Name: 라이트의 전체 세포 레코딩은 망막 통에 흥분성의 시냅틱 전류를 Evoked (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-02T15:50:00.000+00:00
Duration: 19 min 33 s
Description: 배우세요 호랑이도롱뇽 망막 슬라이스를 준비하고 패치 클램프 기법으로 시각 자극에 따른 흥분성 시냅틱 전류를 기록하는 방법을. 이 기법은 망막 생리학 및 시각 신경과학 연구에 활용됩니다.

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솔루션 <ul><li> 신경절 세포에 대한 세포 솔루션 (MM)를 100 K - 글루 콘 산, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, 0.5 GTP, 90 μm의 Sulforhodamine B는 (얼룩)을 함께 산도 = 7.4로 조정 코 </li><li> 양극성 세포 (MM)을위한 세포 솔루션 : 90 K - 글루 콘 산, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, 0.5 GTP, 90 μm의 Sulforhodamine B는 (얼룩)을 함께 산도 = 7.4로 조정 코 </li><li> 세포외 링어의 솔루션 (MM)을 : 112 NaCl, 5 포도당, 5 HEPES, NaOH와 산도 = 7.75로 조정이 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2. 솔루션의 산소가 필요하지 않습니다. </li></ul> 녹화 실 준비 우리의 기록 챔버 다른 접착제의 잘라 작은 실리콘 블록이 잘 조직 조각에 대한 안정성을 제공하기 위해 배치됩니다 잘되는 접착제와 현미경 슬라이드로 구성되어 있습니다. 망막 조각의 준비 photoreceptors의 표백 피하기 위해, 절개는 IR 또는 희미한 붉은 빛 라이트에서 수행됩니다. 하나는 막대 경로에서 응답을 녹음에 관심이있다면, 오직 IR 빛이 (IR는 현미경없이 실내 조명을 해부. 추가 적외선 고글이 현미경으로하지 절차를 사용해야합니다) 사용해야합니다. 하나는 주로 원추 라이트 응답, 희미한 붉은 방 조명이나 붉은 손전등을 기록에 관심이있다면 사용할 수 있습니다. 현미경 그러나, 여전히 IR oculars 있어야합니다. photoreceptor 입력이 실험을 위해 관련이없는 경우, 절차는 일반 현미경을 사용하여 일반 룸 라이트에서 진행하실 수 있습니다. <ol><li> 잘 접착제 실리콘 두 개의 현미경 슬라이드 준비 : (필터를 밀어 각 슬라이드에 실리콘 그리스의 두 병렬 밴드 (약 0.5 cm 간격)을 작성하고 슬라이드의 한쪽 거름종이의 사각형 조각을 배치, 모두 그리스 밴드를 건너 그것이 잘 슬라이드에 첨부되도록 면도날의 일부와 함께 종이) </li><li> 동물 후 참수를 두 번 pithed, 30 분 동안 얼음 욕조에 배치됩니다 설립 프로토콜에 따라 도롱뇽을 희생. </li><li> 샐러맨더 머리에서 눈을 제거하고 조직 종이에 해부 현미경으로 그것을 장소는 얼음처럼 차가운 링어의 솔루션 moistened </li><li> 눈에서 결합 조직을 제거 </li><li> 각막에 작은 상처를 만들기 위해 면도날을 사용하여 </li><li> 눈에하기 위해 첨부 파일을 함께 가위로 그것을 제거하는 동안 집게로 각막을 절단 잡아 </li><li> 포셉와 렌즈를 제거 </li><li> 포셉로 방어막을 누른 상태에서 조리개를 제거 오라 세라타 따라 컷 </li><li> 이 직사각형 조각으로 세안 컵 컷 </li><li> (아주 조심스럽게 그것을 아래로 밀어하면서 조각을 평평하게해야합니다) 조각 중 하나를 선택하고 필터 종이에 공막엔 측면을 장소 </li><li> 부드럽게 지금 필러 용지에 첨부되어야하는, 망막에서 공막엔 리프트 </li><li> 신속하게 잘하는 얼음처럼 차가운 링어의 솔루션을 추가 </li><li> 두 번째 작품에 대해 동일한 단계를 반복 </li><li> 200 - 300μm 다양한 조각 잘라 사용자 정의 만든 기계에 위치 면도날을 사용합니다. </li><li> 필터 종이의 측면에서 조각을 데리러 포셉 한 켤레를 사용하여 망막의 레이어가 표시되기 때문에 그들을 넘겨주하고, 진공 그리스 밴드에 장소를 </li><li> 손상되지 않은 외모와 망막의 레이어 (배율이 충분히 높지 않을으로 레이어를 한 일부 겹겹이 인식할 수있다면 그러나 슬라이스 일반적으로 충분이며, 때로는 해부 현미경 아래에서 볼 수 어렵습니다을 나타내는 수평 밴드를 보여줍니다 슬라이스를 선택하십시오. 가) 직립 현미경으로 볼되면 슬라이스를 사용하는 여부에 대한 최종 결정은, 그러나, 만들 수 있습니다. 두 슬라이드 사이에 링어 다리를 구축하여 녹음 챔버 슬라이드로 이동 </li><li> 슬라이스가 (신경절 세포와 photoreceptors가 동시에 초점이되어야합니다) 기울어져되지 않도록 필터 종이는 기록 챔버에있는 고무 블록에 대한 강요되어 있는지 확인 </li></ol> 레코딩 장비에서 조직을 배치 <ol><li> 녹음 슬라이드는 현미경으로 위치하고 중력 재관류의 syste 통해 링어의 솔루션과 perfused입니다 </li><li> 준비는 10X와 40x 물 침지 목적으로 직립 현미경 시각이다. </li><li> 다시 말하지만, 우리는 photoreceptors의 표백 방지하기 위해 IR 조명을 사용합니다. IR 카메라는 TV 화면에 연결되어있는 현미경의 측면 포트에 첨부되어 있습니다. </li></ol> 시각적 자극 시각적 자극은 Psychtoolbox를 사용하여 Matlab에서 프로그래밍하고 현미경 이미지 주입기 (Mbf bioscience)를 사용하여 현미경의 상단에 포트를 통해 망막에 투영됩니다. 비트 + + 디지털 비디오 프로세서 (캠브리지 연구 시스템)는 14bit 휘도 규모를 구하고 synchr하는 데 사용됩니다데이터 수집과 자극 프레 젠 테이션을 onize. 이 동영상에 사용되는 시각적 자극이 지속적으로 균일한 배경 (두 초 동안 제시되었다 100 % 대비 밝은 또는 어두운 바 (폭 = 460μm)입니다 휘도 = 8 * 10 4 광자 / μm의 / s의 크기 : 1.84 X 1.38mm). 전기 생리학 <ul><li> micropipette의 풀러와 함께 : 패치 전극은 borosilicate 유리 (1.5mm, ID 84mm.. OD)에서 가져온 있습니다. 신경절 세포의 경우, resistances 2 4 MOhms 사이입니다. 양극성 세포의 경우, 4, 8 MOhms 사이에 높은 resistances이 사용됩니다. </li><li> 전압 클램프 녹음은 Multiclamp 700A (분자 장치), 앰프 및 Labview에서 프로그램 연구실 내부 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. </li><li> 약물은 8 채널 재관류 시스템을 통해 perfused 수 있습니다. microperfusion 전극은 슬라이스 (조직 가시가에서 재관류를 켜고 때 이동해야 하나 요구 압력이 슬라이스가 여과지에서 분리 될 수 있도록 너무 강하지 않다는 것을 조심)에 가까이 위치합니다. 실험 동안 microperfusion 끊임없이 녹음에 재관류를 스위칭 및 해제에 의해 방해받지 않도록합니다 (약물이 필요하지 않은 경우 perfusing 제어 솔루션)을 설정해야합니다. </li></ul>

