인간 섬유아세포의 세포 노화 정량 평가를 위한 LysoTracker를 이용한 리소좀 프로파일링
2026년 7월 17일
이 논문은 IMR-90 인간 섬유아세포에서 노화 과정에서 리소좀 재형성을 측정하기 위한 생세포 LysoTracker 프로토콜을 제시합니다.
우리는 세포 노화와 그 특성화를 연구하며, 리소좀 변화와 같은 특징이 노화 지표로 어떻게 작용할 수 있는지에 초점을 맞춥니다. 기존의 노화 마커는 종종 종점 기반의 이진법인 반면, 라이브 세포 영상은 노화를 조건 전반에 걸쳐 연속적인 정량적 신호로 읽을 수 있습니다. 우선, IMR-90 섬유아세포를 24웰 플레이트에 씨앗 뿌리고, 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 아수합 단일층을 형성할 때까지 배양합니다.
각 실험마다 시딩 밀도와 도금과 리소좀 염색 사이의 시간을 기록하세요. 전체 배양지를 37도까지 데웁니다. 매질에 75나노몰 LysoTracker Deep Red 작업 용액을 준비하고 빛으로부터 보호하세요.
작동 용액을 부드럽게 반전시켜 섞으세요. 정의된 노화 유도법을 사용하여 준비한 매칭 전노화 및 노화 IMR-90 섬유아세포 코호트를 선정하였습니다. 성장 특성과 형태를 모니터링하여 노화 표현형을 확인한다.
각 웰에서 사용한 매지를 흡입하세요. 각 웰 벽을 따라 LysoTracker 작업 용액을 부드럽게 첨가하여 단층에 교란을 방지합니다. 세포를 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 30분간 배양하세요.
LysoTracker 배양 마지막 10분 동안, 제조사가 권장하는 작업 농도에 Hoechst 33342를 직접 웰에 넣고 플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합합니다. 배양 종료 시 염색 배지를 제거하고 미리 예열된 PBS로 세포를 한 번 헹구어 배경 형광을 줄이세요. 세척 직후에는 미리 데워진 페놀 레드 프리 배양지를 넣으세요.
버퍼 교환부터 데이터 수집까지의 시간을 모든 웰에서 일관되게 유지하여 바로 라이브 셀 이미징으로 진행하세요. 배양판의 평행 웰을 표지하여 베타-갈락토시다제 염색을 위해 고도로 노화된 세포와 이전 노화 대조군을 비교합니다. 고정 전에 검증 웰을 위한 완전한 라이브 셀 영상.
라이브 영상 촬영 중 스테이지 좌표를 기록하여 고정 후 동일한 필드를 재배치합니다. 노화 베타-갈락토시다제 염색 키트에서 2%의 포름알데히드와 0.2%의 글루타알데히드가 포함된 고정액을 세포에 첨가합니다. 접시에 뚜껑을 덮고 실온에서 10분에서 15분간 부화시킵니다.
고정제를 제거하고 PBS로 웰을 두 번 씻어내세요. 그 다음 pH 6의 X-gal 기질을 포함한 베타-갈락토시다제 염색액을 각 웰에 첨가합니다. 배양 중 증발을 제한하기 위해 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고, 이산화탄소 없는 37도 드라이 인큐베이터에 12시간에서 16시간 동안 보관하세요.
고정 및 염색 후 판을 현미경 스테이지에 올려놓고 기록된 스테이지 좌표를 사용해 동일한 영상 필드를 재배치합니다. 밝방야 현미경으로 웰을 검사하고 착색 패턴을 기록하세요. 각 상태에 대한 대표적인 이미지를 획득하고, 웰당 노화 관련 베타-갈락토시다제 양성 세포의 비율을 결정합니다.
노화 세포는 밝고 공간적으로 확장된 핵 내 리소좀 풍부 영역을 보였으며, 노화 이전 대조군은 이산적인 점상 구조를 가진 전체 신호가 낮은 것으로 나타났다. 노화 상태에서는 노화 이전 대조군보다 베타-갤 양성 세포의 비율이 더 높았습니다. 복제 웰 전반에 걸쳐 LysoTracker 강도와 노화 관련 베타-갤 양성 면적 사이에 강한 상관관계가 관찰되었습니다.
양성 마스크 내 평균 LysoTracker 강도는 노화 배양에서 노화 이전 배양보다 높았으며, 이는 두 조건을 구분하는 가장 강력한 현장 차원 판별자였다. 통합 LysoTracker의 핵당 강도는 대표 유적 분야의 노화 배양에서도 더 높았다. 이 프로토콜은 연구자들이 살아있는 세포 내 리소좀 재형성을 측정하여 노화 부담과 진행 상황을 단일 세포에서 정량적으로 측정할 수 있게 합니다.
