Name: 바인딩 속성 수정 복합물 Chromatin의 대량 Chromatin의 분석에 대 한 순차적 소금 기사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 배우세요 순차적 소금 추출법을 이용하여 크로마틴 결합 단백질의 결합 프로파일을 특성화하고 유전적, 화학적, 환경적 조작에 따른 변화를 평가하는 방법을. 이 기법은 빠르고 비용 효율적인 연구 도구입니다.

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이 작품은 암에 대 한 V 학자 상 (V2014-004)와 V 학자 플러스 퍼듀 대학 센터에서 암 연구를 위한 V 재단과 미국의 암 사회 제도적 연구 그랜트 (ACS IRG 그랜트 58-006-53) 수상 (D2016-030)에 의해 지원 되었다 연구입니다. E. G. P. Borch 대학원 기금 상을 퍼듀 대학 약 화학 및 분자 약리학 부에 의해 지원 되었다.

1. 준비 <ol><li>소형 솔루션 버퍼 a: 0.3 M의 준비 100 mL 자당, 60 m m KCl, 60 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA, 그리고 0.5 %NP-40. 스토어 4 º C. 
	참고: 일부 셀 라인, HEK293T, 등 덜 엄격한 lysing 조건 필요합니다. 핵 lyse 쉽게를 사용 하 여 수정 버퍼 a: 25 mM HEPES pH 7.6, 25 m m KCl, 5 mM MgCl 2, 0.05 m m EDTA, 0.1 %NP-40, 및 10% 글리세롤.</li>
	<li>2 x mRIPA 솔루션의 250 mL 재고 솔루션을 준비: 100 mM Tris pH 8.0, 2 %NP-40, 그리고 0.5% 나트륨 deoxycholate.</li>
	<li>5 M NaCl 100ml 재고 솔루션 준비.</li>
	<li>1 x mRIPA 솔루션 50 mL 6 소금 농도의 각각에 대 한 준비 2 x mRIPA와 5 M NaCl 솔루션을 사용 하 여: 0 m m, 100 m m, 200mm, 300mm, 400mm, 및 500 mM NaCl. 실험을 시작 하기 전에 차가운 얼음에 모든 솔루션</li>
	<li>성장 세포 원하는 조건에서 라인. 
	참고: 때 단백질 노크의 효과, 최저 라인에 대 한 SSE wildtype 셀에 비교 해야 합니다. 이러한 SSE는 병행 하 여 수행 되어야 합니다. 예제를 보려면 화학 억제제 또는 자극을 사용 하 여, 섹션 3-5을 참조 하십시오.</li>
</ol> 2. 기본 순차적 소금 추출 각 <ol><li>수확 8 백만 세포 그리고 얼음 차가운 PBS의 5 mL로 두 번 세척. 
	참고: 그것은 같은 수의 셀을 해당 단백질 농도가지고 중요 합니다. 세포의 정확한 수는 개별 셀 라인 또는 특정 단백질에 대 한 최적화 할 수 있습니다. 그건 중요 하지 너무 많은 단백질 농도 있는 증가 평형 바인딩에 따라 차입 곡선의 관찰을 하지 것 이다. 그러나, 너무 셀 수 충분 한 단백질, 곡선을 감지 하 고 chromatin 펠 릿은 어렵게 시키고 분수 사이 손실 될 수 있습니다.</li>
	<li>다시 버퍼 A의 1 mL + protease 억제제 셀을 일시 중단, 전송 1.5 mL 마이크로 원심 튜브, 그리고 10 분에 대 한 4 º C에서 하단에 회전 톱으로</li>
	<li>4 º C에서 5 분 동안 6000 x g에서 원심 분리 하 여 핵 분리. 
	참고:이 단계 후 핵 여전히 해야 합니다 그대로. 핵 봉투 그대로 경우 펠 릿 다시 일시 중단 완전히; 그러나 때 봉투 lysed는 염색 질은, 펠 릿 하지 다시 일시 중단 합니다. 핵 봉투는 버퍼 A 부 화 후 그대로입니다, 사용 하 여 버퍼 A. 수정</li>
	<li>추가 200 µ L mRIPA 0 mM NaCl + protease 억제제 다시 펠 릿을 중단 하기 전에 각 핵 펠 릿을. 1 mL 피 펫과 15 번 pipetting으로 각 샘플을 균질. 그러나 펠 릿을 쉽게 중단 다시 한다,, 핵 pipetted는 고 샘플 및 끈 적 하 고 두꺼운 플라스틱 어렵다 될 것 이다 lyse 것입니다.
	<li>펠 릿을 끝으로, 원심 분리기 튜브의 하단에 대 한 피 펫 팁의 끝을 가볍게 하기 위해 <ol>. 일단 DNA는 핵에서 발표 하지만 pipetting 않으려고 그것을 깰 것 이다 펠 릿 완벽 하 게 분해 되지 것입니다</li>
	</ol></li> <li>때 샘플 균질 되었습니다, 모든 3 분 ice에 모든 샘플을 품 어 
	참고: 보육 시간 관심사의 단백질에 따라 최적화 되어야 할 수 있습니다.</li>
	<li>Centrifuging 6500 x g 4 º C에 3 분에 대 한 샘플 하 여 펠 릿 격리 chromatin.</li>
