024 <td></td></tr><tr><td>DG8 카트리지&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 가스켓 QX200/QX100 드롭릿 생성기&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>프로브용 액적 생성 오일</td><td>Bio-Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 고혈당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-6X500ML</td><td></td>Dulbecco를 함유한 DMEM(Modified Eagle Medium</tr><tr><td>) s 인산염 완충 식염수 (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Fusion</td><td>BD Biosciences-Falcon</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>5 mL 라운드 바텀</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS) Good Forte (열 비활성화), 500 ml</td><td>Pan Biotech</td><td>P40-47500</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.8.0</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>GenAgarose L.E.</td><td>Inno-train</td><td>GX04090</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0321</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs Inc. (NEB)</td><td>E2611L</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ICE</td><td>Synthego</td><td></td><td>https://ice.synthego.com</td></tr><tr><td>IDT 코돈 최적화 도구</td><td>IDT</td><td></td><td>https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool</td></tr><tr><td>IDT sgRNA 설계 도구</td><td></td><td></td><td>sgRNA 설계를 위한 온라인 도구: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM</td></tr><tr><td>LB 육수(Lennox) EZMix 분말 미생물 성장 배지</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7658-1KG</td><td></td></tr><tr><td>LB 한천이 있는 육수(Lennox) EZMix 분말 미생물 성장 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7533-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Midori Green Advance</td><td>Nippon Genetics</td><td>MG04</td><td></td></tr><tr><td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td><td>NEB</td><td>T1010L</td><td></td></tr><tr><td>Monarch DNA Gel 추출 키트</td><td>NEB</td><td>T1020L</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Competent E. coli (고효율)</td><td>NEB</td><td>C2987U</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water, 5X100 ml</td><td>Ambion</td><td>AM9939</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, 감소된 세럼 매체, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofetor&nbsp; X Kit L</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td>Lonza Primary P3 솔루션은 2.25mL P3 Primary Cell Nucleofector 용액 및 0.5mL Supplement 1로 공급됩니다. 재구성하려면 Supplement 1을 P3 Primary Cell Nucleofector Solution에 첨가하고 혼합합니다.</td></tr><tr><td>pAAV-MCS2</td><td>Addgene</td><td>46954</td><td></td></tr><tr><td>PCR 플레이트 열 밀봉 호일, 피어싱 가능한</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>pDGM6</td><td>Addgene</td><td>110660</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(P/S)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌민(PEI)</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td>튜브에 PBS 4.5 pH(HCl로 제조) 50mL를 PEI 50mg에 추가합니다. 튜브를 70°C에 넣어 용해합니다. C 수조를 하고 용액이 용해될 때까지 10분마다 와류를 일으킵니다. 용액이 RT에 도달 한 후 필터는 0.22 &mu를 통해 멸균됩니다. M 필터, 1120 만들기 &mu; L 분취량, -80°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>폴리스티렌 시험관, 스냅 캡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>프라이머 포함&nbsp;</td><td>Eurofins-Primer</td><td></td><td>는 Eurofins(eurofinsgenomics.eu)에서 변형되지 않은 무염 맞춤형 올리고로 주문되었습니다. 프라이머는 PRIMER-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 사용하여 설계되었습니다. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 프라이머 1 Fwd:&nbsp; &nbsp; &nbsp; AAGTGATCCGTTCGCCATGAC; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Primer 2 Rev CALR WT 특이: ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Primer 2 Rev CALR DEL 특이적: CCAACCCTGGAGACACGCTTC</td></tr><tr><td>PrimeTime qPCR 프라이머 어세이</td><td>IDT-PrimeTime</td><td></td> <td>qPCR 프로브 어세이(프로브 1개/프라이머 2개)&nbsp;는 IDT(https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry)에서 주문할 수 있습니다. 규모: Std - qPCR 분석 500 반응; 프라이머 1 포워드 (5'-3') : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; 뇌관 2 반전 (5'-3'): CGGCCTCAGTGAGCGA; 프로브 (5'-3') : CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG; 5' 염료/3' 담금질제: FAM/ZEN/IBFQ; 프라이머 대 프로브 비율: 3.6</td></tr><tr><td>PX1 PCR 플레이트 씰러</td><td>Bio-Rad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>QuantaSoft 소프트웨어</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>빠른 추출 DNA 추출 솔루션</td><td>Lucigen</td><td>QE0905T</td><td></td></tr><tr><td>QX200 드롭릿 생성기&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1864002</td><td></td></tr><tr><td>QX200 액적 판독기</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 Flt3-리간드</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>Dotmatics</td><td></td><td>분자 클로닝 소프트웨어 https://www.snapgene.com *대안적으로 Benchling(https://www.benchling.com) 및 Geneious(https://www.geneious.com)도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Soc outgrowth medium</td><td>NEB</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>나트륨-부티레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887-1G</td><td></td></tr><tr><td>줄기 Regenin 1 (SR1)</td><td>Biogems</td><td>1224999</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM II</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9655</td><td></td></tr><tr><td>TAE 버퍼 (Tris-acetate-EDTA) 50X</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>TIDE</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ 트리판 블루 0.4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE(페놀 레드 포함), 500ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>16605-028</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5: EDTA, pH 8.0, 100ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>UM171</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72914</td><td></td></tr><tr><td>Vector Builder 코돈 최적화 툴</td><td>Vector Builder</td><td></td><td>https://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html</td></tr></tbody></table>

