Name: Cell Surface Proteome의 Label-free 정량화를 위한 Cell Surface Capture 워크플로우 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: 배우세요 세포 표면 단백질을 풍부하게 하고 질량 분석법으로 정량하는 방법을. 이 프로토콜은 종양 세포의 특이 항원을 식별하여 암 면역 치료 표적을 발굴하는 데 활용됩니다.

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LC-MS/MS 런 설정에 도움을 주신 Dr. Kamal Mandal(UCSF 진단검사의학과)님, 데이터 분석을 지원해 주신 Deeptarup Biswas(BSBE, IIT Bombay)님, 데이터 분석을 지원해 주신 Audrey Reeves 박사님(UCSF 진단검사의학과)님께 감사드립니다. A.P.W. 실험실의 관련 작업은 NIH R01 CA226851 및 Chan Zuckerberg Biohub의 지원을 받습니다. 그림 1과 그림 2B는 BioRender.com 를 사용하여 만든 것입니다.

참고: 이 세포 표면 단백질체 실험에는 AMO1 형질세포종 세포가 사용되었습니다. 다양한 종류의 현탁액 및 부착 세포주9뿐만 아니라 다양한 유형의 1차 샘플10을 포함한 다른 세포 유형에도 동일한 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 그러나 세포 수(실험을 위한 출발 물질)는 일반적으로 동등한 단백질체 커버리지를 위해 최적화되어야 합니다. 재료 및 장비에 관한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 완충액 및 시약 용액 및 그 조성에 관한 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오.
1. 비오틴을 사용한 세포 표면 라벨링
<ol>
	<li>배양된 세포를 계수하고 원심분리(500 × g, 24 °C에서 5분)로 약 3.5 × 107 살아있는 세포를 펠릿화합니다. 
	참고: AMO1 형질세포종(plasmacytoma cell)은 수확 전 3일마다 새로운 배지로 배양되었습니다.</li>
	<li>상층액을 흡인하고 1mL의 냉(4°C) Dulbecco의 인산염 완충 식염수(D-PBS)(칼슘 없음, 마그네슘 없음)를 첨가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 펠릿을 재현탁합니다.</li>
	<li>셀을 다시 펠릿화하고(1.1단계와 같이) 세척 단계(1.2단계)를 한 번 더 반복합니다(총 2회 세척).</li>
	<li>두 번째 세척 후 세포를 펠렛화하고(1.1단계와 같이) 부드럽게 피펫팅하여 990μL의 차가운 D-PBS에 재현탁합니다.</li>
	<li>사전에 160mM 메타기간산나트륨(NaIO4)의 원액을 준비합니다. 50 μL 분취량으로 분할하여 -20 °C에서 최대 6개월 동안 보관합니다. 1.4단계에서 160mM 메타존산나트륨 용액 10μL를 세포 현탁액에 첨가하고 철저히 혼합한 후 4°C에서 20분 동안 엔드-투-엔드(end-to-end) 로터에서 배양합니다.</li>
	<li>배양이 완료된 후, 세포를 펠렛화하고(1.1단계와 같이), 상층액을 디캔팅한 다음 1mL의 차가운 D-PBS에 재현탁합니다. 이 세척 단계를 두 번 반복합니다(총 3회 세탁). 세 번째 세척 후 989μL의 D-PBS에 세포를 재현탁합니다.</li>
	<li>사전에 100mM 바이오사이틴 히드라지드의 원액을 준비합니다. 50 μL 분취량으로 분할하여 -20 °C에서 최대 6개월 동안 보관합니다. 1.6단계에서 아닐린 1μL와 100mM 바이오사이틴 히드라지드 10μL를 세포 현탁액에 첨가하고 완전히 혼합한 다음 4°C에서 60분 동안 엔드 투 엔드 로터에서 배양합니다.</li>
	<li>배양이 완료된 후, 세포를 펠렛화하고(1.1단계와 같이), 상층액을 디캔팅한 다음 1mL의 차가운 D-PBS에 재현탁합니다. 이 세척 단계를 두 번 반복합니다(총 3회 세탁).</li>
	<li>세 번째 세척 후 피펫으로 상층액을 조심스럽게 흡인하고 튜브를 액체 N2 에 넣어 세포 펠릿을 스냅 동결합니다. 동결 펠릿을 -80 °C에 놓고 용해 및 풀다운을 진행할 준비가 될 때까지 기다립니다.</li>
</ol>
2. 세포 용해 및 비오틴 풀다운
<ol>
	<li>얼어붙은 세포 펠릿을 얼음 위에서 해동합니다.</li>
	<li>펠릿에 500μL의 2x 용해 완충액을 추가하고 철저히 혼합한 다음 30초 동안 와류< />
	알림: 펠릿을 완전히 용해시키기 위해 격렬한 피펫팅과 볼텍싱이 필요할 수 있습니다. 일부 불용성 파편(즉, DNA)은 후속 초음파 처리 단계에서 제거되므로 허용됩니다.</li>
