Name: 형광 융합 단백질 기반 리포터를 이용한 세포 내 제노톡신 유도 PARP1/PARP2 활성화의 시각화 및 정량적 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-17T13:48:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 배우세요 형광 융합 단백질 리포터를 이용한 세포 내 PARP1/PARP2 활성화 시각화 및 정량 분석 방법을. 이 기술은 DNA 손상 시 PAR 축적을 실시간으로 측정하여 유전독성 검사와 DNA 복구 연구에 활용됩니다.

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<table><tbody><tr><td>시약, 화학 물질 및 펩타이드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro;m Durapore steriflip 필터</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SE1M003M00</td><td></td></tr><tr><td>20 x 20 mm 현미경 커버슬립</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 22-170-371</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A18-1</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시, 100 mm</td><td>VWR</td><td>Cat# 25382-166</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시, 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# 430166</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플레이트, 6웰</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-161</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials, 2 mL</td><td>VWR</td><td>Cat# 89499-722</td><td></td></tr><tr><td>디에틸 에테르</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 60-29-7</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설포사이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# BP231-1</td><td></td></tr><tr><td>일회용 멸균 필터, 0.45 &micro;m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SE1M003M00</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>Cat# 15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 200 proof</td><td>Decon Labs</td><td>Cat# 2701</td><td></td></tr><tr><td>유리 현미경 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>열 활성화된 태아 소 혈청</td><td>Atlanta Biologics</td><td>Cat# S11150</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A144-212</td><td></td></tr><tr><td>하이그로마이신</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 10687010</td><td></td></tr><tr><td>대형 Kim Wipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>Cat# 34256</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X GoStix Plus 키트</td><td>Takara</td><td>Cat# 631280</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A452SK-4</td><td></td></tr><tr><td>MNNG</td><td>Molport</td><td>Cat# N493990</td><td></td></tr><tr><td>NRH (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-디하이드록시-5-(하이드록시메틸) 테트라하이드로푸란-2-일]-4H-피리딘-3-카복사마이드)</td><td>Marie Migaud 또는 NuChem Sciences Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PARG 억제제 (PDD00017273)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SML1781</td><td></td></tr><tr><td>PARPi 억제제 (Veliparib, ABT-888)</td><td>MedChemExpress</td><td>Cat# HY-10129</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>폴리브렌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>tBuOOH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 180345000</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-x2 (세포전염 시약)</td><td>Mirus</td><td>Cat# MIR-6006</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>VWR</td><td>Cat# 0694</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield (H-1000) 안티-페이드 장착 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# NC1695563</td><td></td></tr><tr><td>세포주&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>293-FT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# R70007</td><td></td></tr><tr><td>(SV40 대 T 항원으로 변형된 인간 배아 신장 세포로부터 파생)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# R70007</td><td></td></tr><tr><td>LN428</td><td>네너러스 기프트 받음</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>(인간 교모세포종 종양 세포주)</td><td>Dr. Ian Pollack (피츠버그 대학교)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RPE-1</td><td>ATCC</td><td>Cat# CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>(인간 hTERT-불멸화 망막 색소 상피 세포)</td><td>ATCC</td><td>Cat# CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>U2OS</td><td>ATCC</td><td>Cat# HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>(인간 골육종 세포주)</td><td>ATCC</td><td>Cat# HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>재조합 DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>실험실 재고# 253</td><td>Addgene, Cat# 12251</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>실험실 재고# 254</td><td>Addgene, Cat# 12253</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>실험실 재고# 252</td><td>Addgene, Cat# 12259</td><td></td></tr><tr><td>pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (LivePAR은 RNF146의 WWE 도메인, 아미노산 잔기 100-182, EGFP와 융합; 하이그로마이신 저항 캐세트 포함)</td><td>실험실 재고# 1727</td><td>Addgene, Cat# 176063</td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어 및 알고리즘&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator (그림 준비용)</td><td>Adobe Systems</td><td>버전 2024</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>버전 10.5.0 (Mac OS X)</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/ij/download.html</td><td></td></tr></tbody></table>
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형광 융합 단백질 기반 리포터를 이용한 세포 내 제노톡신 유도 parp1/parp2 활성화의 시각화 및 정량적 분석

Visualization and Quantitative Analysis of Genotoxin-Induced PARP1/PARP2 Activation in Cells Using a Fluorescent Fusion Protein-Based Reporter

형광 융합 단백질 기반 리포터를 이용한 세포 내 제노톡신 유도 PARP1/PARP2 활성화의 시각화 및 정량적 분석

Poly(ADP-ribose) (PAR) is a polymer of ADP-ribose synthesized by four members of the ADP-ribose polymerase family of enzymes&#8212;PARP1, PARP2, PARP5a, ...

visualization-quantitative-analysis-genotoxin-induced-parp1parp2

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

생활 세포의 ubiquitin proteasome - 활동을 모니터링하는 방법이 설명되어 있습니다. degron-불안정 GFP-(GFP-dgn)과 안정적인 GFP-dgnFS 융합 단백질이 생성되고 lentiviral 발현 벡터를 사용하여 셀에 transduced 있습니다. 이 기술은 ubiquitin-proteasome 활동이 쉽게 epifluorescence 또는 유동 세포 계측법을 사용하여 평가 할 수있는 안정적인 GFP-dgn/GFP-dgnFS 표현 세포 라인을 생성 할 수 있습니다.

