허혈성 뇌졸중의 쥐 모델에서 면역형광에 의한 세포 사멸 신호 평가

허혈성 뇌졸중은 전 세계적으로 사망 및 장애의 주요 원인입니다. 우리의 연구는 뇌졸중에 대한 약물 표적에 중점을 두고 있습니다. 우리는 RUNX1 및 카텝신과 같은 몇 가지 새로운 표적에 관심이 있습니다. 이러한 표적을 평가하기 위해 중대뇌동맥을 폐색하여 허혈성 뇌졸중의 쥐 모델을 개발했습니다.

우리는 중대뇌동맥을 폐색하기 위해 필라멘트를 삽입하여 쥐의 허혈성 뇌졸중을 모델링합니다. 중대뇌동맥 폐색 모델은 TTC, 면역형광 및 TUNEL 염색과 같은 다른 기술과 결합된 전임상 뇌졸중 연구에 가장 일반적으로 사용되는 설치류 모델입니다. 우리는 통합적인 접근 방식으로 뇌졸중의 병태생리학을 탐구할 수 있습니다. 면역형광에는 항체의 특이성, 형광 배경 최소화, 형광 표지 및 특이적 항체의 특성을 활용하여 신호 대 잡음비를 최적화하는 등 몇 가지 기술적 과제가 있습니다. 면역형광을 통해 세포 구조의 복잡한 풍경과 중대뇌동맥 폐색 모델과의 분자 상호 작용을 이해할 수 있습니다.

많은 뇌 조직은 뇌졸중의 적절한 시간 범위로 잠재적으로 구제할 수 있습니다. 우리의 결과는 카텝신 B의 발현이 중대뇌 동맥 폐색 후 쥐 뇌의 수에서 활성화된다는 것을 보여줍니다. 그것은 증가된 세포사멸을 동반합니다. 세포 사멸 신호의 기본 메커니즘에 대한 추가 연구는 약물에 대한 새로운 표적을 사용할 수 있습니다.

향후 연구에서 우리는 염증 경로 및 세포 사멸 신호 전달의 잠재적인 분자 표적을 계속 탐색할 것입니다. 실험 연구를 통해 발견된 이러한 표적 중 일부가 임상 치료로 전환되어 뇌졸중 환자의 생존율과 삶의 질을 향상시킬 수 있기를 바랍니다.