	<li>얼음 위에서 세포 용해물을 초음파 처리합니다(3회 버스트, 각 20초, 60% 듀티 사이클).</li>
	<li>용해물을 원심분리하여 잔여 파편을 펠릿화합니다(17,200에서 10분, 4°C에서 ×g).</li>
	<li>용해물이 원심분리되는 동안 100μL의 뉴트라비딘 아가로스 수지 비드를 여과 컬럼에 추가합니다. 컬럼을 진공 매니폴드에 부착하고 부드러운 진공 청소기를 적용한 다음 비드 위에 3mL의 세척 버퍼 1을 흘려 비드를 세척합니다.</li>
	<li>진공 매니폴드에서 여과 컬럼을 제거하고 바닥을 덮은 다음 정제된 세포 용해물을 비드가 있는 컬럼에 추가합니다. 컬럼 상단을 덮고 4°C에서 120분 동안 엔드-투-엔드 로터의 비드와 함께 용해물을 배양합니다. 
	알림: 컬럼 상단을 캡을 씌울 때 하단 캡을 제자리에 단단히 고정하지 않으면 캡이 빠지고 배양 중에 세포 용해물이 누출될 수 있습니다.</li>
	<li>세척 버퍼 1, 2 및 3(샘플당 각 세척 버퍼 약 5mL, 표 1 참조)을 준비하고 42°C 수조에 넣습니다</li>.
	<li>용해물이 배양이 완료된 후 여과 컬럼을 진공 매니폴드에 다시 놓고 부드러운 진공 청소기를 적용한 다음 비드 위에 5mL의 세척 버퍼 1을 흘려 비드를 세척합니다. 
	알림: 세척 버퍼의 5mL 이상을 세탁에 사용할 수 있습니다. 추가 세척은 비드에 대한 배경의 비특이적 결합을 줄일 수 있습니다.</li>
	<li>5mL의 세척 버퍼 2로 세척 단계를 반복합니다.</li>
	<li>5mL의 세척 버퍼 3으로 세척 단계를 반복합니다.</li>
	<li>최종 세척 버퍼가 비드를 통해 완전히 흐르면 매니폴드에서 컬럼을 제거합니다. 비드에 100μL의 "Lyse" 용액을 추가하고 피펫을 사용하여 1.7mL 저단백질 결합 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 짧게 돌려 비드를 침전시키고 침전된 비드를 방해하지 않고 용액 50μL를 제거합니다. 
	참고: 이 단계와 모든 후속 단계의 시약은 시중에서 판매되는 단백질체학 시료 전처리 키트를 사용합니다. 이 키트는 최적화되고 간소화된 시료 전처리 워크플로우를 제공합니다. 그러나 이러한 단계는 Verma et al.9에 설명된 대로 기존 단백질체학 워크플로우를 사용하여 키트와 독립적으로 수행할 수도 있습니다. 비드가 컬럼의 측면이나 바닥에 붙어 있는 경우 튜브로 옮겨진 비드가 가라앉을 때까지 하고 튜브에 여분의 "Lyse" 용액을 사용하여 나머지 비드를 옮깁니다.</li>
	<li>튜브를 65°C의 열 블록/셰이커에 놓고 1,000rpm으로 10분 동안 흔듭니다. 
	참고: 이 단계는 분해 전에 시스테인 잔류물의 환원 및 알킬화에 필요합니다.</li>
</ol>
3. 단백질 소화
<ol>
	<li>"Resuspend" 용액 210μL를 첨가하여 건조된 트립신(키트의 "Digest" 튜브, -20°C에서 보관)을 재현탁합니다. 건조된 모든 트립신이 다시 부유하도록 용액을 위아래로 여러 번 피펫합니다.</li>
	<li>배양이 완료된 후 50μL의 재현탁된 트립신 용액을 비드에 추가합니다. 단백질을 소화하기 위해 37°C에서 500rpm으로 최소 90분 동안 흔들어 튜브를 배양합니다.</li>
	<li>분해가 완료되면 비드가 포함된 용액을 스핀 컬럼으로 옮기고 컬럼을 1.7mL 저단백질 결합 마이크로 원심분리 튜브에 삽입합니다. 튜브를 돌리고(실온[RT]에서 5분 동안 500×g) 분해된 펩타이드 용액을 비드에서 분리합니다. 
	참고: 이 단계에서 펩타이드 용액에서 비드가 분리되면 비드에 PNGase 처리를 수행하여 스트렙타비딘 비드에서 비오틴화 펩타이드 단편을 용리할 수 있습니다. 그런 다음 이 펩타이드 샘플은 온비드 트립신화(on-bead trypsinization)의 1차 샘플과 분석 및 비교할 수 있는 별도의 2차 펩타이드 샘플로 워크플로우의 나머지 부분을 통해 전달될 수 있습니다. PNGase 접근법은 MS 검출 가능한 곁사슬 변형을 기반으로 포획된 N-글리코실화 아스파라진에 대한 추가 특이성을 감안할 때 온비드 트립신화에 보완적인 데이터를 제공할 가능성이 높습니다12. 그러나 이러한 순차 용리 접근법의 단점은 시료 분석당 질량분석기 기기 시간이 두 배로 늘어난다는 것입니다.</li>
	<li>100μL의 "Stop" 용액을 첨가하여 분해 반응을 중지하고 펩타이드 용액을 산성화합니다.</li>
</ol>
4. 펩타이드 탈염
<ol>
	<li>튜브 어댑터를 사용하여 1.7mL 저단백질 결합 마이크로 원심분리 튜브에 탈염 컬럼을 배치합니다. 전체 산성화된 펩타이드 용액을 컬럼에 추가합니다. 용액이 컬럼을 통해 흐르도록 컬럼(3분 동안 3,800×g)을 돌립니다. 펩타이드는 이제 컬럼에 결합됩니다. 플로우스루를 폐기합니다.</li>
