커뮤니티 표현형을 조사하기 위한 낭포성 섬유증 관련 다미생물 생물막 성장

우리는 미생물이 실제 생활 조건을 모방한 조건에서 자랄 때 어떻게 행동하는지 이해하려고 노력하고 있으며, 단일 재배 성장과 비교하여 다종 군집에서 표현형 변화를 주도하는 메커니즘을 결정하는 것을 목표로 합니다. 이 in vitro 시스템의 활용을 통해 우리는 낭포성 섬유증 기도 감염의 맥락에서 악명 높은 병원체인 녹농균의 난치성을 유발하는 분자 경로를 특성화했습니다. 96웰 플레이트 형태와 낭포성 섬유증 폐에서 관찰된 것을 반영하는 성장 조건으로 인해 광범위한 마이크로바이옴 상호 작용을 쉽게 탐색할 수 있습니다.

우리는 완전한 마이크로바이옴 맥락에서 미생물이 항균제에 대한 감수성을 변경하는 메커니즘에 대한 통찰력을 얻었습니다. 당사의 모델은 낭포성 섬유증 연구에서 임상 관찰과 개별 실험실 작업 사이의 다리 역할을 하며, 다양한 마이크로바이옴 상호 작용을 연구하기 위한 귀중한 도구를 제공합니다. 시작하려면 필요한 모든 시약과 배지를 준비합니다.

공동 배양 실험의 경우 박테리아 야간 배양액을 원심분리하고 멸균 PBS로 세포를 세척합니다. 원심분리 후 상층액을 조심스럽게 버리고 각 펠릿을 1X 물에 희석된 인공 가래 배지 또는 ASM 베이스 1밀리리터에 재현탁시킵니다. 1 - 10개의 희석된 샘플의 광학 밀도를 600 나노미터에서 분광 광도계 또는 플레이트 리더에서 측정합니다.

각 박테리아 샘플을 0.01의 600나노미터에서 최종 광학 밀도로 희석하고 5초 동안 소용돌이를 완전히 제거합니다. 100 마이크로리터의 단일 배양 및 공동 배양 현탁액을 멸균 플라스틱 평면 바닥 96웰 플레이트의 3개의 개별 웰에 추가하고 무산소 조건에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 다중 채널 피펫을 사용하여 부착되지 않은 플랑크톤 세포를 제거하고 100마이크로리터의 신선한 ASM 또는 원하는 처리 시약으로 미리 형성된 생물막을 보충합니다.

플랑크톤 세포를 흡인한 후 125마이크로리터의 멸균 PBS로 생물막을 두 번 부드럽게 세척하고 세척 용액을 버립니다. 50마이크로리터의 멸균 PBS를 추가합니다. 그리고 96핀 리플리케이터를 사용하여 플레이트에서 셀을 부드럽게 긁어냈습니다.

재현탁된 생물막 세포를 새로운 멸균 96웰 플레이트의 A열로 옮기고 10X 연속 희석을 수행합니다. 각 희석 샘플의 3-5 마이크로리터를 한천 플레이트에 플레이트합니다. 접종 부위가 건조된 후 플레이트를 적절하게 배양합니다.

단일 배양과 비교하여 혼합 플랑크톤 군집에서 성장할 때 생존 가능한 Pseudomonas aeruginosa 및 Staphylococcus aureus 세포 수의 감소를 포함하여 여러 표현형이 관찰되었습니다. 연쇄상구균 상귀니스(Streptococcus sanguinis)의 다미생물 성장의 증가와 프레보텔라 멜라니노제니카(Prevotella melaninogenica)의 혼합 군집 성장이 관찰되었습니다.