사례 연구로 담배에 과도 단백질 발현 : 실험 접근의 디자인을 사용하여 복잡한 시스템의 특성

다음 실험의 전반적인 목표는 식물 잎에서 단백질의 일시적인 발현에 대한 예측 모델을 생성하는 것입니다. 이는 일시적인 발현에 대한 가장 중요한 매개변수를 식별하고 단백질 축적에 미치는 영향을 정량화하기 위해 실험 설계를 설정함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 유전자를 복제하여 어그로 박테리아(agro bacteria)로 전달한 다음, 이 박테리아를 잎에 주입하여 일시적인 단백질 발현을 일으킵니다.

단백질 발현 수준을 결정하기 위해 다음 잎 샘플을 분석합니다. 실험 모델 평가 설계를 기반으로 서로 다른 연령의 잎과 다양한 배양 조건에 대한 일시적인 단백질 발현 수준의 패턴을 보여주는 결과가 얻어졌습니다. 한 번에 하나의 요인과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 휴가 연령 또는 위치 잎과 같은 서로 다른 매개변수 간의 상호 작용을 감지하고 정량화할 수 있다는 것입니다.

실험 결과에 대한 특정 요인의 효과를 특성화하는 데 자주 사용되는 한 번에 하나의 요인 접근 방식은 실험 중 개별 실행이 끈의 진주처럼 정렬되어 설계 공간의 적용 범위를 낮게 달성하기 때문에 차선책입니다. DOE 전략의 실험 설계와 대조적으로, 한 번에 두 개 이상의 요인을 변경하면 적용 범위가 향상되어 결과 모델의 정밀도가 향상됩니다. 또한, 한 번에 하나의 요인에서 편향된 설계 공간 적용 범위.

또한 실험은 최적의 작동 영역을 식별하지 못하고 차선의 솔루션을 예측하지 못할 수 있는 반면, DOE 전략은 바람직한 조건을 식별할 가능성이 더 높습니다. 이 순서도는 DOE 전략을 계획하는 프로세스를 보여줍니다. 첫 번째 단계는 설계에 포함할 관련 요인과 반응을 식별하는 것입니다.

본 시연에서는 항 HIV 단일클론 항체 2 G 12 모델 및 형광 마커, DS red 단백질의 발현 수준을 이전 실험을 기반으로 측정합니다. 관련성이 있는 것으로 간주되는 최소 감지 가능한 차이는 G 12 2개의 경우 밀리리터당 10마이크로그램이고 DS red의 경우 밀리리터당 20마이크로그램입니다. 또한 2개의 G 12 및 DS red에 대한 시스템의 예상 표준 편차에 대한 대략적인 값은 각각 밀리리터당 4마이크로그램 및 8마이크로그램이 됩니다.

이 DOE 전략을 계획하기 위한 나머지 단계는 여기에서 논의되지 않지만 자세한 내용은 함께 제공되는 원고에서 확인할 수 있습니다. 두 개의 G 12 및 DS red는 담배 식물에서 일시적으로 발현됩니다. 식물 재배 절차를 시작하려면 10 x 10 x 8cm 암벽 블록을 탈이온수로 광범위하게 번쩍여 잔류 화학 물질을 제거하여 준비합니다.

그 후, 각 암벽 블록에 1-2개의 담배 씨앗을 놓고 비료로 짧게 플러시하여 갓 준비한 비료 씨앗 담배 식물 용액으로 블록을 평형을 이룹니다. 씨앗을 씻어 내지 않도록 주의하고, 적절한 조건의 온실에서 42일 동안 담배 식물을 발아시키고 재배하십시오. 배양물을 5.0의 OD 600 나노미터로 성장시켜 AUM FASS를 준비합니다.

배양물을 물과 2중 침투 매체로 희석하여 주입 전 주입에 필요한 OD 600 나노미터와 일치시킵니다. 주입을 위해 잎을 준비하기 위해 fasion 현탁액의 atum의 OD 600 나노미터를 확인합니다. AUM Fasion 용액의 유입을 용이하게 하기 위해 피펫 팁으로 주입 부위의 표피를 부드럽게 긁습니다.

그렇게 하는 동안 잎 잎이 파열되지 않도록 하십시오. AUM fasion 현탁액이 들어있는 주사기를 잎 잎에 수직으로 잡고 처리 할 늑간 필드에 배럴을 대고 배출구를 잎의 바닥면으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 동시에 잎의 윗면을 부드럽게 눌러 잎 잎이 움직이거나 파열되는 것을 방지합니다.