살아있는 세포에서 Ubiquitin-proteasome 활동 모니터링 Degron (dgn) - 불안정 그린 형광 단백질 (GFP) 기반 리포터 단백질을 사용하여

이 프로토콜은 DNA 손상뿐만 아니라 유사 분열 동안의 현지화에 대한 응답으로 활성화 DNA 이중 가닥 브레이크 신호 단백질을 시각화하는 방법을 설명합니다.

DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

유사 분열을 겪고있는 암 세포에있는 phenanthridine PJ-34의 세포 독성 활동은 라이브 공 촛점 이미징 실시간으로 기록되었다. PJ-34 근절 인간의 유방암 MDA-MB-231 세포의 유사 분열에 여분의 중심체를 숨겨 세포. 정상 이중 초점 유사 분열과는 달리, 여분 중심체는 PJ-34의 존재에있는 두 개의 스핀들 극에 클러스터되지 않았습니다.

비정상적인 유사 분열과 관련된 세포의 죽음은 라이브 암 세포의 공 촛점 이미징에 의해 관찰

레이저 microirradiation는 살아있는 세포에서 DNA 수리의 연구에 대 한 유용한 도구입니다. 다양 한 DNA 병 변 유발 하 UVA 레이저의 사용에 대 한 방법론 접근 표시 됩니다. 우리 지역 microirradiation; 정상적인 세포 주기를 유지 하는 방법을 최적화합니다 따라서, 비친된 세포 유사 분열을 통해 진행합니다.

고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술

이 프로토콜의 목표 레이저 microirradiation를 사용 하 여 다른 유형의 DNA 손상, 비교적 간단한 가닥 나누기 등 복잡 한 손상, DNA 손상 신호 및 복구 요소에서 어셈블리 피해 사이트 vivo에서 공부를 유도 하는 방법을 설명 하는 것입니다. .

간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation

이 프로토콜 설명 caspase 분자 형광 보완성 (BiFC); 그들의 활성화에 있는 첫걸음은 초기자 caspases의 유도 근접을 시각화 하는 데 사용할 수는 영상 기반 방법입니다.

Caspase 활성화 분자 형광 보완성을 사용 하 여 경로를 조명

여기는 살아있는 세포에서 fluorometric 및 이미징 분석 통해 효율 resealing 플라즈마 멤브레인을 측정 하는 높은 처리량 형광 기반 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과 약 또는 포유류 세포에서 원형질 막 resealing 규제 대상 유전자 검사에 대 한 사용할 수 있습니다.

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

이 문서에서는 집계에 형광 단백질의 효과 형광 기자 들의 맥락에서 새로 새롭거나 형광 단백질의 급속 한 평가 misfolded polyglutamine 확장의 독성을 평가 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다.

효 모에 Polyglutamine 독성 분석 실험을 사용 하 여 퓨전 파트너에 형광 단백질의 영향

DNA 손상에 따라 인간 세포는 게놈의 무결성을 회복하기 위해 필수적인 수리 경로를 활성화합니다. 여기서, 우리는 DNA 복구 단백질을 검출하고, 그들의 공간 및 측두모집을 분석하고, DNA 손상의 사이트에서 단백질 단백질 상호 작용을 심문하는 것을 돕는 수단으로 간접적인 면역 형광의 방법을 기술합니다.

면역형광에 의한 DNA 수리 단백질 상호작용의 시각화

본 프로토콜은 토포이소머라제 억제제 및 포름알데히드에 의해 유도된 유비퀴틸화, SUMOylation 및 ADP-리보실화를 포함하여 DNA-단백질 가교결합(DPC) 및 번역 후 변형(PTM)을 검출하고 정량화하는 변형된 방법을 강조하여 DPC 및 그 PTM의 형성 및 복구에 대한 연구를 허용합니다.

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

이 연구에서 우리는 기형 유발 화학 물질을 식별하기 위한 시험관 내 세포 분석을 제시합니다. 인간 유도만능줄기(iPS) 리포터 세포에서 섬유아세포 성장 인자(FGF)/혈청 반응 인자(SRF) 신호 전달의 역학을 측정하고, 이 신호 전달 경로의 화학적 파괴를 정량화하여 기형 유발 위험을 평가했습니다.<br...

인간 유도만능줄기세포에서 섬유아세포 성장 인자 신호 파괴의 실시간 모니터링에 기반한 발달 독성 분석

배우세요 형광 융합 단백질 리포터를 이용한 세포 내 PARP1/PARP2 활성화 시각화 및 정량 분석 방법을. 이 기술은 DNA 손상 시 PAR 축적을 실시간으로 측정하여 유전독성 검사와 DNA 복구 연구에 활용됩니다.

형광 융합 단백질 기반 리포터를 이용한 세포 내 제노톡신 유도 PARP1/PARP2 활성화의 시각화 및 정량적 분석

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