Name: 단백질 관련 신생 DNA 농축 및 시퀀싱을 통한 DNA 복제 가닥 단백질의 가닥 특이적 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 배우세요 eSPAN 기법을 활용한 DNA 복제 연계 부모 히스톤 재활용 메커니즘 분석 방법입니다. 효모와 마우스 배아 줄기세포에서 후성유전적 정보 전달 과정을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 국립보건원(NIH)의 R35GM118015(Z.Z.), R01GM130588(C.Y.), 그리고 Hormel Startup Fund(C.Y.)의 지원을 받았습니다.

<ol><li>Bell, S. P., Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-dependent+recognition+of+eukaryotic+origins+of+DNA+replication+by+a+multiprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex.</a> Nature. 357 (6374), 128-134 (1992).</li>
<li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (6), 360-374 (2015).</li>
<li>Burgers, P. M. J., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+DNA+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic DNA replication fork.</a> Annu Rev Biochem. 86, 417-438 (2017).</li>
<li>Pursell, Z. F., Isoz, I., Lundstrom, E. B., Johansson, E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+DNA+polymerase+epsilon+participates+in+leading-strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast DNA polymerase epsilon participates in leading-strand DNA replication.</a> Science. 317 (5834), 127-130 (2007).</li>
<li>Nick Mcelhinny, S. A., Gordenin, D. A., Stith, C. M., Burgers, P. M., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor+at+the+eukaryotic+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Division of labor at the eukaryotic replication fork.</a> Mol Cell. 30 (2), 137-144 (2008).</li>
<li>Daigaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+profile+of+replicative+polymerase+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A global profile of replicative polymerase usage.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 192-198 (2015).</li>
<li>Koyanagi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+replicative+DNA+polymerase+usage+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Global landscape of replicative DNA polymerase usage in the human genome.</a> Nat Commun. 13 (1), 7221(2022).</li>
<li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 185-191 (2015).</li>
<li>Reijns, M. aM., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lagging-strand+replication+shapes+the+mutational+landscape+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lagging-strand replication shapes the mutational landscape of the genome.</a> Nature. 518 (7540), 502-506 (2015).</li>
<li>Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribose-seq%3A+Global+mapping+of+ribonucleotides+embedded+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ribose-seq: Global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA.</a> Nat Methods. 12 (3), 253 p following 257 251-257 (2015).</li>
<li>Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+at+the+replication+fork+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes.</a> Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).</li>
<li>Zhou, Z. X., Lujan, S. A., Burkholder, A. B., Garbacz, M. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+DNA+polymerase+delta+in+initiating+and+terminating+leading+strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Roles for DNA polymerase delta in initiating and terminating leading strand DNA replication.</a> Nat Commun. 10 (1), 3992(2019).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+analysis+shows+protein+binding+at+replication+forks+and+PCNA+unloading+from+lagging+strands+when+forks+stall%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Strand-specific analysis shows protein binding at replication forks and PCNA unloading from lagging strands when forks stall.</a> Mol Cell. 56 (4), 551-563 (2014).</li>
<li>Gan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mcm2-ctf4-polalpha+axis+facilitates+parental+histone+h3-h4+transfer+to+lagging+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mcm2-ctf4-polalpha axis facilitates parental histone h3-h4 transfer to lagging strands.</a> Mol Cell. 72 (1), 140-151.e3 (2018).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+preventing+asymmetric+histone+segregation+onto+replicating+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mechanism for preventing asymmetric histone segregation onto replicating DNA strands.</a> Science. 361 (6409), 1386-1389 (2018).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm2+promotes+symmetric+inheritance+of+modified+histones+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mcm2 promotes symmetric inheritance of modified histones during DNA replication.</a> Science. 361 (6409), 1389-1392 (2018).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+alpha+interacts+with+H3-H4+and+facilitates+the+transfer+of+parental+histones+to+lagging+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase alpha interacts with H3-H4 and facilitates the transfer of parental histones to lagging strands.</a> Sci Adv. 6 (35), eabb5820(2020).</li>
<li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde%3A+Evidence+that+histone+h4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: Evidence that histone h4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cut%26tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cut&tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nat Commun. 10 (1), 1930(1930).</li>
<li>Lengronne, A., Pasero, P., Bensimon, A., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+S+phase+progression+globally+and+locally+using+brdu+incorporation+in+tk%28%2B%29+yeast+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring S phase progression globally and locally using brdu incorporation in tk(+) yeast strains.</a> Nucleic Acids Res. 29 (7), 1433-1442 (2001).</li>