주사기 피스톤을 부드럽게 아래로 누릅니다. AUM 패션 솔루션은 치료 부위가 더 어둡고 녹색이며 촉촉하게 보이는 것으로 표시된 것처럼 잎 잎 내의 세포 간 공간으로 들어갑니다. 주사하는 동안 주사기가 잎에 수직으로 유지되는지 확인하십시오.

그렇지 않으면 박테리아 현탁액이 고압에서 박차를 가할 수 있습니다. 전체 늑간 필드가 aum, aum, fass로 침투할 때까지 여러 위치에서 이 절차를 반복합니다. 그런 다음 주입 후 다음 늑간 필드를 계속하고 배양 기간이 완료되면 DOE에 의해 결정된 조건에서 식물을 배양합니다.

샘플링을 시작합니다. 휴대용 종이 타월로 잎을 고정하고 코르크 차용자를 사용하여 DOE가 표시한 위치와 시간에 처리된 늑간 밭에서 4-5개의 잎 디스크를 제거합니다. 샘플링하는 동안 식물에서 잎 전체를 제거하지 마십시오.

각 샘플의 질량을 측정하고 샘플 이름과 질량이 표시된 1.5ml 플라스틱 반응 튜브에 넣습니다. 단백질을 정량화하기 전에 샘플을 섭씨 음의 20도 또는 섭씨 음의 80도에서 보관하십시오. 이 공정은 잎 디스크 샘플에서 단백질을 추출하기 위해 샘플 안정성과 보관 온도에 따라 이 단계에서 몇 달 동안 일시 중지될 수 있습니다.

샘플 질량 1mg당 3ml의 추출 버퍼를 추가하고 큰 조각이 남지 않을 때까지 전기 유봉을 사용하여 반응 튜브의 잎 디스크를 분쇄합니다. 샘플 과열을 방지하려면 원심분리 후 튜브가 따뜻하다고 느껴질 때마다 튜브를 얼음 위에 올려 놓으십시오. 분산된 고체를 제거하려면 상등액을 깨끗한 1.5mm 반응 튜브로 옮깁니다.

DS 적색 형광을 순차적으로 두 번 측정합니다. 96 잘 재생된 리더에서 각 샘플에 대해 530 25 나노미터 여기와 590 35 나노미터 방출 필터가 장착되어 있습니다. 두 번의 판독과 세 번의 기술적 반복에 대한 형광의 평균을 구하고 DS red 밀리리터당 0마이크로그램을 포함하는 빈 대조군에 대해 기록된 값을 뺍니다.

또한 표준 희석액의 갈대에서 이 값을 빼고 이 빈 수정된 값을 선형 회귀에 사용하여 참조 곡선을 생성합니다. 그런 다음 기준 곡선의 기울기를 사용하여 샘플에 대해 측정된 형광을 DS red 농도로 변환합니다. 두 개의 G 12 항체의 농도를 측정하는 절차는 여기에 나타나지 않지만, 첨부된 원고에 자세히 설명되어 있습니다.

Design Expert 소프트웨어는 해석 노드에서 데이터 분석 및 평가에 사용됩니다. 분석할 반응을 선택하고 처음에는 변환 탭에서 none을 선택합니다. 조사 중인 시스템에 중요한 요인에 대한 일반 정보를 제공하는 피팅 요약 탭으로 계속 진행합니다.

소프트웨어는 모델 탭의 중요도에 따라 초기 모델을 제안합니다. 초기 모형은 적합 요약 결과를 기반으로 미리 선택됩니다. 자동 모드를 사용하여 Innova 탭에서 이 모델을 편집합니다.

필요한 경우 제안된 모델과 포함된 요인을 조사합니다. P 값이 사전 정의된 임계값을 초과하는 요인 또는 모델 탭으로 다시 전환하고 선택 항목을 수동으로 변경한 다음 모델에서 적절한 요인을 제거하여 기계론적 고려 사항을 기반으로 할 가능성이 낮은 요인을 수동으로 제거합니다. 진단 탭으로 계속 이동하여 모델의 품질을 확인하고 모델에 큰 영향을 미치는 데이터 세트에서 잠재적인 이상값을 검색합니다.

진단 도구의 모든 탭을 검사하여 Cox 플롯 상자에서 제안하는 경우 해당 탭에서 변환 유형을 조정하고 모델 그래프 탭에서 해석 절차를 다시 시작합니다.3과 같은 제한된 수의 숫자 요인에 대해 평가된 모델을 시각화합니다. 반응 표면 표현은 최적의 특성을 평가하는 데 유용합니다.