[해설자] 시작하려면 마취된 쥐를 바로 누운 자세로 놓고 조절된 열 매트와 직장 온도 모니터 프로브를 사용하여 체온을 36.5°C로 유지합니다. 목의 피부를 면도하고 요오도포 소독액을 사용하여 소독하십시오. 그런 다음 목에 2cm 정중선을 절개하고 연조직을 후퇴시켜 경동맥 혈관을 노출시킵니다. 겸자를 사용하여 우측 총경동맥(CCA), 외경동맥(ECA) 및 내경동맥(ICA)을 분리합니다. 봉합사를 사용하여 근위 오른쪽 CCA를 결찰합니다. 그런 다음 마이크로클립으로 오른쪽 ICA와 ECA를 원점에 고정합니다. 둥근 실리콘 팁으로 코팅된 나일론 모노필라멘트를 작은 절개를 통해 CCA의 내강에 삽입하고 CCA에 매듭을 묶어 모노필라멘트의 출혈 및 이탈을 방지합니다. 오른쪽 ICA 마이크로클립을 열고 실리콘 팁이 MCA의 기원을 막을 때까지 ICA 그루터기를 통해 모노필라멘트를 오른쪽 중대뇌동맥(MCA)에 삽입합니다. 나일론 모노필라멘트의 노출된 부분을 잘라내고 정중선 목 절개를 봉합합니다. MCA 폐색 2시간 후 목 절개 부위를 열고 CCA의 매듭을 풉니다. 그런 다음 나일론 모노필라멘트를 빼내어 MCA를 재관류합니다. 수술 후, 온도 조절 가열 매트로 유지되는 가열 케이지에서 마취에서 회복되는 동안 쥐를 관찰합니다. Zaya Long Behavioral Rating Scale을 사용하여 중대뇌동맥 폐색 또는 MCAO 후 2시간 및 재관류 후 22시간에 신경학적 기능을 평가합니다. MCAO 모델 쥐로부터 전체 뇌를 분리한 후 뇌를 -20°C에서 20분 동안 동결합니다. 냉동 뇌를 슬라이스 사이에 2mm 거리를 두고 6개의 관상 슬라이스로 자릅니다. 어두운 곳에서 37°C에서 15분 동안 2% TTC로 슬라이스를 염색합니다. 그런 다음 뇌 조각을 4% 파라포름알데히드로 실온에서 24시간 동안 고정합니다. 클로즈업 물체에 대해 자동 모드로 설정된 디지털 카메라를 사용하여 얼룩진 조각을 촬영합니다. 이미지를 컴퓨터로 전송하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 경색 크기를 측정합니다. 경색 크기를 6개 슬라이스 모두의 경색 면적의 합과 동일한 슬라이스의 전체 뇌 면적의 합의 비율로 계산합니다. MCAO 그룹에서는 상당한 경색 부위가 관찰되었으며 가짜 그룹에서는 경색이 없었습니다. 면역형광 분석을 위해 MCAO 모델 쥐의 온전한 뇌를 4% 파라포름알데히드에 24시간 동안 고정합니다. 그런 다음 10%, 15% 및 30% 농도, 10%, 15% 및 30% 농도의 일련의 자당 용액 구배로 뇌를 탈수하고 조직이 가라앉을 때까지 계속합니다. 탈수된 뇌를 최적의 절단 온도 컴파운드에 삽입하고 기포를 제거합니다. 액체 질소에서 뇌를 스냅 얼립니다. 극저온 조절기에서 뇌를 5μm 두께로 절편합니다. 냉동된 뇌 절편을 실온에서 평형을 취한 후 멸균 PBS로 각각 5분 동안 3회 세척합니다. 단백질분해효소 K mL당 20μg 및 0.3% Triton X-100과 실온에서 10분 동안 배양하기 전에 면역조직화학 펜으로 조직의 윤곽을 그립니다. PBS로 절편을 세척한 후 윤곽선이 있는 조직에 3% BSA를 도포하고 실온에서 1시간 동안 배양하여 차단합니다. 차단 용액을 적절한 1차 항체로 교체하고 절편을 4°C의 어두운 곳에서 밤새 배양합니다. 다음날, 0.1% Tween-20을 함유한 멸균 PBS로 각각 5분 동안 절편을 세 번 세척합니다. 필요한 형광단에 접합된 적절한 2차 항체를 추가하고 절편을 가습 챔버에서 1시간 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다. Tween-20을 함유한 PBS로 절편을 세척한 후 DAPPI를 함유한 마운팅 매체로 염색하고 커버 슬립으로 덮습니다. 형광 현미경에서 여기 파장을 488nm, 방출 파장을 520nm, 노출 시간을 500ms로 설정하여 염색된 뇌 절편을 캡처합니다.연령대. 카텝신 B 면역반응성은 가짜 그룹에 비해 MCAO 그룹의 허혈 코어에서 유의하게 증가했습니다. Cathepsin B 면역반응성은 가짜 그룹에 비해 MCAO 그룹의 반음영 피질에서 유의하게 상승했습니다. 허혈성 코어와 반음영 피질 사이에서 카텝신 B 면역반응성의 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다. 시작하려면 MCAO 모델 쥐의 파라포름알데히드 고정 뇌 절편을 각각 35-50분 동안 에탄올 농도를 증가시키면서 탈수합니다. 그런 다음 뇌 절편을 테레빈유 오일 유형 투명 생물학적 제제 1로 35 내지 50분 동안 처리한 후 조직이 완전히 투명해질 때까지 투명제 2를 35 내지 50분 동안 처리합니다. 이제 뇌 조각을 포매 배지 1, 2, 3 및 4에 각각 60분 동안 순차적으로 담급니다. 뇌 조각을 매립 카세트에 넣고 단단히 밀봉한 다음 응고를 위해 냉장 보관합니다. 마이크로톰을 사용하여 조직 블록을 10μm에서 트리밍한 다음 5μm에서 슬라이스합니다. 조직 절편을 45°C의 수조에 30초 동안 뜨게 한 다음 슬라이드에 옮깁니다. 건조 후, 각각 10분씩 두 주기 동안 투명제로 뇌 절편을 탈파라핀화합니다. 그런 다음 감소하는 에탄올 농도로 뇌 절편을 재수화합니다. 이제 PBS에서 각각 5분 동안 절편을 세 번 헹굽니다. 과도한 수분을 제거한 후 각 절편에 100μL의 프로테이나제 K를 첨가하고 37°C에서 20분 동안 배양합니다. PBS 세척 후, 100μL의 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 평형 완충액을 각 샘플에 적용하고 37°C의 가습 챔버에서 10-30분 동안 배양합니다. 흡수지를 사용하여 완충액을 제거하고 TUNEL 분석 키트에서 라벨링 작업 용액 50μL를 추가합니다. 그런 다음 DAPPI 작업 용액을 절편에 바르고 어두운 곳에서 5분 동안 배양하여 핵을 역염색합니다. 샘플을 PBS에서 각각 5분 동안 4회 헹구십시오. 여분의 액체를 제거하고 퇴색 방지 마운팅 매체로 슬라이드를 밀봉합니다. Vectra Polaris 다중 스펙트럼 이미징 시스템을 사용하여 염색된 슬라이드를 스캔합니다. TUNEL 염색은 가짜 그룹에 비해 MCAO 그룹의 반음영 피질에서 더 많은 TUNEL 양성 세포와 함께 세포사멸의 상당한 증가를 보였습니다.