	<li>컬럼에 200μL의 "Wash 1" 용액을 추가하고 회전합니다(3분 동안 3,800×g, RT). 플로우스루를 폐기합니다.</li>
	<li>컬럼에 200μL의 "Wash 2" 용액을 추가하고 회전합니다(3분 동안 3,800×g, RT). 플로우스루를 폐기합니다.</li>
	<li>컬럼을 라벨이 부착된 새로운 1.7mL 저단백질 결합 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 컬럼에 100μL의 "용리" 용액을 추가하고 회전합니다(3분 동안 3,800×g, RT). 컬럼에 100μL의 "용리" 용액을 더 추가하고 회전합니다(3분 동안 3,800×g, RT). 이제 펩타이드가 컬럼에서 튜브로 용리됩니다.</li>
	<li>펩타이드 용액을 진공 원심분리기에 넣고 밤새 건조시킵니다. 정량화할 준비가 될 때까지 건조된 펩타이드를 -80°C에 놓고 질량분석기에서 분석합니다.</li>
</ol>
5. 펩타이드 재현탁 및 정량화
<ol>
	<li>건조된 펩타이드를 20μL의 용매 A(0.1% 포름산, 2% 아세토니트릴)에 재현탁합니다.</li>
	<li>재현탁 펩타이드(17,200 ×g, 10분 동안)를 원심분리하여 불용성 파편을 펠릿화합니다.</li>
	<li>비색 펩타이드 정량 분석을 위한 펩타이드 표준물을 준비합니다.
	<ol>
		<li>5μL의 1,000mg/mL 펩타이드 원액을 96웰 플레이트의 한 웰에 넣습니다.</li>
		<li>웰당 각 표준물질 5μL를 사용하여 탈이온수(DI)로 플레이트에서 1,000mg/mL, 500mg/mL, 250mg/mL, 125mg/mL, 62.5mg/mL, 31.25mg/mL 및 15.625mg/mL와 같은 7단계 연속 희석을 수행합니다. 블랭크를 위해 여덟 번째 웰에 5μL의 DI 물을 놓습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>4μL의 DI 물을 96웰 플레이트의 개별 웰 3개에 놓습니다. 총 부피 5 μL. 에 대해 각 웰에 1 μL의 재현탁 펩타이드 용액을 추가합니다.
	알림: 정량화를 위해 펩타이드 용액을 피펫팅할 때 용액 상단에서 조심스럽게 피펫팅하여 침전된 파편이 방해받지 않도록 합니다.</li>
	<li>얼마나 많은 작업 시약이 필요한지 계산합니다(웰당 45μL 필요). 필요한 부피의 비색 분석 작업 시약을 준비합니다. 구성 요소의 적절한 혼합을 보장하기 위해 작업 시약을 와류로 만듭니다.</li>
	<li>작업 시약 45μL를 각 표준물질 및 샘플 웰에 추가합니다. 
	참고: 표준물질을 복제하고 멀티채널 피펫을 사용하여 시약이 웰에 추가되는 타이밍의 차이를 최소화합니다.</li>
	<li>플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 37°C에서 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>자동 플레이트 리더에서 플레이트를 분석합니다. 표준 샘플에 대해 기록된 흡광도 값을 사용하여 선형 표준 곡선을 생성합니다. 표준 곡선과 R2 값의 방정식을 결정합니다. R2 값이 합리적인 경우(≥0.95) 표준 곡선을 사용하여 비색 분석 플레이트의 5배 희석을 고려하여 재현탁 펩타이드의 농도를 측정합니다.</li>
</ol>
6. 분해된 펩타이드의 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 분석
<ol>
	<li>용매 A를 첨가하여 펩타이드 샘플의 농도를 0.2μg/μL로 조정하고 10μL를 0.6mL 저단백질 결합 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>튜브를 LC 오토샘플러에 넣습니다.</li>
	<li>그림 2 및 그림 3에 따라 LC 및 MS/MS 매개변수를 설정합니다.</li>
	<li>분석을 위해 5 μL(1 μg)의 펩타이드 샘플을 LC-MS/MS 설정에 주입합니다. 
	참고: 여기에 표시된 LC-MS/MS 설정은 그림에만 해당됩니다. LC 및 MS 기기 가용성에 따라 사용자는 LC 그래디언트 및 MS/MS 파라미터에 대한 설정을 수정하여 깊은 단백질체 커버리지를 얻을 수 있습니다. 본 논문에서는 MS 데이터 분석은 MaxQuant https://www.maxquant.org/ 을, 2차 데이터 분석은 Perseus https://maxquant.net/perseus/ 을, 경로 분석은 https://reactome.org/ 를 이용하여 수행하였다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

