형광 융합 단백질 기반 리포터를 이용한 세포 내 제노톡신 유도 PARP1/PARP2 활성화의 시각화 및 정량적 분석

저희 연구실은 정상 및 변형 세포에서 PARP1 및 PARP2 의존적인 DNA 수리 및 DNA 손상 반응 경로를 연구합니다. 이 분야의 과제는 세포 용해를 피하면서 세포 내 PARP1과 PARP2의 활성화를 정량적으로 분석하는 것입니다. 이로 인해 세포 내 위치 연구가 가능해집니다.

우선, 1.5밀리리터 무균 마이크로원심분리관에 태아 소 혈청 375마이크로리터와 페니실린-스트렙토마이신 자유 DMEM을 투여합니다. 그 다음 지질 기반 형질염색 시약 10마이크로리터와 필요한 모든 플라스미드를 튜브에 넣습니다. 마이크로 원심분리관을 부드럽게 두드려 배지, 형질전환 시약, 플라스미드 DNA를 혼합합니다.

DNA 및 형질전환 시약 복합체 형성을 위해 실온에서 15분에서 30분 사이 배양하세요. 다음으로, 배양지를 제거하지 않고 플라스미드와 형질전환 시약 혼합물을 배양된 293피트 세포가 담긴 60밀리미터 접시에 점하 식으로 넣고 세포를 인큐베이터에 48시간 동안 보관합니다. 그 후 형질전환된 293FT 세포에서 배양지를 채취합니다.

렌티바이러스 입자를 분리하기 위해, 수집된 배지를 멸균 0.45마이크로미터 필터로 여과하여 렌티바이러스 입자에서 세포 잔해를 분리합니다. 전이요법을 위해서는 원하는 세포를 24시간 배양한 후 세포 수합률이 20%에서 40% 사이인지 확인합니다. 다음으로, 1밀리리터 바이러스, 1밀리리터 성장 배양지, 2마이크로리터 폴리브렌을 15밀리리터 원뿔형 튜브에 넣고 부드럽게 역전하여 혼합합니다. 이제 6웰 플레이트에서 성장 배지를 제거하세요.

각 웰에 바이러스, 미디엄, 폴리브렌 혼합물을 넣으세요. 전이 혼합 세포를 32도 섭씨, 5% 이산화탄소 가습 대기가 포함된 인큐베이터에 16시간에서 18시간 동안 보관합니다. RNF146 아미노산, 100에서 182 EGFP의 발현을 검증하기 위해, 커버 슬립을 포함한 배양 접시당 200,000개의 LivePAR 발현 세포를 시드화합니다.

셀이 커버 슬립에 붙어 24시간에서 36시간 정도 기다려 배지를 조절한 후 복제를 시작하세요. 그 다음 LivePAR 발현 세포를 주어진 시약에 노출시킵니다. 화합물을 세포가 포함된 배지에 직접 넣고, 세포 배양 접시에서 배지를 부드럽게 휘저어 화합물을 분배합니다.

60밀리미터 접시는 섭씨 37도에서 60분에서 90분 정도 부화하세요. 세포를 고정하려면 배지를 제거하고 PBS로 세포를 세척하세요. 세포에 4% 포름알데히드를 PBS에 미리 담아 상온에서 15분간 사용하세요.

포름알데히드를 제거한 후 세포를 PBS로 세 번 세척하세요. 그 다음 7:3 비율로 3밀리리터의 차가운 메탄올과 아세톤을 세포에 첨가하여 고정시킵니다. 접시를 영하 20도에 9분간 올려놓으세요.

그 다음, 메탄올 아세톤 용액을 제거합니다. PBS로 세포를 세 번 세척한 후, DAPI가 포함된 안티페이드 배지 15마이크로리터를 유리 슬라이드에 피펫 주입합니다. 셀을 안쪽을 향하게 하여 커버 슬립을 부드럽게 장착 매체에 부착하고, 기포를 최소화하세요.

커버를 중앙에 고정하고 유리 슬라이드에 고정한 뒤, 가장자리에 소량의 투명 탑코트 네일 에나멜을 발라 측면을 밀봉하세요. 슬라이드를 어두운 곳에 두어 네일 에나멜이 마를 때까지 기다려 두세요. 이미지 J를 다운로드하고 설치한 후, 이미지 J를 열고 플러그인을 클릭한 후 매크로 텍스트 파일 LivePAR_Macro을 설치하세요.

이미지 J의 모든 공초점 파일을 열고 원본 파일을 보존하기 위해 TIFF 파일로 저장하세요. 그런 다음 스프레드시트 문서를 열고 Date_CellLineFociAnalysis로 저장하세요. 한 번에 한 개의 TIFF 파일을 분석하세요.

원자핵을 찾으려면 1을 누르세요. ROI 관리자 창이 열리면 모든 항목을 선택한 후 추가를 눌러 원자핵 영역을 원본 이미지 위에 겹쳐 보입니다. 잘못 식별된 핵은 삭제하고, 프레임 내에 완전히 들어가지 않은 핵은 제외합니다.

그 다음 자유손 선택 도구로 핵을 그리고 2를 눌러 PAR 초점을 정량화하세요. ROI 매니저에서 각 핵을 선택하고 핵당 초점 수를 세세요. 모든 핵을 점수 매긴 후 정량화된 데이터를 복사해서 열린 스프레드시트 문서에 붙여넣으세요.

마찬가지로, 모든 TIFF 파일에 대해 분석을 반복하세요. 완료 후에는 선택한 소프트웨어에서 핵별로 PAR 초점을 그래프로 표시하세요. 차량 대조 세포에서는 범세포 EGFP 염색이 관찰되었습니다.

제노톡신 처리 세포는 핵 내 국소를 나타내는 핵 초점이 축적되는 것을 보였다. PARP1 및 PARP2 억제제인 벨리파립 전처리 시 PAR 초점이 상실되었습니다. 시간과 처리 조건에 따른 핵당 PAR 초점 수를 정량화한 결과도 유사했습니다.

이 프로토콜은 제노톡신에 반응하고 유전적 변이에 따라 PARP1과 PARP2 신호 축의 활성화를 정량화할 수 있게 해줍니다. 이 분석법을 통해 전통적인 면역형광 기법을 사용하여 poly ADP-리보스와 단백질의 공존 위치를 검증하였습니다. 앞으로 우리는 이 분석법을 유전자 독성 검사와 PARP1, PARP2 또는 PARP 억제제의 고처리량 분석과 PARP1 및 PARP2 신호 전달에 관여하는 새로운 인자 규명에 활용할 예정입니다.