단일 세포 분비물의 공간 - 시간 영상의 레이블이없는 기술

다음 실험의 전반적인 목표는 높은 시간적, 공간적 해상도로 개별 세포에서 단백질 분비를 측정하는 것입니다. 이는 단일 세포 분비물의 라벨 없는 이미징을 위해 유리 커버 슬립에 금 플라즈모닉 나노 센서를 석판화하여 달성됩니다. 두 번째 단계로, 센서 칩을 세척하고 자체 조립된 단층으로 코팅한 다음 분비된 분석물 단백질에 대한 친화력이 높은 리간드로 기능화합니다.

다음으로 세포는 공간과 시간에서 분비물을 측정하기 위해 기능화된 센서 칩에 통합됩니다. 결과는 개별 세포의 단백질 분비물을 라벨링할 필요 없이 공간적으로나 시간적으로 매핑할 수 있음을 보여줍니다. 이 방법은 부분비 및 자가분비 신호 전달 경로가 세포 운동성을 어떻게 제어하는지와 같은 세포 간 통신 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 절차를 시작하려면 전자빔 증착에 의해 이전에 청소된 커버 슬립에 10나노미터 크롬 박막을 증착하여 나노 구조의 패터닝 및 이미징 중 전하 효과를 방지합니다. 이 스핀 후, 에틸 락테이트, 메틸 메타 크릴 레이트 공중 합체로 구성된 이중층 레지스트의 첫 번째 층은 45 초 동안 2000 RPM에서 사용됩니다. 그런 다음 기판을 실온으로 식힌 후 섭씨 150도에서 기판을 굽습니다.

폴리메틸메타크릴레이트의 두 번째 층을 3000RPM에서 45초 동안 회전시키고 기판을 섭씨 150도에서 굽습니다. 이중층은 전자빔 리소그래피 또는 EBL을 사용하여 저항합니다. 이소프로필 알코올 또는 IPA 메틸 이소부틸 케톤 또는 MIBK를 2:1 비율로 개발하고 IPA로 헹굽니다.

CR 7 에칭을 사용하여 실온에서 10초 동안 습식 식각을 통해 나노 구조의 개발 영역에서 크롬을 제거한 다음 탈이온, 증류수로 헹구고 금 증착 후 전자빔 증발기를 사용하여 기판에 티타늄 금 필름을 증착합니다. 공중 합체 이중층을 들어 올립니다. 기판을 아세톤에 4시간 동안 담궈 저항하십시오.

다음으로, 주사전자현미경을 이용하여 기판을 검사하여 나노구조체의 형상과 크기를 확인한다. 생성된 나노 구조는 일반적으로 300나노미터의 피치로 분리됩니다. 20 x 20 어레이의 나노 구조는 중심에서 중심까지 30미크론의 간격을 두고 있습니다.

세포 이미징을 위한 충분한 공간을 남겨두고 일반적인 칩에는 300개의 어레이가 포함됩니다. 실온에서 60초 동안 CR 7 에칭을 사용하여 젖은 가장자리를 통해 기판에서 잔류 크롬을 제거합니다. 그런 다음 기질을 탈 이온수 증류수로 헹굽니다.

그런 다음 크기와 균일성을 검증하기 위해 원자력 현미경을 사용하여 어레이의 하위 집합을 검사합니다. 이 패턴이 있는 유리 커버 슬립은 국소 표면 플라즈마 및 공진 또는 LSPR 칩을 세척하고 재생하기 위해 적절한 세척 절차를 따르는 한 여러 번 사용할 수 있습니다. 300 밀리에서 40 와트의 출력으로 플라즈마 재를 45 초 동안 5 % 수소와 95 % 아르곤의 혼합물로 만듭니다.

플라즈마 애싱(plasma ashing) 직후 금 표면과 나노 구조를 기능화합니다. SPO와 SPC의 3:1 비율로 구성된 2액형 에탄올 티올 용액에 칩을 담그십시오. 칩을 티올 용액에 밤새 방치하여 자체 조립 단층을 형성한 후 에탄올로 헹구고 질소 가스로 건조시킨 후 칩을 알루미늄 바닥 조각에 놓아 맞춤형 미세유체 홀더 내에 LSPR 칩을 로드합니다.