수동 응답 표면은 조사 중인 응답에 대한 두 가지 요인의 영향만 보여줍니다. 응답에 대한 추가 요인의 효과는 요인 도구 창에서 해당 값의 또는 수준을 변경하여 확인할 수 있습니다. 또는 요인 도구 창에서 요인을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 원하는 독립 변수 축을 선택하여 플롯 축에 요인을 할당할 수 있습니다.

요인 수준을 조작하고 요인 도구를 사용하여 그래프 좌표에 할당합니다. 파일 탭의 export graph to file 명령을 사용하여 그래프를 내보냅니다. 최적화 노드의 숫자 하위 노드를 사용하여 모델 요인에 따라 원하는 응답을 수치적으로 최적화하며, 그러면 criteria 탭을 통해 특정 제약 조건을 적용할 수 있습니다.

Criteria 탭에 제공된 입력을 기반으로 solutions 탭에서 수치 해를 계산하고 검사합니다. 추가 분석을 위해 이러한 솔루션을 스프레드시트와 같은 다른 소프트웨어로 내보내 높거나 낮은 반응 값과 관련된 요인 설정을 표시합니다. 이는 3개 이상의 숫자 요인을 조사하고 이 대표 연구에서 3D 표현이 어려운 경우에 유용합니다.

DOE 전략은 ds의 일시적 발현에 대한 다양한 promoter와 5개의 prime RS의 효과를 조사하는 데 사용되었습니다. 과도 발현 모델에 포함된 빨간색 요인과 조사된 범위가 이 표에 표시되어 있습니다. 굵게 표시된 요소는 이 실험에 고유합니다.

이탤릭체로 표시된 요소는 나중에 설명할 다른 실험을 위한 것입니다. 2차 기본 모델을 계산할 수 있도록 모든 불연속적인 숫자 요인에 대해 최소 3개의 수준이 선택되었습니다. 회귀 모델의 계수에 대한 가장 정확한 추정치를 얻기 위해 DOE 실행을 선택하기 위해 최적 선택 알고리즘이 선택되었습니다.

설계 전문가가 처음에 제안한 설계는 90번의 실행으로 구성되었지만 FDS는 1%의 표준 예측 오류를 달성하기에 충분하지 않았습니다. 총 210회 실행으로 설계를 최적으로 증강하여 이 문제를 해결하고 FDS 100%를 달성했으며, 플랫 곡선으로 표시된 설계 공간 전체에서 보다 균일한 예측 정확도를 보였으며, 210회 실행 모두에 대해 DS 빨간색 농도를 측정하고 데이터를 로그 10으로 변환했습니다. 모델 요인은 알파 수준이 0.100인 입방체 모델에서 자동화된 역방향 선택에 의해 선택되었습니다.

그 결과 유의미한 모형이 생성되었는데, 적합도는 유의하지 않고 다중 상관 계수에 대한 값이 높았습니다. 모든 모델 요인의 P 값이 0.05 미만이었으므로 모델을 더 이상 수동으로 조작할 필요가 없었습니다. 모델에는 FDS 그래프의 초기 2차 기본 모델 재평가의 일부가 아닌 굵게 강조 표시된 3개의 요인 상호 작용이 포함되어 있습니다.

최종 예측 모델에 포함된 모든 요인을 사용하여 예측 표준 오차에 대한 FDS가 추가 3요인 상호 작용을 포함해도 크게 감소하지 않았음을 밝혔습니다. design expert의 모델 품질 진단 도구는 잔차의 정규 플롯이 선형 동작을 보여주고 잔차 대 예측 플롯에서 특정 패턴이 관찰되지 않았기 때문에 데이터 변환이 유용하고 모델에 누락 요인이 없다고 표시했습니다. 또한 실험 과정 전반에 걸쳐 숨겨진 시간 종속 변수를 나타내는 추세가 없었습니다.

대신, 모델 예측은 모든 점이 대각선에 가깝기 때문에 관찰된 Diaz 적색 형광과 매우 잘 일치했습니다. 따라서 선택된 모델은 8일 동안 지속되는 침투 후 잠복기 동안 서로 다른 프로모터 5 프라임 UTR 조합에 의해 파생된 비 leadin 담배 잎에서 DS red의 일시적인 발현을 예측하는 데 유용하다고 가정하고, 잘못된 인자 선택 및 변환의 결과를 설명하기 위해 데이터 변환이 없는 인공 선형 회귀 모델도 선택했습니다. 여기에서 명확하게 볼 수 있듯이 잔차의 정규 플롯은 예상되는 선형 동작에서 벗어나고 잔차 대 예측 플롯에 무작위 산란 대신 V자형 패턴이 있습니다.