	<li>깨끗 한 1.5 mL 원심 분리기를 전송 상쾌한 튜브. 이 0 mM 분수 될 것입니다. 이 0 mM mRIPA 솔루션 lysis로 세척 단계는 핵 역할 하 고 chromatin와 관련 되지 않은 모든 느슨한 단백질 제거 수.</li>
	<li>추가 200 µ L mRIPA 100 mM NaCl + protease 억제제 다시 펠 릿을 중단 하기 전에 각 chromatin 펠 릿을. 15 번 위아래로 펠 릿 pipetting으로 chromatin 펠 릿 헤어. 
	참고:이 시간에 펠 릿 pipetted의 수와 일치 하도록 중요.</li>
	<li>3 분 동안 얼음에 품 어입니다. 이 인큐베이션 단계 여러 샘플 있을 때 특히 중요 하다는 평형 상태에 도달 하는 모든 샘플 수.</li>
	<li>4 º C와 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 표면에 뜨는 전송 3 분 6500 x g에서 원심 분리기.</li>
	<li>나머지 소금 농도 대 한 2.6-2.10 반복. 
	참고: 400 m m NaCl, 후 mRIPA 펠 릿 명확 하 고 효험이 고 튜브의 맨 아래에 유지 되지 않습니다. 펠 릿 절연 상쾌한 동안 원심 분리기 튜브의 뚜껑에 놓일 수 있습니다.</li>
	<li>단백질 로드 x 4의 추가 70 µ L 각 분수를 염색 하 고 서쪽 오 점 분석에 대 한 SDS 아크릴 아 미드 젤에 각 분수의 30 µ L 로드. 
	참고: 단백질의 바인딩 프로필을 확인, 그것은 로드 로드 보다 lysate, 동등한 단백질 농도의 동일한 볼륨에 중요 한.</li>
	<li>표준 서쪽 오 점 막에 전송 하 여 수행 하 고 기본 항 체를 사용 하 여 관심사의 단백질에 대 한.</li>
	<li>Quantitate는 chromatin에서 eluted 단백질을 적외선 형광 IRDye 2 차 항 체에 오와는 이미징 이미지 오 품 어. 개발의 다른 방법을 사용할 수 있습니다, 하는 동안 좋습니다 형광 또는 적외선 이미징, 그것은 자연에서 더 양적.</li>
	<li>사용 ImageJ 또는 유사한 소프트웨어 각 소금 농도에서 eluted 단백질에 대 한 강도 계산. 소금 농도 대 한 밴드 강도 그래프, 관심사의 단백질의 차입 패턴 확인할 수 있습니다.</li>
</ol> 3. 순차적 소금 추출의 존재는 &#34; 리더 &#34; 억제제 <ol><li>셀 (4 백만)의 두 세트를 수확 하 고 표준 SSE에서 핵 분리.</li>
	<li>다시 mRIPA 0 m NaCl m의 200 µ L에 두 집합을 일시 중단 하 고 3 분 동안 품 어. 이것은 모든 무료 핵 단백질의 제거에 대 한 수.</li>
	<li>추가 200 µ L mRIPA 0 mM NaCl 각 펠 릿을. 컨트롤 집합을 하나의 샘플을 DMSO (1 mM (+) JQ1의 2 µ L) 억제제를 추가.</li>
	<li>동요는 펠 릿으로 15 번 pipetting 및 5 분 ice에 품 어</li>
	<li>4 º C와 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 표면에 뜨는 전송 3 분 6500 x g에서 원심 분리기.</li>
	<li>모든 소금 농도 대 한 3.3-4를 반복 하 고 수행 하는 표준 서쪽 오 점.</li>
</ol> 4. 순차적 소금 추출의 존재는 &#34; 작가 &#34; 억제제 <ol><li>억제제 (10 µ M 사)와 세포 치료 또는 3 h. 위해 DMSO</li>
	<li>각 치료에 대 한 4 백만 셀 수확.</li>
	<li>억제제 모든 버퍼에 추가 된 샘플에 대 한 표준 SSE 수행.</li>
</ol> 5. 순차적 소금 추출 다음 DNA 손상 <ol><li>1 헤에 대 한 1 µ M 독 소 루비 셀 치료</li>
	<li>셀에 미디어를 변경 하 고 3 h. 위해 복구 하도록 허용</li>
	<li>8 백만 세포를 수확 하 고 기본적인 SSE 수행.</li>
</ol> 6. 비-순차 소금 추출 <ol><li>12 백만 세포를 수확 하 고 PBS로 세척.</li>
	<li>분할 세포는 마이크로 원심 튜브 당 2 백만 셀.</li>
	<li>버퍼 A의 500 µ L에 다시 일시 중단 하 고 10 분에 대 한 품 어</li>
	<li>6000 x g.에서 원심 분리 하 여 핵을 분리</li>
	<li>MRIPA 버퍼 + NaCl의 각각의 200 µ L에서 알 약을 다시 중단.</li>
	<li>1 mL 피 펫 팁 15 번 pipetting으로 각 샘플을 균질.</li>
	<li>3 분에 대 한 얼음에 품</li>
	<li>6500 x g에서 원심 분리 하 여는 chromatin를 분리 하 고 튜브를 청소 상쾌한 전송. 염료를 로드의 70 µ L을 추가 하 고 서쪽 오 점 분석에 대 한 SDS 페이지 젤에 30 µ L을 실행.</li>
</ol>