<li>Viggiani, C. J., Aparicio, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+vectors+for+simplified+construction+of+brdu-incorporating+strains+of+saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">New vectors for simplified construction of brdu-incorporating strains of saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (14-15), 1045-1051 (2006).</li>
<li>Yu, C., Gan, H., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+analysis+of+DNA+synthesis+and+proteins+association+with+DNA+replication+forks+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Strand-specific analysis of DNA synthesis and proteins association with DNA replication forks in budding yeast.</a> Methods Mol Biol. 1672, 227-238 (2018).</li>
<li>Li, Z., Hua, X., Serra-Cardona, A., Xu, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+strand-specific+profiling+of+replicating+chromatin+with+enrichment+and+sequencing+of+protein-associated+nascent+DNA+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient and strand-specific profiling of replicating chromatin with enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA in mammalian cells.</a> Nat Protoc. 16 (5), 2698-2721 (2021).</li>
<li>Rosebrock, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+budding+yeast+cell+cycle+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of the budding yeast cell cycle by flow cytometry.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017 (1), (2017).</li>
<li>Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. P., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+nucleosome+positions+in+yeast+at+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution.</a> Nature. 486 (7404), 496-501 (2012).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+landscape+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Replication landscape of the human genome.</a> Nat Commun. 7, 10208(2016).</li>
<li>Foltman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+replisome+components+cooperate+to+process+histones+during+chromosome+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic replisome components cooperate to process histones during chromosome replication.</a> Cell Rep. 3 (3), 892-904 (2013).</li>
<li>Jia, J., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+MCM2-7+helicase+subunit+MCM2+in+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The role of the MCM2-7 helicase subunit MCM2 in epigenetic inheritance.</a> Biology (Basel). 13 (8), 572(2024).</li>
<li>Alabert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+chromatin+capture+proteomics+determines+chromatin+dynamics+during+DNA+replication+and+identifies+unknown+fork+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nascent chromatin capture proteomics determines chromatin dynamics during DNA replication and identifies unknown fork components.</a> Nat Cell Biol. 16 (3), 281-293 (2014).</li>
<li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+dynamics+at+active%2C+stalled%2C+and+collapsed+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25 (12), 1320-1327 (2011).</li>
<li>Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2d+gel+electrophoresis+to+detect+DNA+replication+and+recombination+intermediates+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">2d gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast.</a> Methods Mol Biol. 2119, 43-59 (2020).</li>
<li>Ramachandran, S., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mince-seq%3A+Mapping+in+vivo+nascent+chromatin+with+edu+and+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mince-seq: Mapping in vivo nascent chromatin with edu and sequencing.</a> Methods Mol Biol. 1832, 159-168 (2018).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+and+sister+chromatid-resolved+profiling+of+protein+occupancy+in+replicated+chromatin+with+CHOR-seq+and+SCAR-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide and sister chromatid-resolved profiling of protein occupancy in replicated chromatin with CHOR-seq and SCAR-seq.</a> Nat Protoc. 16 (9), 4446-4493 (2021).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nanogram-range+immunoprecipitated+DNA+in+chip-seq+application%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Purification of nanogram-range immunoprecipitated DNA in chip-seq application.</a> BMC Genomics. 18 (1), 985(2017).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+parental+h3k9me3+in+s+phase+silences+l1+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of parental h3k9me3 in s phase silences l1 elements.</a> Nature. 623 (7987), 643-651 (2023).</li>
<li>Kanev, P. B., Atemin, A., Stoynov, S., Aleksandrov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parp1+roles+in+DNA+repair+and+DNA+replication%3A+The+basi%28c%29s+of+parp+inhibitor+efficacy+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Parp1 roles in DNA repair and DNA replication: The basi(c)s of parp inhibitor efficacy and resistance.</a> Semin Oncol. 51 (1-2), 2-18 (2023).</li>
<li>Hanzlikova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+poly%28adp-ribose%29+polymerase+as+a+sensor+of+unligated+Okazaki+fragments+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The importance of poly(adp-ribose) polymerase as a sensor of unligated Okazaki fragments during DNA replication.</a> Mol Cell. 71 (2), 319-331.e3 (2018).</li>
</ol>

저자들은 공개할 것이 없습니다.