질량 분석 기반 단백질체학은 이전에는 불가능했던 규모로 수천 개의 알려지지 않은 단백질의 편향 없는 특성화를 가능하게 하는 강력한 도구입니다. 이 접근 방식을 통해 특정 샘플에 존재하는 다양한 단백질을 특성화하여 단백질을 식별하고 정량화할 수 있을 뿐만 아니라 세포와 조직의 구조 및 신호 전달 능력에 대한 다양한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 샘플의 글로벌 단백질 프로파일링을 넘어 질량 분석법을 통해 이러한 단백질에 대한 다양한 번역 후 변형(PTM)을 특성화할 수 있으며, DNA 또는 RNA 수준1에서 분석할 때 사용할 수 없는 신호 전달 경로 및 단백질 역학의 단계를 훨씬 더 깊이 엿볼 수 있습니다. 새로운 암 치료제 개발을 위해 질량 분석 기반 단백질체학을 통해 악성 종양 세포와 건강한 조직의 단백질 프로필을 비교하여 잠재적인 약물 투여 가능한 표적을 식별할 수 있습니다. 
빠르게 성장하는 암 면역 요법 분야는 악성 세포 표면에 발현...

단백질은 대부분의 세포 기능이 수행되는 기본 단위 역할을 합니다. 관련 단백질의 구조와 기능을 특성화하는 것은 생물학적 과정을 이해하는 데 필수적인 단계입니다. 지난 10년 동안 질량 분석 기술, 분석 소프트웨어 및 데이터베이스의 발전으로 단백질 차원의 단백질을 정확하게 검출하고 측정할 수 있게 되었습니다1. 질량 분석 기반 단백질체학은 생화학 경로의 기초 과학 분석부터 중개 환경에서의 새로운 약물 표적 식별, 임상에서의 질병 진단 및 모니터링에 이르기까지 다양한 응용 분야에서 활용될 수 있습니다2. 새로운 약물 표적을 스크리닝할 때 세포 표면 단백질체의 특성화가 특히 중요하며, 현재 승인된 인간 약물의 65% 이상이 세포 표면 단백질을 표적으로 합니다3. 암 면역 요법 분야는 또한 종양 세포를 표적으로 하고 특이적으로 제거하기 위해 암 특이적 세포 표면 항원에 전적으로 의존합니다4. 따라서 질량 분석 기반 단백질체학은 치료 개입을 위한 새로운 세포 표면 단백질을 식별하는 유망한 도구 역할을 할 수 있습니다.
그러나 기존의 단백질체학 방법을 사용하여 새로운 세포 표면 단백질 표적에 대한 종양 세포를 조사할 때 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 주요 관심사는 표면 단백질이 세포의 전체 단백질 분자 중 매우 작은 부분을 차지한다는 것입니다. 따라서 이러한 단백질의 단편은 전체 세포 용해물5의 질량 분석 분석을 수행할 때 높은 양의 세포 내 단백질에 의해 가려집니다. 이러한 한계로 인해 기존의 단백질체학 워크플로우로 세포 표면 단백질체를 정확하게 특성화하는 것이 어렵습니다. 이 문제를 해결하려면 질량 분석기에서 분석하기 전에 전체 세포 용해물에서 세포 표면 단백질을 농축하는 방법을 개발해야 합니다. 이러한 방법 중 하나는 온전한 세포에서 글리코실화된 세포 표면 단백질의 산화 및 비오틴 라벨링을 포함하고, 이후 뉴트라비딘 풀다운으로 용해물에서 이러한 비오틴화된 단백질을 농축하는 것인데, 이 과정을 "cell surface capture"6이라고 합니다. 포유류 세포 표면 단백질의 ~85%가 glycosylated7인 것으로 생각되기 때문에 이는 전체 세포 용해물에서 세포 표면 단백질체를 농축하는 효과적인 방법으로 사용됩니다. 이 백서에서는 배양된 세포부터 시작하여 세포 표면 비오틴 라벨링과 질량 분석 분석을 위한 후속 시료 준비의 전체 워크플로우를 설명합니다(그림 1). 여러 번의 반복에 걸쳐 이 방법은 특정 샘플의 세포 표면 단백질체에 대한 강력한 커버리지를 제공합니다. 이 방법을 활용하여 종양과 건강한 세포 모두의 세포 표면 단백질체를 특성화하면 새로운 세포 표면 항원의 발견을 촉진하여 잠재적인 면역 치료 표적을 식별할 수 있습니다8.