<ol><li>Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+structure+and+the+organization+of+the+nucleosome%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Histone structure and the organization of the nucleosome.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).</li>
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</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.

소금 기사를 통해 chromatin와 단백질 상호 작용의 일반적인 고용 되어 수십 년14,15; 그러나, 이것은 하지 되어 체계적으로 최적화 하기 전에 그것의 전체 유틸리티를 공개. 이 순차 방법 단백질 또는 환경을 변경 하는 때 chromatin 바인딩에 변화를 구별 하는 신속 하 고 저렴 한 방법을 제공 하는 방법을 보여 줍니다. SSE 매우 적응 하 고, 최적화할 수 이며 중요 한 것은, 그것은 기술적으로 간단 하 고 특수 장비를 요구 한다. 시작 하기 전에 최적화 하는 데 필요한 핵심 요소는: 휴대폰 번호, 소형 버퍼 조건 및 부 화 시간을 시작.
휴대폰 번호의 가장 중요 한 점은 모든 샘플 사이 일관 되 다는 것입니다. BAF 단지에서 볼 때, 8 백만 셀을 사용 하 여 어떻게이 단지 바인딩됩니다;의 좋은 프로 파일 제공 그러나, 셀의 개수 (또는 버퍼의 양을) 관심...

진 핵 세포에서 DNA 규칙은 세포내와 세포 외 자극에 응답을 협조 하는 단백질의 구색에 의해 엄격 하 게 제어 하는 복잡 하 고 정교한 시스템 이다. DNA는 히스톤 octamers 느슨하게 DNA 따라 분포 하거나 꽉 코일1로 압축 될 수 있는 형태로 nucleosomes 주변 감 쌌 다. DNA와 히스톤의이 구조 배열 읽기, 쓰기 및 지우기 히스톤2포스트 번역 상 수정 (PTM)는 단백질의 네트워크에 의해 통제 된다 chromatin로 알려져 있다. 일부 히스톤 PTMs, acetylation, 등 그들은 히스톤과 DNA2사이 상호 작용을 변경, 입금은 아미노산의 변경. 히스톤 PTMs 모집 transcriptional 레 귤 레이 터, chromatin remodelers, DNA 손상 복구 기계, 및 게놈3의 특정 지역에 DNA 복제 기계를 또한 제공 합니다.
대부분 방법 chromatin 상호 작용을 공부 하 고 작은 규모의 상호 작용을 조사 하거나 큰 게놈 넓은 분석을 포함 합니다. 바인딩 연구 생체 외에서 종종 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA), 등온선 적정 열 량 측정, 형광 편광, 펩 티 드 pulldowns 등 분석 실험에서 히스톤 펩 티 드 또는 DNA 재조합 개별 도메인을 사용합니다. 이 분석 실험 일반적으로 개별 단백질 도메인에 초점을, 때문에 그들은 퍼즐의 작은 조각의 이해를 촉진 하지만 다중 단백질에서 협력 성격의 다중 도메인 단백질, 혼자 그들의 역할을 이해 하 고 우리를 허용 하지 않습니다. 단지입니다. 필연적인의 또 다른 레이어는 대부분 포유류 chromatin 수정 복합물의 이기종 구성에 의해 추가 됩니다. 이 단백질이 질 chromatin 프리의 동적 특성을 함께에서 하면 도전 하는 비보에 바인딩 chromatin 단백질의 상호 작용 chromatin 시험관을 정리 있습니다.