인간 조혈 줄기 및 전구 세포에서 발암성 이형접합체 기능 획득 돌연변이 공학

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

평생 동안 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)는 체세포 돌연변이를 획득합니다. 이러한 돌연변이 중 일부는 증식 및 분화와 같은 HSPC 기능적 특성을 변경하여 혈액 악성 종양의 발병을 촉진합니다. 재발하는 체세포 돌연변이의 기능적 결과를 모델링, 특성화 및 더 잘 이해하려면 HSPC의 효율적이고 정확한 유전자 조작이 필요합니다. 돌연변이는 유전자에 해로운 영향을 미치고 기능 상실 (LOF)을 초래할 수 있으며, 대조적으로 기능을 향상 시키거나 기능 획득 (GOF)이라고하는 특정 유전자의 새로운 특성으로 이어질 수도 있습니다. LOF 돌연변이와 달리 GOF 돌연변이는 거의 독점적으로 이형 접합 방식으로 발생합니다. 현재의 게놈 편집 프로토콜은 개별 대립 유전자의 선택적 표적화를 허용하지 않아 이형 접합 GOF 돌연변이를 모델링하는 능력을 방해합니다. 여기에서는 효율적인 DNA 공여체 주형 전달을 위해 CRISPR/Cas9 매개 상동성 지향 복구 및 재조합 AAV6 기술을 결합하여 인간 HSPC에서 이형접합체 GOF 핫스팟 돌연변이를 엔지니어링하는 방법에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 중요하게도, 이 전략은 이중 형광 리포터 시스템을 사용하여 성공적으로 이형접합체로 편집된 HSPC의 추적 및 정제를 허용합니다. 이 전략은 GOF 돌연변이가 HSPC 기능과 혈액 악성 종양으로의 진행에 어떻게 영향을 미치는지 정확하게 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