<table><tbody><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96X iST 시료 전처리 키트</td><td>PreOmics</td><td>P.O.00027</td><td>단백질체학 시료 전처리 키트. 환원, 알킬화 및 분해를 위한 시약이 포함되어 있습니다. 또한 탈염 컬럼 및 시약이 포함됩니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>Pierce 정량 비색 펩타이드 분석</td><td>Thermo</td><td>23275</td><td>펩타이드 정량 분석 키트. 펩타이드 표준물질 및 작업 시약의 구성 요소를 포함합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Millipore Sigma</td><td>09830-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin hydrazide</td><td>Biotium</td><td>90060</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (w/o Calcium and Magnesium Salts)</td><td>UCSF Cell Culture Facility</td><td>CCFAL003-225B01</td><td></td></tr><tr><td>Formic Acid</td><td>Honeywell</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Halt 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 일회용 칵테일</td><td>Thermo</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>고용량 Neutravidin Agarose 수지</td><td>Thermo</td><td>29204</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>UCSF 세포 배양 시설</td><td>CCFAL001-22J01</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 용해 완충액, 10x</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-188</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>메타기간산나트륨</td><td>Alfa Aesar</td><td>13798</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>초순수 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Urea (단백질체학 등급)</td><td>VWR</td><td>M123-1KG</td><td></td></tr><<tr><td>강력한>장비</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC20 자동 세포 계수기</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>PrismR 마이크로 원심분리기</td><td>Labnet International</td><td>C2500-R-230V</td><td></td></tr><tr><td>초음파 발생기</td><td>VWR</td><td>Branson Sonifier 240</td><td></td></tr><tr><td>진공 매니폴드</td><td>Promega</td><td>Promega Vac-Man</td><td></td></tr><tr><td>쉐이킹 히트블록</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf Thermomixer C</td><td></td></tr><tr><td>엔드-투-엔드 회전기</td><td>Labnet</td><td>리볼버 조절 가능한 회전기</td><td></td></tr><tr><td>LC</td><td>Thermo</td><td>Ultimate 3000 HPLC 및 UHPLC</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus 하이브리드 사중극자 Orbitrap 질량분석기</td><td>Thermo</td><td>IQLAAEGAAPfalgmbdk</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>Biotek</td><td>Biotek Synergy 2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>진공 농축기</td><td>Labconco</td><td>7810010</td><td></td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Protein LoBind Tubes</td>, <td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL microcentrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, filtration column,</td><td>bio-rad</td>, <td>7326008</td><td></td></tr><tr><td>spin columns</td><td>thermo</td><td>69725</td><td></td></tr></tbody></table>년

cell surface proteome의 label-free 정량화를 위한 "cell surface capture" 워크플로우

"Cell Surface Capture" Workflow for Label-Free Quantification of the Cell Surface Proteome

지난 10년 동안 질량 분석 기반 단백질체학은 광범위한 응용 분야에서 생물학적 시스템의 심층적인 특성화를 가능하게 했습니다. 인간 질병의 세포 표면 단백질체("surfaceome")는 원형질막 단백질이 대부분의 임상적으로 승인된 치료법의 주요 표적일 뿐만 아니라 건강한 조직과 병든 세포를 진단적으로 구별하는 주요 기능이기 때문에 매우 중요합니다. 그러나 세포의 막 및 표면 단백질에 대한 집중적인 특성화는 주로 다른 고농도 단백질에 의해 관심 단백질을 가리는 세포 용해물의 복잡성으로 인해 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 이러한 기술적 장벽을 극복하고 질량 분석 단백질체학을 사용하여 다양한 세포 유형의 세포 표면 단백질체를 정확하게 정의하려면 질량 분석기에서 분석하기 전에 세포 표면 단백질의 세포 용해물을 농축해야 합니다. 이 논문은 암세포의 세포 표면 단백질을 라벨링하고, 세포 용해물에서 이러한 단백질을 농축하고, 질량 분석 분석을 위한 후속 시료 준비를 위한 자세한 워크플로우를 제시합니다.