Vivo에서 방법을 만든 중요 한 발전; 그러나, 그들은 종종 비싼, 시간이 소모 및 기술적으로 도전입니다. 그러나 그것 요구 한다 상당한 최적화4chromatin immunoprecipitation 시퀀싱 (칩 seq) 이어서 전체 게놈, 단백질 및 히스톤 수정 현지화를 결정 하는 데 매우 유용 하다. 단백질 상호 작용; 보존 하는 chromatin 가교 화 들은 그러나,이 인공 상호 작용을 일으켜서 고5마스킹 epitope를 발생할 수 있습니다. 또한, immunoprecipitations (IP) 매우 특정 항 체와 DNA 전단 및 칩-정량은 종종 사용할 수의 선험적으로알려진된 바인딩 사이트를 사용 하 여 IP 조건의 광범위 한 최적화를 필요로 합니다. 칩 조건의 최적화, 후 샘플의 처리 비용이 많이 드는 고 시퀀싱 분석을 개월에 몇 주를 요구 한다. 이 방법은 유용 하지만 게놈, 비용에서 단백질 바인딩된 chromatin의 지역화를 식별 및 약속 시간을 작은 변화 글로벌 바인딩 속성에 영향을 미칠 수 있습니다 방법에 대 한 가설을 생성 하려면이 메서드를 사용 하 여 금지 .
이 문서에서 우리는 chromatin-바인딩 단백질의 글로벌 바인딩 프로필을 검토 하 고 단백질, 복잡 한, 또는 글로벌 PTM 프로필에 변경 상호 작용을 변경할 수 있습니다 어떻게 구별 하는 순차적 소금 추출 (SSE) 분석 결과 사용 하는 방법을 설명 합니다. 소금 기사는 일반적으로 광범위 하 게 사용된 하는 기술, 어떻게이 순차적 방법은 매우 재현 가능 하 고 다양 한 설명 합니다. SSE 특성을 어떻게 복잡 한 또는 심지어 단일 도메인의 단일 소 단위 대량 chromatin에 대 한 복잡 한의 전반적인 선호도에 기여 수 있습니다. SSE 경우 단백질의 바인딩을 영향을 변화 chromatin 풍경에 의해 칩 seq와 다른 게놈 넓은 연구를 사용 하 여 확인 될 수 있는 히스톤 마크 대상에 대 한 흥미로운 가설을 제공 하는 결정을 하기 위해 사용할 수 있습니다.
우리는 원래 적응이 방법에서 우 외., Polybromo1의 기능 검사 (PBRM1) PBAF chromatin remodeler6,7의 바인딩에. 이 기술을 사용 하 여, 우리는 PBAF chromatin 개장 하는 복잡 한 내에서 chromatin 바인딩에 대 한 PBRM1의 역할을 결정 하 고이 함수7에 6 개의 개별 bromodomains의 상대적 기여도 결정.
여기 우리가 화학 억제 물에 의해 단백질 chromatin에서의 변위를 검사를 다른 세포 유형, 단지, 수정 하는 비슷한 chromatin의 상대적 바인딩 선호도 평가에서 chromatin 바인딩 탐험이 방법을 최적화 하는 방법에 설명 하 고 chromatin 바인딩 chromatin 풍경에 변경 후의 효과 결정 합니다.