그런 다음 이 바닥 조각과 실리콘 개스킷 사이에 칩을 끼우고 4개의 나사를 사용하여 어셈블리를 고정합니다. 일반적인 SPC 기반 티올 응용 분야의 경우, 133 밀리몰 EDC와 33 밀리몰 NHS의 일대일 혼합물을 300 마이크로리터의 탈이온수 증류수에 드롭 코팅하여 SPC 티올 성분의 카르복실기를 활성화합니다. 10분 동안 기다린 후, 10밀리몰 PBS로 표면을 수동으로 헹굽니다.이 리간드 용액을 300마이크로리터의 리간드와 접합하여 활성 카르복실기를

1 시간 동안 기다렸다가 10 밀리 몰 PBS 드롭 코드로 표면을 헹군 후, 비특이적 결합을 최소화하기 위해 PBS에 300 마이크로 리터의 0.1 몰 에탄올 아민을 칩에 헹굽니다. 10분 동안 기다린 후 20 또는 PBST 20 사이에 0.005%를 함유한 PBS로 에탄올아민을 세척합니다. 다음으로, 칩 위에 석영 조각을 놓아 반월판 변화와 관련된 데이터의 변동을 줄입니다.

현미경에 장착하는 동안 PBST 20 버퍼로 칩을 적신 상태로 유지하십시오. 미세유체 튜브를 어셈블리에 부착하고 정상 상태에 도달할 때까지 버퍼를 흐릅니다. 그런 다음 LSPR 칩 어셈블리를 가열된 스테이지 샘플 홀더에 단단히 놓습니다.

이 방법에 대한 광학 설정은 다음과 같습니다. 할로겐 램프의 빛은 593 나노미터 길이의 통과 필터를 통과하여 나노 플라즈몬 반응에 기여하지 않는 파장을 제거합니다. 그런 다음 빛은 선형 편광되고 샘플은 플라즈몬 금 나노 구조의 여기를 위해 40 x 1.4 개구수 대물렌즈를 통해 조명됩니다.

산란된 빛은 대물렌즈에 의해 수집되고 교차 편광자를 통과하여 유리 기판의 배경 신호를 줄입니다. 50 50 빔 스플리터는 동시 분광 및 이미지 분석을 위해 수집된 광 경로에 삽입됩니다. 어셈블리와 현미경이 최소 2시간 동안 평형을 이루도록 한 후 조이스틱을 사용하여 칩을 정렬하여 중앙 어레이가 분광학용 광섬유와 정렬되도록 합니다.

원심분리를 통해 하이브리드 DOMA 세포를 배양하고 펠릿화한 후 수확한 다음 LSPR 칩에 도입하기 전에 생존력을 테스트합니다. 그런 다음 마이크로 피펫을 사용하여 50마이크로리터의 셀 용액을 LSPR 칩에 수동으로 주입합니다. 마지막으로, 이미징을 위해 LSPR 칩을 준비하기 위해 미세유체 확산 시스템을 사용하여 새로운 무혈청 배지로 용액에 남아 있는 세포를 씻어냅니다.

정사각형 어레이를 강조하는 LSPR 이미징 이미지와 왼쪽 하단의 셀을 강조하는 투과광 조명 이미지의 오버레이가 여기에 표시되어 있습니다. 형광 염료 막대 Domine으로 염색된 세포인 DHPE는 연장과 같은 필로포디아를 나타냅니다. 이러한 확장이 어레이와 중복되는 경우, CMIC 기능화된 어레이에 antis cmic 항체의 포화 용액이 도입되기 전과 후의 단백질 분비 분광 데이터에 대해 위양성이 표시됩니다.

이 방법은 어레이를 보정하는 데 사용됩니다. 어레이의 보정은 센서의 반응을 정규화하고 각 실행의 생체 기능화 프로파일을 기반으로 분수 점유를 결정하는 데 도움이 됩니다. 상용 SPR 기기는 해리 상수를 결정하고 LSPR 칩에 대해 설명된 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 비특이적 결합에 대한 저항을 연구하는 데 사용됩니다.

두 배열의 정규화된 값이 여기에 표시됩니다. 하나의 어레이는 셀에서 10마이크로미터 이내에 있었고 대조군은 셀에서 130마이크로미터 이내에 있었습니다. 대조군 어레이의 평탄한 반응에 비해 세포에 가장 가까운 어레이의 정규화된 반응의 갑작스러운 증가는 분비된 항체의 국부적인 폭발을 나타냅니다.

이 비디오를 시청한 후에는 높은 공간 및 시간 해상도로 개별 세포의 단백질 분비물을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.