선행 및 지연 복제 가닥과 관련된 단백질 검출은 염색질 복제 메커니즘과 관련 과정을 이해하는 데 중요하며, 이는 인간 암 연구와 약물 내성 메커니즘에 직접적으로 관련이 있습니다. 2D 겔, 천연 크로마틴 면역침전(nChIP), iPOND, 신생 염색질 캡처 29,30,31과 같은 여러 방법이 DNA 복제와 DNA 수리와 같은 관련 과정을 연구하는 데 사용되었습니다. 또한, 신생 염색질의 생체 내 지도화를 위한 방법들, 예를 들어 MINCE-Seq(EdU 및 시퀀싱을 이용한 생체 신생 염색질 매핑)32, CHOR-seq(복제 후 염색질 점유)33와 같은 방법들이 DNA 복제 과정에서 히스톤 및 기타 염색질 결합 단백질의 역학을 연구하기 위해 개발되었...

진핵생물에서는 복제 기원이라 불리는 여러 부위에서 게놈 중복이 시작되며, 여기서 기원 인식 복합체(ORC)가 결합하여 CMG 헬리케이스를 포함한 모집 단백질 기구를 활성화하여 DNA 복제를시작합니다. 각 복제 원점의 리플리솜 기계는 양방향으로 움직이는 두 개의 복제 포크를 형성한다 2,3. 쌍복제 포크는 선행 가닥의 연속 합성과 지연 가닥의 불연속 합성을 통해 DNA의 두 모 가닥을 복제합니다. 각 복제 포크의 비대칭성 때문에, 선행 및 뒤진 가닥에 있는 DNA 중합효소를 포함한 복제 구성 요소는 다릅니다. 돌연변이 DNA 중합효소를 기반으로 한 이전 유전적 분석에 따르면, DNA Pol ε와 DNA Pol δ가 각각 주도가닥 복제와 지연 가닥 복제를 담당하는 주요 중합효소임이 입증되었습니다. DNA 중합효소의 가닥 선호도를 감지하기 위해 Pu-seq 6,7, HydEn-seq8, emRiboSeq 또는 RiboSeq 9,10 등 여러 방법이 개발되었습니다. 이러한 가닥 특이성 해부법은 DNA 중합효소에 한정되며, 각 단백질 4,5,11,12에 돌연변이를 도입해야 합니다. 표적 단백질과 선행 및 지연 가닥의 DNA 복제 포크 연관성을 추적하는 것은 DNA 복제에 대한 귀중한 통찰을 제공할 것입니다. 이 과정에서 우리는 먼저 효모 세포에서 eSPAN 기법(단백질 관련 신생 DNA의 농축 및 시퀀싱, 그림 1)을 개발했습니다. 원리 증명 연구로서 우리는 먼저 폴 δ와 폴 δ가 각각 선행 가닥과 뒤진 가닥에서 풍부함을 보였다. 또한 복제 DNA 헬리케이스, 단일 가닥 DNA 결합 단백질(복제 단백질 A), 증식 세포 핵항원(PCNA) 램프 및 그 로더 복제 인자 C(RFC)를 포함한 주요 DNA 복제 구성 요소들의 가닥 선호도를 밝혀냈다13. 중요하게도, 저희와 다른 연구자들은 이 방법을 통해 40년 넘게 해결하기 어려운 부모 히스톤 전달 메커니즘을 밝혀냈습니다.
eSPAN 방법은 두 단계로 구성되어 있습니다: ChIP18 또는 CUT&Tag19에 의한 표적 단백질의 농축과 BrdU 면역침전으로 단백질과 관련된 초기 DNA의 농축입니다. 표준 효모 균주(W303 또는 S288C)에서는 세포외 BrdU 또는 EdU가 세포에 들어가 염색체에 통합될 수 없습니다. 이 균주들은 티미딘 흡수를 위한 적절한 뉴클레오사이드 수송체와 티미딘을 TMP로 인산화하는 데 필요한 티미딘 키나아제가 부족하며, 이는 BrdU(또는 EdU)를 BrdUMP(EdUMP)로 전환시킵니다. 인간 평형 뉴클레오사이드 수송체 1(hENT1)과 단순포진 바이러스 티미딘 키나제(HSV-TK)의 발현은 티미딘 흡수와 BrdU(또는 EdU)의 BrdUMP(EdUMP)로 전환을 촉진합니다20. 따라서 효모에서 eSPAN 실험을 수행하기 위해서는 균주를 BrdU-Incorporating (BrdU-Inc) 구조(HSV-TK 및 hENT1)13,21로 삽입해야 했다.
이전에는 효모22의 DNA 복제 단백질을 위한 eSPAN 프로토콜을 제공했습니다. 최근에는 CUT&Tag 방법을 포유류 세포의 eSPAN 프로토콜에 통합하여 가교 결합, 염색질 전단, 시작 세포 수17,23 최소화 등 최적화가 필요한 기술적으로 어려운 단계를 해결했습니다. 여기서는 효모 세포를 이용한 시각화를 위한 히스톤 eSPAN(그림 2)을 제공했습니다. 이 방법은 주로 복제 DNA 가닥에서 변형된 형태의 히스톤 분포를 분석하는 데 사용됩니다. 여러 히스톤 표식을 시험하는 동안, 부모 히스톤 H3에 있는 H3K4me3를 예로 들었습니다. 복제 포크에서 DNA 수리에 관여하는 플리플리오스 구성 요소와 인자를 분석하기 위해, 저희는 첫 번째 논문22에서 설명한 대로 초음파 검사를 이용해 크로마틴을 작은 조각으로 전단할 것을 권장합니다. 포유류 세포의 경우, 효모23에서 설명한 ChIP 단계를 대체하기 위해 수정된 Cut&Tag 절차를 채택했습니다. 이 변형은 출발물질(세포)의 양을 줄이고, 무엇보다도 단일 가닥 DNA 준비 키트를 사용하지 않고도 시퀀싱을 위한 eSPAN 라이브러리 생성이 가능해집니다. 효모 프로토콜에서는 시작 물질의 양이 충분했기 때문에 Cut&Tag 방법을 사용하지 않았습니다. 더 중요한 것은, Cut&Tag 절차가 우리 손의 효모세포에 대해 일관되게 효과적이지 않다는 사실을 발견했다는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL DNA 저결합 튜브 &nbsp;</td><td>에펜도르프</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>10배 앰플리게이제 버퍼</td><td>루시겐</td><td>A1905B</td><td></td></tr><tr><td>10배 PBS&nbsp;</td><td>코닝</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10배 TBS</td><td>바이오래드</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>16 G x 1-1/2인치. BD 프리시전글라이드 바늘</td><td>BD 생명과학</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>ACCEL-NGS 1S 플러스 DNA 라이브러리 키트</td><td>통합 DNA 기술</td><td>10009817</td><td>ssDNA 및 저입력 DNA 라이브러리 준비 키트 &nbsp;</td></tr><tr><td>애질런트 2100 바이오분석기&nbsp;</td><td>애질런트</td><td>2100 생물분석</td><td></td></tr><tr><td>애질런트 DNA 1000 키트 &nbsp;</td><td>애질런트</td><td>5607-1504</td><td></td></tr><tr><td>앰리가이제&nbsp;</td><td>루시겐</td><td>A0110K</td><td>파라포름알데히드는 조심해서 다루세요. 