<table><tbody><tr><td>염화나트륨, 크리스탈 2.5 kg AR (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>7581-06</td><td></td></tr><tr><td>설탕, 크리스탈 500 g AR&uml; (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>8360-04</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨, 과립 500g AR&uml; (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>6858-04</td><td></td></tr><tr><td>Trizma(R) 베이스, 기본 표준 및 완충액, >=99.9%(적정), 결정질</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA(에틸렌디니트릴로) 테트라아세트산, 이나트륨염, 이수화물 125G AR(ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>4931-02</td><td></td></tr><tr><td>NONIDET P-40 기판, 100mL UN3082</td><td>Amresco</td><td>E109-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 완충액 용액 (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘, 6-수화물, 크리스탈 500 g AR&uml; (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤, 1L</td><td>Amresco</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g</td><td>Amresco</td><td>0613-100G</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-690-032</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5424 R 냉장 마이크로 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5424 R</td><td></td></tr><tr><td>Secondary mouse IgG HRP linked</td><td>세포 신호</td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>보조 토끼 IgG HRP 관련</td><td>세포 신호</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>BMI-1 항체</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBRM1 항체</td><td>Bethyl</td><td>A301-591A</td><td></td></tr><tr><td>ARID1a 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32761</td><td></td></tr><tr><td>BRD4 항체</td><td>Bethyl</td><td>A301-9852a</td><td></td></tr> <tr><td>(+) JQ1</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>11187</td><td></td></tr><tr><td>SAHA</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>10009929</td><td></td></tr><tr><td>독소루비신</td><td>AK Scientific</td><td>25316-40-9</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td> <td>Macron</td><td>4948-02</td><td></td></tr><tr><td>미니 트랜스 블롯 셀</td><td>BioRad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>미니 젤 탱크</td><td>ThermoFisher</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>알부민, 소 (BSA)</td> <td>Amresco</td><td>0332-100g</td><td>PBS-T에서 5 % 용액으로 웨스턴 블롯 차단 솔루션으로 사용</td></tr><tr><td>볼트 MOPS SDS 러닝 버퍼 (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>B0001</td><td></td></tr><tr><td>볼트 LDS 샘플 버퍼 (4x)</td> <td>Life Technologies</td><td>B0007</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 - 250 kDa</td><td>ThermoFisher</td><td>26619</td><td></td></tr><tr><td>메틸 알코올, 무수</td><td>마크롱</td><td>3041-10</td><td></td></tr><tr><td>트립신 kEDTA, 1X</td><td>Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>SODIUM AZIDE, 250g UN1687</td><td>Amresco</td><td>0639-250G</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) 500g UN1325</td><td>Amresco</td><td>0227-500G</td><td></td></tr><tr><td>글리신, 전기 영동 용, > = 99 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898-1kg</td><td></td></tr><tr><td>BigTop 마이크로 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td></td></tr><tr><td>1000 &마이크로; L 피펫 팁</td><td>VWR</td><td>83007-382</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris 프리 캐스트 젤 4-12 %</td> <td>Invitrogen</td><td>NW04125BOX</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin Hemisulfate, 5 MG</td><td>RPI Research Products</td><td>22035-0.005</td><td>프로테아제 억제제 용액에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>APROTININ, 10 MG</td><td>RPI 연구 제품</td><td>20550-0.01</td><td>프로테아제 억제제 용액에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>PEPSTATIN A, 5 MG</td><td>RPI 연구 제품</td><td>30100-0.005</td><td>프로테아제 억제제 용액에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>OVCA429 세포</td><td>: Karen, Cowden, Dahl의 선물. Ph.D.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A 매체</td><td>Corning Mediatech</td><td>10-050-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>최소 필수 매체(MEM), 분말</td><td>Corning Mediatech</td><td>50-011-PC</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA(100X) 비필수 아미노산</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. 출처</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 솔루션</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>글루타맥스</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>VWR Power 출처</td>: <td>VWR</td><td>13-690-032</td><td></td></tr></tbody></table>