본 실험에서는 라벨링을 통해 종양 세포주의 세포 표면 프로테옴을 특성화하였습니다. N온전한 세포의 당화 막 단백질을 비오틴으로 표지하고, 뉴트라비딘 풀다운(neutravidin pulldown)을 통해 전세포 용해물(whole cell lysate)에서 이러한 표지 단백질을 농축하여(그림 1). 또한, 농축된 세포 표면 단백질을 특성화하기 위해 LC-MS/MS를 이용한 단백질체 분석을 수행하였습니다. 전체 세포 단백질체 분석과 달리, 본 분석의 목적은 세포 표면 단백질만을 특성화하는 것이었습니다. 따라서 3.5 × 10의 시료 투입량으로 시작하였습니다.7 AMO-1 형질세포종 세포. 최종 펩타이드 농도는 ~630 ng/µL 비색법 펩타이드 정량 분석을 기반으로 하였으며, 총 수율은 약 ~12.6 µg 펩타이드의 (in 20 µL) (그림 2A). 그런 다음 우리는 주입했습니다 1 µg 펩...

여기에서는 다양한 세포 유형의 세포 표면 단백질체의 특성화를 위한 단백질체학 워크플로우에 대해 설명합니다. 이 워크플로우에는 세포 표면 단백질 농축, 후속 시료 전처리, LC-MS/MS 플랫폼을 사용한 분석 및 특수 소프트웨어를 사용한 데이터 처리가 포함됩니다.

Cell Surface Proteome의 Label-free 정량화를 위한 "Cell Surface Capture" 워크플로우

Over the past decade, mass spectrometry-based proteomics has enabled an in-depth characterization of biological systems across a broad array of ...