상술한 프로토콜을 적용함으로써, 이형접합체 제1형 CALR 돌연변이가 제대혈 유래 HSPC에 재현가능하게 도입되었다. 이 돌연변이는 엑손 9 (CALR의 마지막 엑손)에서 52bp 결실로 구성되며, 이는 +1 프레임 시프트를 초래하여 새로운 양전하를 띤 C- 말단 도메인26,33의 번역으로 이어집니다. 내인성 유전자 좌위에서 CALR 돌연변이를 도입하기 위해 Exon 9의 업스트림 인트로닉 표적화 전략이 채택되었는데, 이는 Cas9 유도 DSB가 HDR 메커니즘을 통해 복구되지 않은 경우 코딩 서열의 원치 않는 변경을 피할 수 있기 때문입니다. 이러한 특정한 경우에, 인트론 7에 대한 sgRNA는 유리한 상동성 아암과 조합된 높은 온-타겟 및 낮은 오프-타겟 서열의 이용 가능성으로 인해 설계되었다 (서열 반복의 결여; 그림 5A).
그런 다음 두 개의 기증자 템플릿을 AAV6 벡터로 설계 및 패키징했습니다. 내인성 엑손으로부터 통합된 cDNA로의 정확한 스플라이싱을 가능하게 하기 위해, 공여자 주형은 (i) 3' 스플라이스-부위, 분기점 및 폴리피리미딘 관을 포함하는 SA 서열, (ii) WT(CALRWT) 또는 돌연변이된 서열(CALRDEL ) 정지 코돈을 포함하는, (iii) 유인원 바이러스 40 (SV40) polyA 신호, (iv) 별개의 내부 프로모터의 조절하에 형광 단백질을 암호화하는 서열, 비장 포커스형성 바이러스 (SFFV) 프로모터, 이어서 (v) 소 성장 호르몬 (bGH) polyA 신호. CALR WT cDNA를 함유하는 공여체 템플릿은 GFP 카세트를 함유하도록 설계된 반면, CALRDEL cDNA 서열을 함유하는 공여체 템플릿은 BFP 카세트를 함유하도록 설계되었다. 전체 구축물은 좌우 HA에 의해 측면에 있었다(도 5A).
RNP 복합체를 사용한 형질감염 및 rAAV6 바이러스로의 형질도입 이틀 후, 세포를 유동 세포분석에 의해 분석하였다. 4개의 주요 집단이 검출될 수 있었다: (i) HDR 기반 게놈 편집이 없는 세포를 나타내는 GFP 또는 BFP를 발현하지 않는 세포, (ii) WT 구축물만을 통합한 세포를 나타내는 GFP에 대해서만 양성인 세포, (iii) 돌연변이된 구축물만을 통합한 세포를 나타내는 BFP에 대해서만 양성인 세포, 및 (iv) GFP 및 BFP 이중 양성 세포, 는 WT 및 돌연변이된 서열 모두를 통합한 세포를 나타낸다(도 5B). 이형접합체 유형 1 CALR 돌연변이를 갖는 HSPC의 순수한 집단을 얻기 위해, 이중 양성 세포를 유동 세포분석에 의해 분류하였다. 2개의 WT 서열이 녹인된 HSPC를 대조군 세포(GFP+ mCherry+; 그림 5B). 대조군 세포로서 사용하기 위한 유효한 대안은 세이프 하버 유전자좌에서 형광 단백질의 이중대립유전자 통합을 갖는 HSPC일 것이다(즉, AAVS1; 도시되지 않음). 분류된 HSPC에 대해 수행된 트리판 블루 배제에 의한 세포 계수는 세포의 90% 이상이 생존 가능하다는 것을 나타내었다.
구축물의 원활한 온-타겟 통합은 인-아웃 PCR 전략을 적용하여 확인하였다(도 6A). 이 특정 경우에, 우리는 녹 인 CALR WT 서열 (도 6A에서 겔 전기 영동의 레인 1)과 녹 인 CALRDEL 서열 (도 6A의 겔 전기 영동의 레인 2)에 대한 두 개의 분리 된 인-아웃 PCR을 수행했다. 겔 밴드에서 추출한 DNA에 대해 수행된 Sanger 시퀀싱은 CALRDEL/WT HSPC에서 WT 및 돌연변이 서열의 올바른 삽입을 확인했습니다(그림 6B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig05.jpg"> 그림 5: 이형접합 CALR 돌연변이를 갖는 HSPC의 생성. (A) 이형접합 CALR 돌연변이의 삽입을 위한 편집 전략을 묘사하는 대표적인 도식. RNP 복합체는 CALR 유전자의 엑손 7과 엑손 8 사이의 인트론을 표적으로 합니다. 돌연변이된 엑손 8-9 및 BFP를 포함하는 AAV와 WT 엑손 8-9 및 GFP를 포함하는 두 개의 AAV는 공여체 복구 주형으로 작용하며 하나의 대립유전자에서 돌연변이된 서열의 통합과 나머지 대립유전자에 WT 서열의 통합을 촉진합니다. (B) HSPC의 형질감염 및 형질도입 후 GFP 및 BFP 또는 GFP 및 mCherry 48h의 발현을 나타내는 대표적인 유세포분석 플롯. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig06.jpg"> 그림 6: HSPC에서 성공적인 이형접합체 CALR 돌연변이의 검증. (A) AAV 대조군, CALR WT/WT 및 CALRDEL/WT에서 추출한 게놈 DNA에 대해 수행된 인-아웃 PCR 산물의 겔 전기영동. 100 bp DNA 사다리를 사용하였다. 약어 : NTC = 비 템플릿 제어. (B) WT 및 돌연변이 서열의 성공적인 통합을 확인하는 CARRDEL/WT에서 수행된 인아웃 PCR로부터 얻은 Sanger 시퀀싱 결과. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 체세포 돌연변이를 충실하게 모델링하는 새로운 전략은 조혈 줄기 세포 생물학 및 혈액 악성 종양을 더 잘 연구하는 데 필요합니다. 여기에서는 CRISPR/Cas9의 사용과 이중 rAAV 공여체 형질도입을 결합하여 HSPC에서 이형접합체 기능 획득 돌연변이를 모델링하는 프로토콜이 설명됩니다.