바인딩 속성 수정 복합물 chromatin의 대량 chromatin의 분석에 대 한 순차적 소금 기사

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Chromatin 대상으로 단백질의 바인딩 속성의 매우 chromatin의 복잡 한 본질 및 가장 포유류 chromatin 수정 복합물의 다른 유형의 자연 전하실 수 있습니다. 이러한 장애물을 극복 하기 위해 우리 chromatin 바인딩된 단지의 상대적 바인딩 선호도 평가 하기 위한 순차적 소금 추출 (SSE) 분석 결과 적응 시켰다. 이 쉽고 간단 분석 결과 비 전문가 바인딩 두 관련된 복합물, 복잡 한 소 단위는 손실 또는 개별 도메인 비활성화의 선호도 변화 및 변화에의 선호도에 상대적 차이 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. chromatin 가로로 변경 후 바인딩 선호도입니다. 순차적으로 다시 소금의 양을 증가에 대량 chromatin 중단, 우리 chromatin에서 특정 단백질의 차입을 프로 파일링 할 수 있습니다. 이러한 프로필을 사용 하 여, 우리 chromatin 수정 복잡 한 변경 또는 변경 chromatin 환경에 미치는 바인딩 상호 작용을 확인할 수 있습니다. 다른 생체 외에서 그리고 vivo에서 분석 실험에 SSE 결합해, 개별 도메인 및 다양 한 염색 질 환경에서에서 복잡 한 기능에 단백질의 역할을 확인할 수 있습니다 우리.

이 논문에서는, 장점과 우리 문학6에서 적응 하는 일반적으로 사용 되 순차적 소금 추출 (SSE) 메서드의 응용 프로그램을 설명 합니다. 그림 1, 우리는 비-순차적으로 ARID1a와 PBRM1의 차입 패턴을 감지 하 여 단백질을 추출에 SSE의 재현성을 비교 합니다. 우리는 지속적으로 ARID1a, BAF 소 단위 NaCl 및 PBRM1, 독점적인 PBAF 소 단위 200mm에서 주로 elutes, 300 mM NaCl에서 주로 elutes 관찰 합니다. 그림 1a 는 8 백만 OVCA429 세포와 SSE의 3 개의 독립적인 복제를 보여줍니다. 그림 1b 묘사 비순차적 소금 추출 핵 2 백만 셀에서 절연 단일 소금 버퍼에 다시 중단 했다. 두 방법 ARID1a 200m...

Chromatin 바인딩 단백질의 순차적 소금 추출 큰 단백질 복합물의 바인딩 속성을 결정 하기 위한 유용한 도구입니다. 개별 하위 단위 또는 단백질 복잡 한 대량 chromatin의 전반적인 선호도에 도메인의 역할을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