이 프로토콜을 통해 다양한 세포 유형의 세포 표면에 존재하는 항원을 조사하여 해당 유형의 세포 또는 조직에 특이적인 항원을 찾을 수 있습니다. 여기에서 제시하는 기술은 전체 세포 용해물에서 세포막 단백질을 농축할 수 있도록 하여 궁극적으로 질량 분석 기반 단백질체학에 의한 분석을 가능하게 합니다. 따라서 이 프로토콜의 한 가지 구체적인 응용 분야는 암 면역 요법의 새로운 표적이 될 수 있는 정상 세포가 아닌 암세포 표면에 존재하는 항원을 찾기 위해 종양 세포에 적용하는 것입니다.이 프로토콜에 대해 한 가지 주목해야 할 점은 관심 있는 실험에 대해 샘플 입력을 최적화하는 것이 중요할 수 있다는 것입니다. 따라서 최적의 조건을 찾기 위해 여러 번의 반복 또는 적정이 필요할 수 있습니다. 따라서 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 주니어 전문가인 Akul Naik이 될 것입니다.먼저 영하 80도의 온도에서 동결된 비오틴 표지 세포 펠릿을 제거하고 얼음에서 해동합니다. 펠릿에 500마이크로리터의 2X Lysis Buffer를 넣고 완전히 혼합한 다음 30초 동안 격렬하게 소용돌이칩니다. 얼음 위에서 세포 용해물을 초음파 처리하고, 용해물을 섭씨 4도에서 10분 동안 17, 200G로 원심분리하여 남아 있는 파편을 펠릿으로 만듭니다.용해물이 원심분리되는 동안 100마이크로리터의 NeutrAvidin Agarose 수지 비드를 진공 매니폴드에 부착된 여과 컬럼에 추가합니다. 부드러운 진공 청소기를 적용하고 비드 위에 Wash Buffer 3 3을 흘려 비드 1을 세척합니다. 진공 매니폴드에서 여과 컬럼을 제거하고 바닥을 덮은 다음 정제된 세포 용해물을 비드가 있는 컬럼에 추가합니다.컬럼 상단을 덮고 엔드-투-엔드(end-to-end) 로터에서 비드와 함께 용해물을 섭씨 4도에서 120분 동안 배양합니다. 용해물 배양을 완료한 후 여과 컬럼을 진공 매니폴드에 다시 놓고 부드러운 진공 청소기를 적용합니다. 비드 위에 Wash Buffer 1 5ml를 흘려 비드를 세척합니다.Wash Buffer 2와 Wash Buffer 3 5ml로 세척 단계를 반복합니다. 최종 Wash Buffer가 비드를 통해 완전히 흐르면 매니폴드에서 컬럼을 제거합니다. 그런 다음 비드에 100마이크로리터의 용해 용액을 추가하고 피펫을 사용하여 1.7ml의 저단백질 결합 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.튜브를 짧게 돌려 비드를 가라앉히고 용액 50마이크로리터를 제거합니다. 그런 다음 섭씨 65도의 열 블록 셰이커에 튜브를 1000RPM 쉐이킹으로 10분 동안 놓습니다. 210마이크로리터의 재현탁액을 넣고 위아래로 여러 번 피펫팅하여 건조된 트립신이 모두 재현탁되도록 하여 키트의 분해 튜브에 있는 건조된 트립신을 재현탁합니다.비드 배양이 끝나면 열 블록 셰이커에서 제거하고 재현탁된 트립신 용액 50마이크로리터를 비드에 추가합니다. 단백질을 소화하기 위해 섭씨 37도에서 튜브를 배양하고 500RPM으로 최소 90분 동안 흔듭니다. 분해가 완료되면 비드가 포함된 용액을 스핀 컬럼으로 옮기고 컬럼을 1.7ml의 저단백질 결합 마이크로 원심분리기 튜브에 삽입합니다.튜브를 돌려 비드에서 분해된 펩타이드 용액을 분리합니다. 다음으로, 100 마이크로 리터의 정지 용액을 첨가하여 소화 반응을 중지하고 펩타이드 용액을 산성화합니다. 튜브 어댑터를 사용하여 1.7ml의 저단백질 결합 마이크로 원심분리 튜브에 탈염 컬럼을 배치합니다.전체 산성화된 펩타이드 용액을 컬럼에 추가합니다. 용액이 컬럼을 통해 흐르도록 3, 800G에서 3분 동안 컬럼을 회전시킵니다. 이제 펩타이드가 컬럼에 결합되므로 flow-through를 폐기합니다.컬럼에 Wash 1 용액 200마이크로리터를 추가하고 실온에서 3, 800G로 3분 동안 회전한 다음 플로우 스루를 버립니다. 200마이크로리터의 Wash 2 용액으로 세척 단계를 반복합니다. 컬럼을 새로 라벨링된 1.7ml 저단백질 결합 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.컬럼에 100마이크로리터의 용리 용액을 추가하고 실온에서 3, 800G로 3분 동안 회전합니다. 이제 펩타이드가 컬럼에서 튜브로 용리됩니다. 펩타이드 용액을 진공 원심분리기에 넣고 밤새 건조시킵니다.건조된 펩타이드를 질량분석기에서 정량화하고 분석할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도에 놓습니다. 단백질 분석은 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법을 사용하여 농축된 세포 표면 단백질을 특성화하기 위해 수행되었습니다. 마이크로리터당 약 630나노그램의 최종 펩타이드 농도는 비색 펩타이드 정량화 분석을 기반으로 얻어졌습니다.MaxQuant를 사용하여 분석한 질량 분석 데이터와 세포 표면 단백질에 대한 후속 데이터 세트 분석을 통해 샘플에서 601개의 표면 단백질이 생성되었으며, 이는 확인된 모든 단백질의 약 27%입니다. 안드로메다 점수에서 식별된 단백질의 분포를 나타내는 플롯이 여기에 나와 있으며, 산점도는 샘플 간 상관 관계를 보여줍니다. 상자 그림은 run-to-run 변동을 나타냅니다.그리고 표본별 분포도는 반복실험의 데이터 품질을 나타냅니다. 명심해야 할 가장 중요한 것은 각 단계에서 펩타이드가 어디에 있는지입니다. 처음에는 용액에 담겨 있다가 분해될 때까지 비드에 결합되어 있다가 최종적으로 용출될 때까지 탈염 컬럼에 결합됩니다.이 절차에 따라 표적 유세포 분석 및 표적 단백질체학(targeted proteomics)과 같이 식별된 소수의 단백질을 검증할 수 있는 다양한 방법이 있습니다. 이를 통해 샘플 전체에서 이러한 단백질의 발현 수준에 대한 자세한 정보를 얻을 수 있습니다.

cell-surface-capture-workflow-for-label-free-quantification-cell

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

단순하고 구체적인 방법은 분획화 단계없이 형광 라벨 부착 및 세포 표면 단백질의 향상된 감지를위한 시연했다. 세포 표면 단백질의 차동 풍부한는 (2 - D) 2 차원 전기 영동과 Ettan ™ DIGE 기술을 사용하여 분석했다.