가연성 고체이고 위험합니다.</td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>벡맨</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP SPRI 시약</td><td>벡먼 쿨터</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>항-BrdU 항체&nbsp;</td><td>BD 생명과학</td><td>555627</td><td></td></tr><tr><td>항-H3K4me3 항체&nbsp;</td><td>ABCAM</td><td>AB8580</td><td></td></tr><tr><td>자동 셀 카운터&nbsp;, 모델 TC10</td><td>바이오래드</td><td>145-0001</td><td></td></tr><tr><td>바치트라신&nbsp;</td><td>시그마</td><td>11702</td><td></td></tr><tr><td>박토 펩톤 &nbsp;</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>211830</td><td></td></tr><tr><td>벤자미딘 하이드로클로라이드&nbsp;</td><td>시그마</td><td>B2417</td><td>가연성 고형물</td></tr><tr><td>BrdU&nbsp;</td><td>시그마</td><td>B5002</td><td>BrdU는 잠재적인 돌연변이 유발 물질이자 기형유발 물질이므로 조심해서 다루세요.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>시그마</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터 &nbsp;</td><td>서모 피셔 사이언티픽 &nbsp; 모델 포르마 시리즈 II 워터 재킷 CO2 인큐베이터</td><td>3140</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 배양지&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포주 ES-E14&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chelex-100&nbsp;</td><td>바이오래드</td><td>1422842</td><td>200&ndash; 400 드라이 메쉬 사이즈</td></tr><tr><td>클로로포름 &nbsp;</td><td>시그마</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>콘카나발린 A(ConA) 코팅된 자기 구슬 &nbsp;</td><td>폴리이언스</td><td>86057-10</td><td></td></tr><tr><td>디지토닌</td><td>밀리포어</td><td>300410-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>대장균과 nbsp; tRNA&nbsp;</td><td>시그마</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>에탄올&nbsp;</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>BP2818100</td><td>에탄올은 가연성이니 조심해서 다루세요</td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤 &nbsp;</td><td>시그마</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>시그마</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>시그마</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올&nbsp;</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>BP26324</td><td>이소프로포놀은 조심해서 다루세요, 인화성 물질이니까요</td></tr><tr><td>KAPA 하이파이 핫스타트 레디 믹스</td><td>로슈</td><td>7958889001</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>코</td><td>시그마</td><td>221473</td><td>KOH는 조심해서 다루세요, 부식성이 있습니다</td></tr><tr><td>저속 진공</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>자석 스탠드&nbsp;</td><td>밀리포어</td><td>LSKMAGS08</td><td></td></tr><tr><td>마스터사이클러 그라디언트 PCR 열 사이클러</td><td>에펜도르프</td><td>5331</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>시그마</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>미세세포 