바인딩 속성 수정 복합물 Chromatin의 대량 Chromatin의 분석에 대 한 순차적 소금 기사

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

순차적 염 추출(Sequential Salt Extraction) 절차의 전반적인 목적은 벌크 크로마틴에 대한 단백질 결합 프로파일을 특성화하고, 단백질 또는 그 환경이 조작되었을 때 결합이 어떻게 변화하는지 평가하는 것입니다. 이 방법은 후성유전학적 조절 인자의 크로마틴에 대한 상대적 친화력을 측정하며, 유전적, 화학적 및 환경적 조작에 따라 이러한 상호작용이 어떻게 변화하는지 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 크로마틴 결합 단백질의 결합 프로파일을 빠르고 저렴하게 평가할 수 있는 방법이라는 점입니다.염색질 분야에 입문하는 연구자들은 종종 염색질 면역침전법(chromatin immunoprecipitation, ChIP) 수행에 어려움을 겪습니다. 순차적 염 분리법(Sequential Salt Extraction)은 경험이 적은 과학자라도 동일한 많은 질문에 답하는 데 사용할 수 있는 오래된 기술입니다. 절차를 시작하려면, 관심 있는 각 세포주에서 8,000,000개의 세포를 수확하십시오.각 세포 샘플을 5 mL의 차가운 PBS로 두 번 세척하십시오. 각 샘플을 프로테아제 억제제가 포함된 저삼투압 완충액 1 mL에 다시 현탁하십시오. 세포 현탁액을 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮기십시오.현탁액을 4°C에서 10분 동안 상하로 반전시켜 섞어준 다음, 동일한 온도에서 6,000 G로 5분간 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다. 마이크로 파이펫에 1 mL 팁을 장착합니다.펠렛에 단백질 분해 효소 억제제가 포함된 염-제거 변형 RIPA 버퍼 200 microliters를 추가하십시오. 마이크로원심분리관 바닥에 피펫 팁을 가볍게 두드려 펠렛이 팁 안으로 빨려 들어가게 하십시오. 펠렛을 15회 파이펫팅하여 섞어 주십시오.펠렛이 분해되면서 샘플이 걸쭉하고 끈적해져야 합니다. 각 샘플을 이런 방식으로 균질화한 후, 얼음 위에서 3분 동안 배양합니다. 그다음 4°C에서 6500 G로 3분 동안 샘플을 원심분리합니다.상층액을 깨끗한 1.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 각 펠릿에 100 millimolar sodium chloride와 프로테아제 억제제가 포함된 modified ripa buffer 200 milliliters를 추가합니다. 피펫을 사용하여 펠릿을 15회 상하로 섞어줍니다.처음에 펠릿이 피펫 팁으로 잘 흡입되지 않는 경우, 튜브 바닥에 팁을 가볍게 두드리십시오. 각 샘플에 대해 이 과정을 반복하고 샘플을 얼음 위에서 3분 동안 배양하십시오. 샘플을 4°C에서 6500 G로 3분 동안 원심분리하십시오.상층액을 새로운 1.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 염화나트륨 농도를 높여가며 변형된 ripa 버퍼 용액으로 샘플 추출을 계속합니다. 펠릿이 더 이상 튜브 바닥에 머물지 않을 때는 상층액을 따라내기 전 펠릿을 원심분리 튜브 캡에 둡니다.연속 염 추출 후, 각 시료의 5가지 상층액 분획에 4배 농축 단백질 로딩 다이 70 milliliters를 각각 첨가합니다. 각 분획 30 microliters를 SDS 아크릴아마이드 겔에 로딩합니다. 단백질을 멤브레인으로 전이시킨 후 적절한 1차 항체로 염색하여 표준 웨스턴 블롯을 수행합니다.블롯을 적외선 염료가 표지된 2차 항체에서 반응시킨 후 블롯의 이미지를 획득합니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 염 농도에서의 밴드 강도를 계산합니다. 밴드 강도를 염 농도에 대해 플롯하여 목적 단백질의 용출 패턴을 결정합니다.ARID1a 및 Polybromo 1 단백질의 순차적 염 추출(Sequential Salt Extraction) 결과, 각각 200 및 300 millimolar의 염 농도에서 일관된 용출이 확인되었습니다. 동일한 단백질에 대해 비순차적 염 추출을 수행했을 때는 결과의 일관성이 더 낮게 나타났습니다. 배양 시간은 분석 대상 단백질별로 최적화해야 합니다.따라서, 배양 시간을 달리한 후의 용출 프로파일을 조사하기 위해 SSE가 사용되었습니다. 전사 활성제인 Polybromo 1은 3분과 10분 동안 배양했을 때 유사한 용출 프로파일을 보였습니다. BMI1로 표시되는 전사 억제제인 Polycomb Repressive Complex 1은 크로마틴에서 방출되기까지 3분 이상의 시간이 필요했습니다.용출 프로파일의 변화를 조사하여 단백질-단백질 상호작용을 연구하였습니다. 억제제가 있을 때, bromodomain containing protein four는 억제제가 없을 때보다 더 낮은 염 농도에서 용출되었습니다. 세포에 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제를 처리했을 때 히스톤 패턴의 차이가 관찰되었으며, 이는 염색질의 지형을 변화시켰습니다.세포가 유전체 스트레스를 겪었을 때의 단백질 결합 변화는 용출 프로필에도 반영되었습니다. 여기서 용출에 필요한 염 농도의 증가는 Doxorubicin으로 인한 DNA 손상 이후 Polybromo 1이 염색질에 더 강력하게 결합한다는 것을 시사합니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 2~3시간 만에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때는 각 샘플을 최대한 일관되게 처리해야 함을 유념하십시오. 이 절차는 크로마틴 결합 단백질의 메커니즘과 조절 기전을 규명하기 위한 연구의 초기 단계에서 활용될 수 있습니다. 이를 통해 불필요한 전유전체(genome-wide) 연구에 소요되는 시간과 비용을 절감할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)에 의한 염색질 상호 작용 분석을위한...

