March 24th, 2023
여기에서는 다양한 세포 유형의 세포 표면 단백질체의 특성화를 위한 단백질체학 워크플로우에 대해 설명합니다. 이 워크플로우에는 세포 표면 단백질 농축, 후속 시료 전처리, LC-MS/MS 플랫폼을 사용한 분석 및 특수 소프트웨어를 사용한 데이터 처리가 포함됩니다.
이 프로토콜을 통해 다양한 세포 유형의 세포 표면에 존재하는 항원을 조사하여 해당 유형의 세포 또는 조직에 특이적인 항원을 찾을 수 있습니다. 여기에서 제시하는 기술은 전체 세포 용해물에서 세포막 단백질을 농축할 수 있도록 하여 궁극적으로 질량 분석 기반 단백질체학에 의한 분석을 가능하게 합니다. 따라서 이 프로토콜의 한 가지 구체적인 응용 분야는 암 면역 요법의 새로운 표적이 될 수 있는 정상 세포가 아닌 암세포 표면에 존재하는 항원을 찾기 위해 종양 세포에 적용하는 것입니다.
이 프로토콜에 대해 한 가지 주목해야 할 점은 관심 있는 실험에 대해 샘플 입력을 최적화하는 것이 중요할 수 있다는 것입니다. 따라서 최적의 조건을 찾기 위해 여러 번의 반복 또는 적정이 필요할 수 있습니다. 따라서 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 주니어 전문가인 Akul Naik이 될 것입니다.
먼저 영하 80도의 온도에서 동결된 비오틴 표지 세포 펠릿을 제거하고 얼음에서 해동합니다. 펠릿에 500마이크로리터의 2X Lysis Buffer를 넣고 완전히 혼합한 다음 30초 동안 격렬하게 소용돌이칩니다. 얼음 위에서 세포 용해물을 초음파 처리하고, 용해물을 섭씨 4도에서 10분 동안 17, 200G로 원심분리하여 남아 있는 파편을 펠릿으로 만듭니다.
용해물이 원심분리되는 동안 100마이크로리터의 NeutrAvidin Agarose 수지 비드를 진공 매니폴드에 부착된 여과 컬럼에 추가합니다. 부드러운 진공 청소기를 적용하고 비드 위에 Wash Buffer 3 3을 흘려 비드 1을 세척합니다. 진공 매니폴드에서 여과 컬럼을 제거하고 바닥을 덮은 다음 정제된 세포 용해물을 비드가 있는 컬럼에 추가합니다.
컬럼 상단을 덮고 엔드-투-엔드(end-to-end) 로터에서 비드와 함께 용해물을 섭씨 4도에서 120분 동안 배양합니다. 용해물 배양을 완료한 후 여과 컬럼을 진공 매니폴드에 다시 놓고 부드러운 진공 청소기를 적용합니다. 비드 위에 Wash Buffer 1 5ml를 흘려 비드를 세척합니다.
Wash Buffer 2와 Wash Buffer 3 5ml로 세척 단계를 반복합니다. 최종 Wash Buffer가 비드를 통해 완전히 흐르면 매니폴드에서 컬럼을 제거합니다. 그런 다음 비드에 100마이크로리터의 용해 용액을 추가하고 피펫을 사용하여 1.7ml의 저단백질 결합 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
튜브를 짧게 돌려 비드를 가라앉히고 용액 50마이크로리터를 제거합니다. 그런 다음 섭씨 65도의 열 블록 셰이커에 튜브를 1000RPM 쉐이킹으로 10분 동안 놓습니다. 210마이크로리터의 재현탁액을 넣고 위아래로 여러 번 피펫팅하여 건조된 트립신이 모두 재현탁되도록 하여 키트의 분해 튜브에 있는 건조된 트립신을 재현탁합니다.