뉴클레아제&nbsp; (MNase)</td><td>워딩턴</td><td>LS004798</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR 정제 키트 &nbsp;</td><td>치아겐</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>미니 비즈 비터</td><td>미니 비드비터 24 디스럽터</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>소형 원심분리기;</td><td>에펜도르프</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>시그마</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>멀티플랫폼 셰이커</td><td>피셔브랜드</td><td>02-217-765</td><td></td></tr><tr><td>멀티플랫폼 셰이커 인큐베이터</td><td>벤치마크</td><td>인쿠-셰이커 10L</td><td></td></tr><tr><td>멀티서열 히트 블록 &nbsp;</td><td>에펜도르프</td><td>써모믹서 C</td><td></td></tr><tr><td>N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-3-아미노프로판설폰산과 nbsp; (톡톡 두드리는 소리)</td><td>시그마</td><td>T5130</td><td>200&ndash; 400 드라이 메쉬 사이즈</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>시그마</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>시그마</td><td>S8045</td><td>NaOH는 조심해서 다루세요, 부식성이 있습니다</td></tr><tr><td>NEBNext HiFi 2&times; PCR 마스터 믹스</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 이게팔 CA-630</td><td>써모 사이언티픽</td><td>J61055. AP</td><td></td></tr><tr><td>파라포말드하이드</td><td>시그마</td><td>158127</td><td>파라포름알데히드는 조심해서 다루세요. 가연성 고체이고 위험합니다.</td></tr><tr><td>pA-Tn5 효소&nbsp;</td><td>애드진</td><td>121137</td><td></td></tr><tr><td>페파블록</td><td>시그마</td><td>11429868001</td><td></td></tr><tr><td>페놀-클로로포름-이소아밀 알코올 & nbsp;</td><td>인비트로젠</td><td>15593049</td><td></td></tr><tr><td>피펫 P1000, P200, P20 및 P2</td><td>에펜도르프</td><td>2231300004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>시그마</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 정제</td><td>시그마</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 정제 &nbsp;</td><td>시그마</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>단백질 G-세파로스 비즈와 nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-0618-02</td><td></td></tr><tr><td>단백질 침전 용액</td><td>치아겐</td><td>848023</td><td></td></tr><tr><td>단백질 침전 용액</td><td>치아겐</td><td>848023</td><td>KOH는 조심해서 다루세요, 부식성이 있습니다</td></tr><tr><td>단백질 침전 용액 &nbsp;</td><td>치아겐</td><td>848023</td><td></td></tr><tr><td>단백질분해효소 K&nbsp;</td><td>시그마</td><td>311584401</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트 &nbsp;</td><td>치아겐</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>시그마</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>시그마</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>분광광도계&nbsp;</td><td>열과학.</td><td>2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>스퍼미딘&nbsp;</td><td>시그마</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 폴</td><td>뉴잉글랜드 생물연구소, 그리고 nbsp;</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기 &nbsp;</td><td>벡먼 쿨터</td><td>알레그라 X-5</td><td></td></tr><tr><td>트리스&nbsp;</td><td>시그마</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100&nbsp;</td><td>시그마</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물&nbsp;</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>212730</td><td></td></tr></tbody></table>

