바인딩 속성 수정 복합물 Chromatin의 대량 Chromatin의 분석에 대 한 순차적 소금 기사

순차 염 추출 절차의 전반적인 목표는 벌크 염색질에 대한 단백질 결합 프로파일을 특성화하고 단백질 또는 그 환경을 조작할 때 결합이 어떻게 변경되는지 평가하는 것입니다. 이 방법은 염색질에 대한 후성유전학적 조절자의 상대적 친화도를 측정하고 유전적, 화학적, 환경적 조작에 따라 이러한 상호 작용이 어떻게 변하는지 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 염색질 결합 단백질의 결합 프로파일을 빠르고 저렴하게 평가할 수 있다는 것입니다.

염색질 분야를 처음 접하는 사람들은 종종 염색질 면역침전(ChIP)으로 어려움을 겪습니다. 순차적 염 추출(Sequential Salt Extraction)은 경험이 부족한 과학자들조차도 동일한 질문에 답하기 위해 사용할 수 있는 오래된 기술입니다. 절차를 시작하려면 각 관심 세포주에서 8, 000, 000개의 세포를 수확합니다.

각 세포 샘플을 5ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 세척합니다. 각 샘플과 1ml의 저장성 완충액을 프로테아제 억제제로 재현탁합니다. 세포 현탁액을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

현탁액을 위에서 아래로 10 분 동안 섭씨 4 도에서 10 분 동안 회전 한 다음 6, 000 G에서 동일한 온도에서 5 분 동안 현탁액을 원심 분리하십시오. 상등액을 버리십시오. 마이크로 피펫에 1 밀리리터 팁을 장착하십시오.

펠릿에 프로테아제 억제제가 함유된 200마이크로리터의 무염 변형 리파 완충액을 추가합니다. 피펫 팁을 마이크로 원심분리기 튜브의 바닥에 대고 두드려 펠릿을 팁으로 끌어들입니다. 펠릿을 위아래로 15회 피펫팅합니다.

펠릿이 분해됨에 따라 샘플이 두꺼워지고 끈적해져야 합니다. 이러한 방식으로 각 샘플을 균질화하고 샘플을 얼음 위에서 3분 동안 배양합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 6500G의 샘플을 3분 동안 원심분리합니다.

상층액을 옮겨 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브를 청소합니다. 각 펠릿에 100 밀리몰 염화나트륨 및 프로테아제 억제제가 함유된 200 밀리리터의 변형된 리파 완충액을 첨가합니다. 펠릿을 위아래로 15회 피펫팅합니다.

펠릿이 처음에 피펫 팁으로 빨려 들어가기 어려운 경우 튜브 바닥에 있는 팁을 두드리십시오. 각 샘플에 대해 이 과정을 반복하고 얼음에서 샘플을 3분 동안 배양합니다. 6500G의 시료를 섭씨 4도에서 3분 동안 원심분리합니다.

상등액을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 염화나트륨 농도가 증가함에 따라 변형된 ripa 버퍼 용액으로 샘플을 계속 추출합니다. 펠릿이 더 이상 튜브 바닥에 머물지 않으면 상층액을 디캔팅하기 전에 펠릿을 원심분리기 튜브 캡에 넣습니다.

연속적인 소금 적출 후에, 각 표본을 위해, 5개의 상등액 분획의 각각에 4배 단백질 선적 염료의 70 밀리리터를 추가하십시오. 각 분획의 30마이크로리터를 SDS 아크릴아미드 겔에 로드합니다. 단백질을 멤브레인으로 옮기고 적절한 1차 항체로 염색하여 표준 웨스턴 블롯을 수행합니다.

적외선 염료로 표지된 2차 항체에서 블롯을 배양하고 블롯을 이미지화합니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 염 농도의 밴드 강도를 계산합니다. 염 농도에 대한 밴드 강도를 플로팅하여 관심 단백질의 용리 패턴을 확인합니다.

단백질 ARID1a 및 Polybromo 1의 순차적 염 추출은 각각 200 및 300 밀리몰의 염 농도로 일관된 용출을 보여주었습니다. 동일한 단백질의 비순차적 염 추출은 덜 일관된 결과를 보여주었습니다. 배양 시간은 검사 중인 각 단백질에 맞게 최적화되어야 합니다.

따라서, SSE는 다양한 배양 길이 후 용출 프로파일을 검사하는 데 사용되었습니다. 전사 활성화제인 Polybromo 1은 3분 및 10분 동안 배양했을 때 유사한 용출 프로파일을 보여주었습니다. BMI1에 의해 나타나는 전사 억제인자인 Polycomb Repressive Complex 1은 염색질에서 방출되는 데 3분 이상이 필요했습니다.

단백질-단백질 상호 작용은 용출 프로파일의 변화를 조사하여 조사되었습니다. 억제제가 있는 경우, 단백질 4를 함유하는 브로모도메인은 억제제가 없는 경우보다 낮은 염 농도를 나타냅니다. 히스톤 패턴의 차이는 세포가 히스톤 탈아세틸화효소 억제제로 처리될 때 관찰되어 염색질의 풍경을 변경했습니다.

세포가 게놈 스트레스를 경험했을 때 단백질 결합의 변화도 용출 프로파일에 반영되었습니다. 여기서, 용리에 필요한 염 농도의 증가는 Polybromo 1이 Doxorubicin으로 DNA가 손상된 후 염색질에 더 단단히 결합하는 것을 시사합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 2-3시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 각 샘플에 대한 처리와 가능한 한 일관성을 유지해야 합니다. 이 절차는 염색질 결합 단백질의 메커니즘과 조절을 밝히기 위한 연구의 초기 단계에서 사용할 수 있습니다. 이를 통해 불필요한 게놈 전체 연구에 소요되는 시간과 비용을 절약할