염색질 상호 작용을 매핑 및 전사 규정을 이해하는 데 이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)과 염색질의 상호 작용 분석

질량 분광법의 발전은 조직의 호스트에 단백질 표현 및 수정의 높은 처리량 분석을 허용하고 있습니다. subcellular 분류 및 질병 모델, 분광 및 생물 정보학은 생물 시스템에 새로운 속성을 표시 할 수 있습니다 양적 질량과 결합. 여기에 설명 된 방법은 심장 질환의 설정에 염색질 - 관련 단백질을 분석하고 다른 사람에게 쉽게 적용 할 수...

질병의 염색질 Proteomes의 정량 분석

우리는 기본 T 세포를 사용하여 염색질의 immunoprecipitation위한 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 방법에 설립 있지만, 세포의 제한된 수량에 대한 효율성을 개선 조건과 시약의 특정 집합을 사용합니다. 중요한 데이터 분석 단계에 대한 자세한 설명이 표시됩니다.

바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

염색질의 immunoprecipitation과 매우 높은 처리량 시퀀싱 (칩 SEQ)의 조합은 특정 조직이나 세포주에서 단백질 DNA 상호 작용을 파악하고 매핑 할 수 있습니다. 설명은 예를 들어 전사 인자 TCF7L2 경험을 사용하여 다음 순서를위한 고품질 칩 템플릿을 생성하는 방법이다.

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

게놈 대상 분자의 직접적인 목표를 확인하는 것은 중요한 과제로 남아. DNA 결합 분자 게놈 참여 방법을 이해하기 위해, 우리는 염색질을 분리하는 작은 분자의 가교에 의존하는 방법 (COSMIC)을 개발.

COSMIC와 세포의 약물-DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑 (작은 분자의 가교는 염색질을 분리)

MyoD는 완전히 분화된 많은 비근육 세포주의 근육 전달화를 유도하는 강력한 능력을 가진 근육 전사 인자입니다. 이 전이분화(transdifferentiation)에 관여하는 후성유전학적 메커니즘은 대체로 알려져 있지 않다. 여기에서는 이중 친화성 정제 방법과 질량 분석법을 설명하여 MyoD 파트너를 철저하게 특성화합니다.

탠덤 선호도 정화를 사용하여 MyoD 상호 작용 체의 식별 질량 분석에 결합

여기에서는 단백질-DNA 상호 작용의 염기쌍에 가까운 해상도를 달성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이는 염색질 면역침전(ChIP-exo)으로 선택적으로 농축된 DNA 단편의 엑소뉴클레아제 처리에 이어 고처리량 염기서열분석(high throughput sequencing)을 통해 얻을 수 있습니다.

칩 엑소 방법 : 가까운 자료 쌍의 정밀과 단백질 DNA 상호 작용을 확인

이 프로토콜 칩 seq, 4sU-seq, seq-총 RNA, 리보솜 세포 선 및 1 차 셀에 대 한 프로 파일링의 조합 사용을 설명 합니다. 전사-요소 바인딩, 드 노 보 전사, RNA 가공, 회전율 및 시간이 지남에, 번역 활성화 및 급변 셀에서 이벤트의 전체 과정을 표시 하 고 변경 내용을 추적을 수 있습니다.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

이 프로토콜은 신진 효모인 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae)에서 네이티브 염색질 맥락에서 관심 있는 단일 복제 유전자 자리를 정제하기 위해 부위 특이적 재조합을 기반으로 하는 유전자좌 특이적 염색질 분리 방법을 제시합니다.

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae (맥주효모균의 단일 복제 유전자 자리, 염색질 정제)

단백질 관련 신생 DNA의 풍부화 및 시퀀싱(eSPAN)은 두 개의 복제 DNA 가닥에서 염색질 관련 단백질의 상대적 풍부도를 검출하기 위해 개발되었으며, 이를 통해 염색질 복제와 그 결합 과정에 대한 분자적 통찰을 밝혀냈습니다. 이 프로토콜은 효모 및 마우스 배아 줄기(ES) 세포에서의 eSPAN 절차를 설명합니다.

단백질 관련 신생 DNA 농축 및 시퀀싱을 통한 DNA 복제 가닥 단백질의 가닥 특이적 분석

배우세요 순차적 소금 추출법을 이용하여 크로마틴 결합 단백질의 결합 프로파일을 특성화하고 유전적, 화학적, 환경적 조작에 따른 변화를 평가하는 방법을. 이 기법은 빠르고 비용 효율적인 연구 도구입니다.

바인딩 속성 수정 복합물 Chromatin의 대량 Chromatin의 분석에 대 한 순차적 소금 기사

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