단백질 관련 신생 dna 농축 및 시퀀싱을 통한 dna 복제 가닥 단백질의 가닥 특이적 분석

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

게놈 중복은 헬리케이스를 포함한 플리솜 단백질에 의해 조율되며, 이들은 이중 가닥 DNA를 개별 반평행 단일 가닥으로 풀어내며, 각 복제는 연속(선도)과 비연속(지연) 복제 방식을 요구합니다. 생 체 내에서 크로마틴 연관 단백질과 복제 DNA 가닥의 상호작용을 이해하는 것은 DNA 복제와 연관된 크로마틴 조립 및 DNA 복구 메커니즘을 밝히는 데 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 복제 포크에서 초기 선행 및 지연 DNA 가닥의 상대적 단백질 수준을 정량하기 위해 고안된 단백질 관련 신생 DNA 농축 및 시퀀싱(eSPAN) 방법을 제시합니다. eSPAN 절차는 염색질 면역침전(효모 내 ChIP) 또는 포유류 세포에서 표적 및 태그먼트 하에서 절단(CUT&Tag; 포유류 세포에서)으로 시작되며, 이어서 단백질 관련 초기 DNA를 브로모데옥시우리딘(BrdU) 면역침전으로 풍부하게 만듭니다. 가닥 특이적 차세대 시퀀싱은 분리된 ssDNA에 적용됩니다. 이 기술은 단백질이 선행 복제 포크에서 농축되어 있는지 또는 지연 복제 포크에서 농축되어 있는지 판단하는 데 사용될 수 있습니다. eSPAN은 복제 포크에서 히스톤을 포함한 염색마틴 관련 단백질의 유전체 가닥 선호도를 제공합니다.

eSPAN은 히스톤 및 히스톤 변형과 같은 표적 단백질에 관한 가닥 특이적 정보를 얻는 데 활용될 수 있습니다. 이 대표적인 결과에서는 표본 채취와 eSPAN 공정이 그림 2에 제시된 도식에 따라 출아 효모 시스템을 사용하여 수행되었습니다. 샘플 처리 및 채취는 하이드록시우레아 처리 초기 S상 조건을 따릅니다. 두 가지 효모 균주인 WT(야생형)와 mcm2-3A 돌연변이체가 사용되었다. DNA 헬리케이스 소단위체 MCM2는 부모 히스톤 H3-H4 샤페론 역할을 하는 반면, 3개의 아미노산 돌연변이를 포함하는 mcm2-3A 돌연변이는 부모 히스톤 H3-H414,27에 결합하는 능력이 없습니다. 그림 3A는 일정한 길이의 배수를 가진 DNA 조각을 보여주며, 준비된 시퀀싱 라이브러리를 위해 ...

단백질 관련 신생 DNA의 풍부화 및 시퀀싱(eSPAN)은 두 개의 복제 DNA 가닥에서 염색질 관련 단백질의 상대적 풍부도를 검출하기 위해 개발되었으며, 이를 통해 염색질 복제와 그 결합 과정에 대한 분자적 통찰을 밝혀냈습니다. 이 프로토콜은 효모 및 마우스 배아 줄기(ES) 세포에서의 eSPAN 절차를 설명합니다.

단백질 관련 신생 DNA 농축 및 시퀀싱을 통한 DNA 복제 가닥 단백질의 가닥 특이적 분석

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single ...

strand-specific-analysis-proteins-at-replicating-dna-strands

Research

연구

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Fast Protein 액체 크로마토그래피 시스템을 사용한 6X-His-Tagged 단백질의 친화성 정제 

여기에서는 2차원 겔 전기영동을 사용하여 병원성, 구조가 발생하기 쉬운 반복을 통한 복제 진행을 분석하는 절차를 간략하게 설명합니다.

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배우세요 eSPAN 기법을 활용한 DNA 복제 연계 부모 히스톤 재활용 메커니즘 분석 방법입니다. 효모와 마우스 배아 줄기세포에서 후성유전적 정보 전달 과정을 연구하는 데 활용됩니다.

단백질 관련 신생 DNA 농축 및 시퀀싱을 통한 DNA 복제 가닥 단백질의 가닥 특이적 분석

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