전기천공 임계값의 정량화를 위한 고처리량 가능 3차원 조직 모델

우리의 연구는 암을 치료하기 위해 전기천공법, 특히 양극성 마이크로초 펄스를 사용하는 데 중점을 두고 있습니다. 현재 우리는 연조직 절제를 살펴보고 있지만 이러한 펄스를 사용하여 생체 내 형질감염으로도 전환하고 있습니다. 우리의 프로토콜을 사용하면 실제로 비가역적 및 가역적 전기천공 임계값을 보다 효율적으로 볼 수 있습니다.

또한 2D 환경이 아닌 3D로 볼 수 있기 때문에 큐브 기반 시스템보다 조금 더 나을 수 있습니다. 그리고 3D 환경은 우리가 조직에서 볼 수 있는 것과 훨씬 더 유사할 것입니다. 앞으로 우리는 이 모델에서 본 것을 생체 내에서 번역하는 것을 검토할 것이며, 이 모델이 실제로 하는 일은 DNA 백신, 화학 요법 및 CRISPR-Cas9 시스템과 같은 것을 전달하려고 할 때 우리가 할 매개변수 선택을 알리는 것입니다.

시작하려면 세포 현탁액과 필요한 시약을 생물 안전 캐비닛에 넣으십시오. 준비된 세포 현탁액을 1형 소 콜라겐 용액과 1:1 비율로 완전히 혼합합니다. 조기 중합을 방지하기 위해 혼합물을 얼음 위에 놓거나 차가운 구슬 욕조에 넣으십시오.

그런 다음 500마이크로리터의 결합 용액을 피펫팅하여 12웰 플레이트의 각 웰 바닥을 코팅합니다. 젤이 각 웰의 벽에 닿도록 플레이트를 부드럽게 소용돌이칩니다. 섭씨 37도로 설정된 가습 인큐베이터에서 5% 이산화탄소와 함께 6시간 동안 또는 겔이 단단해질 때까지 겔을 배양합니다.

그런 다음 웰 플레이트를 기울이고 각 웰에 500마이크로리터의 배양 배지를 부드럽게 추가하여 플레이트 벽 아래로 미끄러지도록 합니다. 두 개의 1.64mm 304 스테인리스 스틸 무딘 팁 주사기 바늘에서 플라스틱 미끼 연결부를 제거합니다. 핀 전극 역할을 할 바늘 하나를 따로 보관하십시오.

다른 바늘의 경우 한쪽 끝의 마지막 5mm를 평평하게 만듭니다. 그런 다음 웰 플레이트 바닥과 같은 높이에 놓일 수 있을 만큼 직경 19mm의 316 스테인리스강 튜브 섹션을 절단하여 링 전극을 만듭니다. CAD 소프트웨어를 사용하여 전극 구성 요소에 맞게 전극 홀더를 설계합니다.

링 및 핀 전극을 전극 홀더에 끼워 전극을 조립하고 끝이 평평한 바늘을 홀더에 압입하여 링 전극을 고정합니다. 생물 안전 캐비닛에서 준비된 플레이트를 기울이고 각 웰에서 400마이크로리터의 배양 배지를 흡인합니다. 흡인된 웰에 마이크로리터당 5마이크로그램의 20마이크로리터를 첨가합니다.

용액이 젤 표면에 고르게 퍼지도록 플레이트를 부드럽게 휘젓습니다. 겔을 섭씨 37도로 설정된 가습 인큐베이터에서 5% 이산화탄소와 함께 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 광섬유 온도 프로브를 핀 전극에 삽입하고 온도 기록을 시작합니다.

전기천공기의 양극 리드를 핀 전극에 연결하고 음극 리드를 바늘에 연결하여 링 전극을 고정합니다. 이제 핫플레이트를 켜고 젤을 가열하여 섭씨 37도의 온도를 유지합니다. 그런 다음 온도 프로브가 있는 조립된 링과 핀 전극을 웰에 삽입하고 젤이 섭씨 37도의 온도에 도달했는지 확인합니다.

전기천공기를 활성화하여 치료를 전달합니다. 그런 다음 건조해 보이는 젤에 100마이크로리터의 배양 배지를 추가하고 처리되지 않은 젤을 계속 전기연화합니다. 모든 처리가 완료되면 5% 이산화탄소와 함께 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 젤을 10분 동안 배양합니다.

배양 후, 플레이트 벽을 따라 각 웰에 500마이크로리터의 배양 배지를 부드럽게 첨가합니다. 가습된 인큐베이터에서 젤을 다시 24시간 동안 배양합니다. 플레이트를 기울이고 각 웰에서 배양 배지를 흡인합니다.

그런 다음 플레이트 벽을 따라 각 웰에 500마이크로리터의 PBS를 부드럽게 추가합니다. 겔을 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 5% 이산화탄소와 함께 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 각 웰에서 PBS를 흡인합니다.

PBS 500마이크로리터를 각 웰에 부드럽게 첨가하여 플레이트 벽 아래로 미끄러지도록 합니다. 플레이트를 부드럽게 휘인 다음 기울여 각 웰에서 PBS를 흡인합니다. 이제 각 웰에 100마이크로리터의 신선한 PBS를 추가하여 이미징을 위해 겔을 수화시킵니다.

그런 다음 표준 형광 현미경 기술을 사용하여 플레이트를 이미지화합니다. 이미징 후, 플레이트의 각 웰에 500마이크로리터의 배양 배지를 추가하고 24시간 동안 배양합니다. 지정된 각 시점에 대해 전체 이미징 및 복구 워크플로를 반복합니다.

계산 모델을 만든 후 현미경 소프트웨어를 사용하여 수직 및 수평 축을 따라 토러스 모양 영역의 바깥쪽 및 내부 가장자리의 직경을 모두 측정합니다. 외경과 내경을 각각 평균화하고 2로 나누어 해당 반지름을 계산합니다. 마지막으로 이전에 만든 조회 테이블을 사용하여 측정된 반경에서 전기장 강도를 도출합니다.

형질감염된 영역의 외부 반경을 사용하여 계산 모델의 전기장 강도와 상관 관계를 파악하여 가역적 전기천공 또는 RE 임계값을 정량화했습니다. 내부 반경은 비가역적 전기천공 또는 IRE 임계값을 결정하는 데 사용되었습니다. 세 가지 양극성 마이크로초 펄스 프로토콜 모두 RE 및 IRE 경계가 명확하게 보이는 토러스 모양의 형질감염 영역을 생성했습니다.

테스트된 파형 중 2-1-1 버스트 균형 파형은 가장 높은 IRE 임계값을 생성한 반면 2-1-1 불균형 파형은 가장 낮은 것으로 나타났습니다. 420볼트를 사용하는 표준 단극 전기천공 프로토콜은 RE 임계값이 센티미터당 642볼트인 원형 형질감염 영역을 생성했지만 세포 사멸을 일으키지 못하여 IRE 역치 결정을 방해했습니다. 겔 분해로 인한 시간이 지남에 따라 조직이 변형되면 형질감염된 영역이 원형 모양을 잃어 정확한 RE 및 IRE 정량화가 어려워졌습니다.

링 및 핀 전극이 웰 바닥과 정렬되지 않으면 비대칭 비원형 형질감염 패턴이 생성되어 임계값 측정이 복잡해졌습니다.