강도 비교는 한 세션 내에서만 유효하므로 모든 웰에서 염색 및 영상 설정을 동일하게 유지하는 것이 중요합니다. 향후 연구에서는 이 절차를 3차원 모델, 추가 세포 유형, 다양한 현미경 시스템 및 워크플로우 전반의 검증으로 확장할 수 있습니다.
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Overview
This article presents a live-cell imaging protocol for assessing cellular senescence by quantifying lysosomal remodeling using LysoTracker Deep Red, an acidotropic fluorescent dye. The method provides an indirect, pH-dependent readout of the acidic organelle compartment, serving as a practical correlate of senescence burden in cultured cells, specifically demonstrated in IMR-90 human lung fibroblasts undergoing replicative senescence.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular senescence
- Cell biology
- Live-cell imaging
Background
- Cellular senescence is characterized by stable cell-cycle arrest and distinct phenotypes, including enlarged morphology and altered secretory profiles.
- Senescent cells show pronounced lysosomal remodeling and expansion of the acidic endo-lysosomal compartment.
- Changes in lysosomal acidity and degradative capacity are hallmarks of senescence.
- Traditional senescence assays include SA-β-Gal staining, but live-cell compatible, quantitative methods are needed.
Purpose of Study
- To provide a simple, live-cell imaging protocol for quantifying lysosomal remodeling as a correlate of senescence.
- To demonstrate the use of LysoTracker Deep Red for assessing acidic organelle expansion in senescent cells.
- To offer a quantitative complement to conventional endpoint assays for senescence.
Methods Used
- Culturing and serial passaging of IMR-90 human lung fibroblasts to induce replicative senescence.
- Staining live cells with LysoTracker Deep Red to label acidic organelles.
- Fluorescence imaging to visualize and quantify lysosomal signal intensity and lyso-positive area per cell.
- Optional SA-β-Gal staining on parallel cultures as a confirmatory marker.
Main Results
- Late-passage, senescent cultures exhibited higher LysoTracker signal and larger lyso-positive regions compared to early-passage controls.
- The observed increase in acidotropic dye signal is consistent with expansion of the acidic organelle compartment during senescence.
- The method provides an indirect, quantitative measure of lysosomal remodeling associated with senescence.
Conclusions
- The protocol offers a simple, adaptable approach for live-cell assessment of senescence-linked lysosomal remodeling.
- Results should be interpreted as indirect correlates of lysosomal changes, not direct measures of lysosome number or biogenesis.
- The method can be extended to other cell types or senescence-inducing conditions.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of cellular senescence using LysoTracker-based lysosomal profiling enables early detection of senescence-linked organelle remodeling in human fibroblasts. This live-cell imaging approach provides a scalable, indirect readout of senescence burden, supporting predictive confidence in discovery-stage cell models. Integrating such quantitative, adaptable assays strengthens portfolio triage and mechanistic de-risking in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of senescence-associated organelle remodeling as a functional biomarker.
- Supports biological de-risking by quantifying lysosomal changes linked to cell-cycle arrest.
- Facilitates predictive confidence in cell-based models for target validation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, live-cell systems for downstream screening of senescence-modulating compounds.
- Delivers quantitative, reproducible readouts of lysosomal signal intensity and area per cell.
- Enables assay standardization and scalability for high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant modeling of senescence in human fibroblasts.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of senescence-modifying interventions.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying cellular remodeling endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
This lysosomal profiling protocol fits within the early discovery to preclinical continuum, enabling hypothesis testing and quantitative assessment of senescence in cell models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of senescence-linked lysosomal remodeling and pathway clarification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in live-cell assays.
- Analytics: Delivers image-based measurements of lysosomal signal intensity and area per cell for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains continuity with disease-relevant fibroblast models and senescence endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable, live-cell assay platform for diverse senescence-inducing conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in senescence studies.
- Operational Value: Enables standardization, reproducibility, and scalability in live-cell imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing quantitative, early-stage readouts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of senescence-modifying candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and quantitative image analysis.
- Needs access to fluorescence microscopy and compatible analytical software.
- Demands cross-team standardization of staining and imaging protocols.
- Adaptable to various cell types and senescence-inducing stresses with protocol optimization.
- Interpretation is limited to indirect correlates of lysosomal remodeling, not direct lysosome quantification.