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...

이 방법을 사용하면 1차 인간 조혈 줄기 및 전구 세포에서 재발성 백혈구 기능 획득 돌연변이를 정밀하게 모델링하여 백혈병 변형에서의 역할을 조사할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 CRISPR-Cas9 기반 돌연변이 공학이 형광 리포터의 도입과 결합된다는 것입니다. 이를 통해 순수 이형접합체 돌연변이 세포 집단의 식별, 농축 및 추적을 고유하게 수행할 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사후 연구원 인 Tommaso Sconocchia입니다. 시작하려면 더하기 만들기 옵션을 선택하여 온라인 벤치링 설계 도구를 사용하여 단일 가이드 RNA를 설계합니다. 그런 다음 DNA 서열"다음 DNA 서열 가져 오기"및 데이터베이스에서 가져 오기"옵션을 클릭하십시오.그런 다음 원하는 유전자를 입력하고 인간"을 종으로 선택하십시오. 검색"옵션을 클릭하고 올바른 성적 증명서 가져 오기를 선택하십시오. 이중 스트랜드 브레이크를 도입할 관심 영역을 선택합니다.그런 다음 화면 오른쪽에서 CRISPR" 옵션을 선택한 다음 설계 및 분석 가이드를 선택합니다. 다음으로 SP-Cas9로 편집하기 위해 가이드 길이를 20 염기쌍과 PAM 시퀀스로 유지하면서 단일 가이드를 선택하십시오. 높은 온 타겟 점수와 높은 오프 타겟 점수를 가진 가이드를 선택하고 단일 가이드 RNA를 상용 공급 업체의 화학적으로 변형 된 합성 단일 가이드 RNA로 주문하십시오.HDR 템플릿을 설계하려면 게놈 서열과 코딩 서열을 분자 클로닝을 위해 소프트웨어로 가져옵니다. 게놈 서열 파일로부터, 이상적으로는 이중 가닥 절단의 5개의 프라임 말단에서 400개의 염기쌍을 선택하여 왼쪽 상동성 암을 설계하고 이 서열을 새 파일에 붙여넣는다. 게놈 서열 파일로부터, 표적화된 인트론의 마지막 150개 염기쌍을 선택하고 이를 좌측 상동성 암 뒤에 붙여넣음으로써 스플라이스 수용체 서열을 설계한다.코딩 서열 파일에서, 관심 있는 cDNA를 선택한다. 코돈은 cDNA를 최적화하고 스플라이스 수용체 서열 뒤에 삽입한다. 관심있는 cDNA 후에, 형광 단백질에 대한 프로모터 서열을 따르는 3개의 프라임 폴리아데닐화 신호를 삽입한다.이어서, 형광 단백질과 상이한 폴리아데닐화 신호에 대한 서열을 삽입한다. 게놈 서열 파일로부터, 이중 가닥 절단의 3개의 프라임 말단에 이상적으로 400개의 염기쌍을 선택하여 우측 상동성 암을 설계하고 2차 폴리아데닐화 후에 서열을 삽입한다. 그런 다음 전체 템플릿의 사본을 만들고 원하는 돌연변이의 서열을 포함하도록 관심 있는 cDNA를 수정합니다.형광 단백질을 다른 형광 단백질로 교환한다. HDR 템플릿을 구성하고 AAV 발현 벡터에 클로닝합니다. 재조합 AAV6 준비를 위해 10% FBS, 1% 페니실린 스트렙토마이신 및 25밀리몰 hepes가 보충된 DMEM 20밀리리터에 각각 1,100만 HECK293T가 포함된 10개의 150mm 접시를 준비하십시오.그런 다음 접시를 섭씨 37도, 5%이산화탄소의 인큐베이터에 24시간 동안 두십시오. 