또한 잔차 대 런 플롯은 두 개의 극한 값을 강조합니다. 대각선에서 벗어나는 작은 값과 높은 값 모두에 대한 예측은 좋지 않았지만 담뱃잎의 일시적인 DS red 발현에 대한 최적 모델 응답 표면이 여기에 나와 있습니다. 이 모델은 잎의 나이가 오래된 잎의 발현 수준이 낮은 중요한 요인이라고 예측했는데, 예를 들어 플롯 A의 잎 2와 그림 B는 플롯 C와 플롯 D의 잎 6과 같은 어린 잎에 비해 잎의 붉은색 축적의 진행은 선형적이거나 지수적이지 않았지만 침투 후 부화 8일 동안 시그모이드 곡선을 따랐습니다.

CAMV 35 SS promoter와의 5가지 prime UTR 조합은 NOS promoter와의 조합보다 DS red 발현이 더 강했습니다. TL과 CHS의 비교에서 알 수 있듯이 five prime UTR도 DS right 발현에 유의한 영향을 미쳤지만, 발현 강도는 동반되는 promoter에 따라 달랐습니다. 예측 모델은 또한 nas CHS 및 CAMV 35 SS CHS와 같은 프로모터 5 프라임 UTR 조합의 특정 쌍이 모든 잎과 2일 이상의 배양 시간에 걸쳐 정의된 비율에서 30% 미만으로 차이가 나는 균형 잡힌 발현 수준을 초래했음을 나타냅니다.

이러한 균형 잡힌 발현은 정의된 화학량론을 가진 다량체 단백질의 발현에 유용할 것입니다. DOE 접근법은 또한 담배에서 두 개의 G 12 및 DS red를 동시에 생산하기 위한 배양 조건과 수확 계획을 최적화하는 데 사용되었습니다. 이 실험에 포함된 일시적인 발현에 영향을 미치는 요인은 이탤릭체, od 600나노미터, 배양 시간입니다.

서로 다른 나이의 식물에서 각 단백질의 발현에 대한 예측 모델이 확립되었습니다. 어린 잎은 파종 후 40일에, 오래된 잎은 파종 후 47일에 수확했습니다. 그런 다음 이 4가지 모델을 평가하고 개별 모델에서 유의한 것으로 밝혀진 각 요인을 포함하는 합의 모델을 수립했습니다.

그 후 합의 모델이 여전히 모든 초기 데이터 세트를 잘 나타내는 것으로 확인되었습니다. 이후 합의 모델을 사용하여 두 단백질에 대한 최적의 배양 온도와 박테리아 OD 600 나노미터를 식별하여 어린 식물과 오래된 식물의 모든 잎과 잎 위치에서 단백질 농도를 예측했습니다. 농도 프로파일과 바이오매스 데이터를 통합하면 절대 단백질 수율을 얻을 수 있습니다.

그런 다음 절대 단백질의 양을 관련 다운스트림 비용과 상관시켜 식물 연령별 각 잎의 가공에 대한 비용 편익 분석을 가능하게 했습니다. 동일한 양의 DS red와 두 개의 G 12 약 65%가 어린 식물에서 발견되었는데, 이는 어린 식물에서 더 높은 특정 단백질 발현을 반영하는 평균 바이오매스가 약 50% 더 낮았음에도 불구하고 오래된 식물에 비해 어린 식물에서 발견되었습니다. 그 결과, 어린 식물은 늙은 식물에 비해 전체 바이오매스가 낮음에도 불구하고 단백질이 더 짧은 성장 기간 동안 더 높은 농도에 도달하기 때문에 일시적인 발현에 유리하다는 것을 밝혔습니다.

마지막으로, 오래된 식물의 잎을 모두 처리하는 것이 1번부터 3번까지의 잎을 버리고 대신 배치당 식물 수를 늘리는 것보다 비용이 많이 든다는 사실도 밝혀졌습니다. 따라서 DOE 기반 모델은 실험의 최종 단계를 표시하는 데만 적합할 뿐만 아니라 다른 데이터와의 조합으로 공정 분석의 보다 복잡한 측면을 용이하게 하는 데에도 적합합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 식물의 일시적인 단백질 발현을 조사하기 위해 DOE를 설정, 수행 및 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.