CyDye DIGE 플루어 최소 염료를 사용하여 셀 표면 단백질의 선택적 Labelling

질량 분광법의 발전은 조직의 호스트에 단백질 표현 및 수정의 높은 처리량 분석을 허용하고 있습니다. subcellular 분류 및 질병 모델, 분광 및 생물 정보학은 생물 시스템에 새로운 속성을 표시 할 수 있습니다 양적 질량과 결합. 여기에 설명 된 방법은 심장 질환의 설정에 염색질 - 관련 단백질을 분석하고 다른 사람에게 쉽게 적용 할 수...

질병의 염색질 Proteomes의 정량 분석

세포 표면 단백질은 생물학적으로 중요하고 광범위 글리코 실화이다. 우리는 손쉬운 LC-MS 기반 단백체 분석을 위해이 단백질을 용해 풍부하고 deglycosylate 여기 글리코 펩타이드 캡처 방법을 소개합니다.

세포 표면 단백질 체학 (Proteomics)에 대한 글리코 펩타이드 캡처

형광 표지 된 세포의 다중 이미지 기반 분석을 가능하게하는 유연한 정보학 워크 플로우입니다 발표. 워크 플로는 핵 및 세포질 마커를 정량화하고 이러한 구획 사이에 마커 전위를 계산한다. 절차 96- 웰 포맷으로 간접 면역 형광에 의해 마커 검출 용 siRNA를 안정적인 방법을 사용하여 세포의 섭동 제공된다.

높은 콘텐츠, 오픈 소스 소프트웨어에 의해 지원되는 범용 현미경 데이터에서 형광 마커, 개별 셀 정량화를위한​​ 워크 플로우

간 셀룰러 통신은 내부와 세포 외부의 각종 생리 활성 조절에 중요​​하다. 이 논문은 단일 세포 분비물의 시공간적 특성을 측정하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이를 달성하기 위해, 종합 접근법 생균 이미징 감지 라벨없는 nanoplasmonic을 통합하는 데 사용된다.

단일 세포 분비물의 공간 - 시간 영상의 레이블이없는 기술

여기에서는 광친화성 라벨링을 사용하여 소분자 결합 단백질을 식별하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 장점은 살아있는 세포 환경 내에서 표적 단백질의 결합 및 공유 라벨링이 발생하여 세포 용해 시 네이티브 단백질 구조 및 결합 조건을 파괴할 위험을 제거한다는 것입니다.

라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

우리는 정확 하 게 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기에 인터페이스와 isobaric 라벨, 광범위 한 분류, 생물 정보학 도구, 그리고 품질 관리 단계에에서는 단백질을 quantitate 프로토콜을 제시.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

이 원고는 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 이 새로운 방법은 경쟁 바인딩 파트너와 함께 형성 된 복합물 뿐만 아니라 유엔 complexed 개별 단백질을 제외 하는 동안 특정 격리 및 어떤 두 상호 작용 단백질의 다운스트림 proteomic 특성화를 촉진 한다.

해 다중 단백질 신호 복합물 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 의해

여기, 선물이 단일 분자 수준에서 복잡 한 단백질 견본에서 각 단백질 종에 대 한 라벨 동질성을 평가 하는 프로토콜.

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

기재된 단백질 은 관심 있는 주어진 단백질및 무표지 질량 분석법의 면역친화성 농축을 사용하여 핵 세포 분획으로부터 단백질 상호작용 파트너를 식별하기 위한 프로테오믹스 워크플로우이다. 워크플로우에는 세포외 분획, 면역 침전, 필터 보조 시료 준비, 오프라인 정리, 질량 분석 법 및 다운스트림 생물 정보학 파이프라인이 포함됩니다.

대규모 핵 상호 작용 프로파일링을 위한 라벨 없는 면역 침전 질량 분광 워크플로우

여기서, 우리는 질량 분광계 기지를 둔 proteomics에 의하여 감염 도중 호스트와 병원체 사이 상호 작용을 프로파일기 위하여 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 단일 실험에서 호스트(예를 들어, 대식세포)와 병원체(예를 들어, Cryptococcus neoformans)의단백질 풍부도의 변화를 측정하기 위해 라벨이 없는 정량화를 사용합니다.

발견 중심의 숙주-병원균 상호 작용을 위한 라벨 프리 정량적 프로테오믹스 워크플로우

배우세요 세포 표면 단백질을 풍부하게 하고 질량 분석법으로 정량하는 방법을. 이 프로토콜은 종양 세포의 특이 항원을 식별하여 암 면역 치료 표적을 발굴하는 데 활용됩니다.

Cell Surface Proteome의 Label-free 정량화를 위한 "Cell Surface Capture" 워크플로우

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