오래된 배지를 조심스럽게 버린 후 10 % FBS, 25 밀리몰 hepes 및 1 밀리몰 나트륨 부티레이트가 보충 된 항생제가없는 DMEM 20 밀리리터로 교체하십시오. 다음으로, 튜브 1과 2라고 표시된 두 개의 15 밀리리터 튜브를 준비하십시오.튜브 1에 5밀리리터의 환원된 혈청 배지, 60마이크로그램의 재조합 AAV6 돌연변이 HDR 플라스미드 및 220마이크로그램의 PDGM6 헬퍼 플라스미드를 추가합니다. 튜브 2에 5 밀리리터의 환원 된 혈청 배지와 1120 밀리리터 당 1 밀리그램의 폴리에틸렌 아민 용액을 첨가하십시오. 튜브 2의 내용물을 튜브 1에 첨가한 후 30초 동안 와동시킨 다음 실온에서 15분 동안 배양합니다.조심스럽게 각 접시에 1.1 밀리리터의 용액을 떨어 뜨리고 부드럽게 소용돌이 치며 분배하십시오. 접시를 섭씨 37도, 5%이산화탄소의 인큐베이터에 48시간 동안 두십시오. 그런 다음 각 접시에 250 마이크로 리터의 0.5 몰 EDTA를 넣고 10 분 동안 인큐베이터에 넣으십시오.접시에서 세포를 씻어서 수확하고 500 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 2000G에서 원심분리하고 상층액을 버린다. 소용돌이 현상을 통해 펠릿을 풀고 AAV 정제 키트를 사용하여 바이러스를 추출합니다.정제 된 바이러스를 분취 한 후 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. CD34 양성 조혈 줄기 및 전구 세포를 해동 한 후, 세포를 1 % 페니실린 스트렙토 마이신이 보충 된 예열 된 RPMI 10ml로 옮깁니다. 실온에서 350G에서 10 분 동안 원심 분리합니다.조혈 줄기 및 전구 세포 보유 배지에 세포를 밀리리터 당 250, 000 세포 농도로 현탁시키고 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 72 시간 동안 배양합니다. 다음으로 15 밀리리터 튜브에서 세포를 수확하십시오. 트리판 블루 배제에 의한 세포 생존율을 계수하고 확인한다.리보 쿠클 레오 단백질 복합체를 준비하려면 1.5 밀리리터 튜브에 15 마이크로 그램의 Cas9와 8 마이크로 그램의 단일 가이드 RNA를 넣고 가열 블록에서 섭씨 25도에서 10 분 동안 배양합니다. 리보 핵 단백질 복합체가 배양되는 동안 세포를 350G에서 5 분 동안 원심 분리하고 상청액을 버립니다. 세포를 100 마이크로 리터의 뉴 클레오 펙션 용액에 현탁시킨 후, 세포를 리보 핵 단백질 복합체와 혼합하고 큐벳으로 옮깁니다.큐벳을 부드럽게 두드려 잔류 기포를 제거한 후 큐벳을 형질주입 시스템의 홀더에 삽입하고 세포를 전기천공합니다. 전기 천공 직후, 페니실린 스트렙토 마이신이없는 400 마이크로 리터의 예열 된 조혈 줄기 및 전구 세포 보존 배지를 추가하고 미세 전달 피펫으로 세포를 페니실린 스트렙토 마이신이없는 사전 예열 된 조혈 줄기 및 전구 세포 보유 배지가 들어있는 배양 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 플레이트를 인큐베이터로 옮깁니다.동결된 재조합 AAV를 함유하는 바이알을 얼음 상에서 해동하고, 각각의 재조합 AAV6의 최적량을 세포 현탁액에 피펫팅하여 세포를 형질도입한다. 