비드 배양이 끝나면 열 블록 셰이커에서 제거하고 재현탁된 트립신 용액 50마이크로리터를 비드에 추가합니다. 단백질을 소화하기 위해 섭씨 37도에서 튜브를 배양하고 500RPM으로 최소 90분 동안 흔듭니다. 분해가 완료되면 비드가 포함된 용액을 스핀 컬럼으로 옮기고 컬럼을 1.7ml의 저단백질 결합 마이크로 원심분리기 튜브에 삽입합니다.
튜브를 돌려 비드에서 분해된 펩타이드 용액을 분리합니다. 다음으로, 100 마이크로 리터의 정지 용액을 첨가하여 소화 반응을 중지하고 펩타이드 용액을 산성화합니다. 튜브 어댑터를 사용하여 1.7ml의 저단백질 결합 마이크로 원심분리 튜브에 탈염 컬럼을 배치합니다.
전체 산성화된 펩타이드 용액을 컬럼에 추가합니다. 용액이 컬럼을 통해 흐르도록 3, 800G에서 3분 동안 컬럼을 회전시킵니다. 이제 펩타이드가 컬럼에 결합되므로 flow-through를 폐기합니다.
컬럼에 Wash 1 용액 200마이크로리터를 추가하고 실온에서 3, 800G로 3분 동안 회전한 다음 플로우 스루를 버립니다. 200마이크로리터의 Wash 2 용액으로 세척 단계를 반복합니다. 컬럼을 새로 라벨링된 1.7ml 저단백질 결합 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
컬럼에 100마이크로리터의 용리 용액을 추가하고 실온에서 3, 800G로 3분 동안 회전합니다. 이제 펩타이드가 컬럼에서 튜브로 용리됩니다. 펩타이드 용액을 진공 원심분리기에 넣고 밤새 건조시킵니다.
건조된 펩타이드를 질량분석기에서 정량화하고 분석할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도에 놓습니다. 단백질 분석은 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법을 사용하여 농축된 세포 표면 단백질을 특성화하기 위해 수행되었습니다. 마이크로리터당 약 630나노그램의 최종 펩타이드 농도는 비색 펩타이드 정량화 분석을 기반으로 얻어졌습니다.
MaxQuant를 사용하여 분석한 질량 분석 데이터와 세포 표면 단백질에 대한 후속 데이터 세트 분석을 통해 샘플에서 601개의 표면 단백질이 생성되었으며, 이는 확인된 모든 단백질의 약 27%입니다. 안드로메다 점수에서 식별된 단백질의 분포를 나타내는 플롯이 여기에 나와 있으며, 산점도는 샘플 간 상관 관계를 보여줍니다. 상자 그림은 run-to-run 변동을 나타냅니다.
그리고 표본별 분포도는 반복실험의 데이터 품질을 나타냅니다. 명심해야 할 가장 중요한 것은 각 단계에서 펩타이드가 어디에 있는지입니다. 처음에는 용액에 담겨 있다가 분해될 때까지 비드에 결합되어 있다가 최종적으로 용출될 때까지 탈염 컬럼에 결합됩니다.
이 절차에 따라 표적 유세포 분석 및 표적 단백질체학(targeted proteomics)과 같이 식별된 소수의 단백질을 검증할 수 있는 다양한 방법이 있습니다. 이를 통해 샘플 전체에서 이러한 단백질의 발현 수준에 대한 자세한 정보를 얻을 수 있습니다.
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이 프로토콜은 다양한 세포 유형의 세포 표면 단백질체를 특성화하기 위한 워크플로를 설명하며, 항원 식별에 중점을 둡니다. 단백질 농축, 샘플 준비, 및 질량 분석 분석을 위한 단계를 포함합니다.
Comprehensive cell surface proteome profiling is critical for target validation and therapeutic hypothesis generation in oncology and immunotherapy pipelines. The described workflow enables label-free quantification and enrichment of membrane proteins, directly supporting the identification of disease-specific antigens and actionable targets. This capability enhances predictive confidence at the early discovery and lead identification stages, informing portfolio triage and risk-adjusted advancement.
This workflow integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing a bridge to preclinical validation for surface protein targets.