세포 현탁액을 피펫과 부드럽게 혼합한 후, 형질도입된 세포를 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 6 내지 8시간 동안 배양한다. 6 내지 8시간 후, 세포를 튜브에 모으고 실온에서 350G에서 5분 동안 원심분리한다.상청액을 버리고 페니실린 스트렙토 마이신이 보충 된 새로운 예열 된 조혈 줄기 및 전구 세포 보유 배지로 교체하고 세포를 세포 배양 플레이트로 옮깁니다. 세포를 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 48 시간 동안 배양하십시오. 이형접합체 기능 획득 돌연변이가 있는 조작된 세포를 유동 분류하려면 15밀리리터 튜브에서 세포를 수확하고 앞에서 설명한 대로 실온에서 350G에서 5분 동안 원심분리합니다.상청액을 제거하고 세포를 0.1% PSA를 함유하는 DPBS 1밀리리터에 현탁시키고 실온에서 350G에서 5분 동안 다시 원심분리한다. 상청액을 폐기한 후 이전에 입증된 세포 수에 따라 적절한 부피의 DPBS와 0.1% BSA에 세포를 현탁시킵니다. 세포를 캡이 장착된 멸균 팩스 튜브로 옮기고 살아있는/죽은 세포 배제를 위해 세포 현탁액에 7개의 AAD 또는 기타 생존 염료를 추가합니다.형광 리포터 단백질에 대해 이중 양성인 살아있는 세포를 200마이크로리터의 조혈 줄기 및 전구 세포 보유 배지가 들어 있는 수집 튜브에 분류합니다. 이전에 입증된 바와 같이 분류된 세포를 실온에서 5분 동안 350G에서 원심분리한 후, 배양에서 추가 확장을 위해 밀리리터당 250, 000 세포의 농도로 하거나 세포를 기능 분석을 위해 직접 사용한다. 리보 핵 단백질 복합체를 사용한 형질 도입 및 재조합 AAV6 바이러스로 형질 도입 한 지 이틀 후, 세포를 유세포 분석기에 의해 분석하였다.야생형 구축물만 통합된 GFP에 대해서만 양성인 GFP 또는 BFP 세포를 발현하지 않는 HDR 기반 게놈 편집이 없는 세포, 돌연변이된 구축물만 통합된 BFP에 대해서만 양성인 세포, 야생형 및 돌연변이 서열이 모두 통합된 GFP 및 BFP 이중 양성 세포를 포함하여 4개의 주요 집단이 검출되었습니다. 이형접합체 칼레티쿨린 돌연변이의 성공적인 녹인을 검증하기 위해 AAV만 배양한 세포와 녹인 칼레티쿨린 야생형 및 칼레티쿨린 결실 서열을 가진 리보핵단백질 및 AAV로 배양된 세포에서 추출한 게놈 DNA에 대해 PCR을 수행했습니다. 세포는 DNA 추출 전에 두 형광 리포터의 동시 발현에 기초하여 분류하였다.겔 전기영동 후, 개별 밴드를 겔로부터 절제하고, 후속 Sanger 시퀀싱을 위해 DNA를 추출하였다. 시퀀싱 결과는 이형 접합 calreticulin-돌연변이 조혈 줄기 및 전구 세포에서 야생형 및 돌연변이 서열의 성공적인 원활한 통합을 확인했습니다. 이 절차를 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 전체 HDR 효율과 이형 접합 돌연변이의 성공적인 녹인 빈도를 결정하기 때문에 가장 성능이 좋은 단일 가이드 RNA를 신중하게 선택하는 것입니다.이 절차에 따라 유전자 조작 세포는 콜로니 형성 단위 분석, 분화 분석 및 면역 결핍 마우스로의 이식과 같은 기능적 시험관 내 및 생체 내 실험에 사용될 수 있습니다.

engineering-oncogenic-heterozygous-gain-function-mutations-human

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

여기서 우리는 LACI 유전자 변형 마우스 모델을 사용하여 정제 조혈 세포의 작은 숫자에 대한 생체 내 돌연변이 분석에 대해 설명합니다. LACI 유전자는 DNA의 돌연변이의 빈도, 위치 및 유형 자발적으로 일어 나 genotoxins에 노출 된 후를 결정하기 위해 분리 할 수있다.

정제 된 조혈 줄기 / 전구 세포에 DNA 돌연변이를 확인

이 프로토콜은 세포 분류에 의한 줄기세포의 사전 정제 없이 조혈 줄기세포/전구 세포 기능을 연구하기 위해 경쟁력 있는 마우스 골수 이식 실험을 설정하기 위한 단계별 지침을 제공합니다.

경쟁 이식은 조혈 줄기 세포의 체력을 평가하는

생쥐에서 다른 인간화 된 골수 틈새를 만들고 살아있는 방법이 제시됩니다. human mesenchymal cells에 의해 만들어지는지지 적 틈새를 기반으로, 인간 내피 세포의 첨가는 인간 혈관의 형성을 유도하는 반면, rhBMP-2의 첨가는 인간 - 마우스 키메라 성숙한 뼈 조직의 형성을 유도한다.

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

여기 자세한 위한 프로토콜 murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R 셀 라인 경작, 수행 하는 바이러스 성 감염, 확산 및 감 별 법 분석 실험 수행 되 게 됩니다. 이 셀 줄은 골수성 세포 개발, 골수성 세포 성장 및 neutrophilic 분화의 유전자의 역할을 공부 하 고 적합 합니다.

확산 및 Murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R의 셀

우리는 유전자 조작된 조 혈 모 세포의 악성 잠재력을 평가 하기 위해 조 혈 모 세포 이식 (HSCT)의 사용을 설명 합니다. HSCT 소설 치료를 평가 하 형성 증후군 (MDS) 또는 백혈병 생쥐의 대형 코 호트 생성 뿐만 아니라 다양 한 악성 조 혈 모 세포에 vivo에서 평가 대 한 유용 합니다.

조 혈 줄기 세포 이식 Myelodysplastic 증후군의 평가에 사용

여기서, 우리는 4개의 골수성 혈통에 제대혈 유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 면역표현특성 및 사이토카인 유도분화를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 적용은 CD34+ 세포의 골수성 분화에 대한 골수성 질환 돌연변이 또는 소분자의 영향에 대한 조사를 포함한다.

인간 코드 혈액 유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 범골수성 분화

설명된 것은 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 뮤린 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)의 고효율 게놈 편집을 위한 프로토콜로 조혈 시스템 별 유전자 수정을 통해 마우스 모델 시스템을 신속하게 개발합니다.

질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집

두경부암 환자에서 돌연변이된 특정 유전자를 가진 뮤린 모델의 개발은 신생물의 이해를 위해 요구된다. 여기서, 우리는 특정 게놈 변경을 가진 뮤린 HNC 세포주를 생성하기 위하여 아데노 관련 바이러스 Cas9 시스템을 사용하여 1 차적인 뮤린 혀 세포의 시험관 내 형형변환을 위한 프로토콜을 제시한다.

아데노 관련 바이러스-Cas9 시스템을 사용하여 유전자 조작 된 뮤린 머리와 목 암 세포라인의 시험관 내 설립

본 프로토콜은 생체 내에서 유전자 편집 세포의 강력한 생착을 위한 최적화된 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC) 배양 절차를 설명합니다.

유전자 치료 애플리케이션을 위한 조혈 줄기 및 전구 세포의 CRISPR/Cas9 유전자 편집

대퇴골 내 주사는 세포를 골수강에 직접 배치하여 소수의 조혈모세포 및 전구세포(HSPC)를 생착할 수 있습니다. 여기에서는 면역 결핍 마우스에 인간 HSPC를 대퇴골 내 주사하는 실험 프로토콜에 대해 설명합니다.

면역저하 마우스에 인간 조혈모세포와 전구세포의 대퇴골내 주입 

여기에서는 CRISPR/Cas9 기술과 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 분석을 통합하여 조혈 줄기 세포 및 전구 세포의 비정상적인 증식 능력에 중요한 후보 유전자를 식별하는 프로토콜을 제시합니다.

CRISPR/Cas9 기술과 세포 계수를 결합한 조혈 줄기 및 전구 세포의 비정상 성장 관련 유전자 평가

학습하세요 인간 조혈 줄기 및 전구 세포에서 CRISPR/Cas9과 rAAV를 이용한 발암성 이형접합체 기능 획득 돌연변이 공학 방법을. 형광 리포터를 활용한 순수 이형접합체 세포 집단의 식별 및 추적이 가능합니다.

인간 조혈 줄기 및 전구 세포에서 발암성 이형접합체 기능 획득 돌연변이 공학

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