<ol><li>Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28C%29+receptors+control+adaptive+changes+in+a+glycinergic+inhibitory+pathway+in+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina.</a> Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).</li>
<li>Heflin, S. J., Cook, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narrow+and+wide+field+amacrine+cells+fire+action+potentials+in+response+to+depolarization+and+light+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation.</a> Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).</li>
<li>Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+Channels+in+the+Transient+Retinal+Bipolar+Cells+Enhance+Visual+Responses+in+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.%22%5BJournal%5D)">Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells.</a> J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).</li>
</ol>

장점 : <ol><li> 모든 세포 유형은 액세스할 수 있습니다 </li><li> 셀 유형을 쉽게 식별은 특히 형광 염료는 전극 솔루션에 추가하는 경우 </li><li> 약리 요원들은 쉽게 표적 세포에 도달할 수 </li><li> 패치 클램프 기술은 망막 계산 서로 다른 이온 채널의 역할을 조사 할 수 있습니다. 동일한 정보는 날카로운 전극과 extracelluar 스파이크 녹음하거나 녹음을 통해 얻을 수 없습니다. </li><li> 이 기술은 다른 동물 모델에 적용할 수있는 </li></ol> 단점 : <ol><li> 프로세스는 깔끔히의 과정에 차단받을 수 있습니다. 따라서 공간 수용 분야에 초점을 연구 어려울 수 있습니다. </li><li> 전기 생리학에 사용되는 체외 준비 가장 망막 마찬가지로, 안료 상피는 photoreceptors의 표백으로 이어질 수있는, 제거됩니다. 높은 광 강도와 자극이 필요하거나 많은 적응 상태에서 망막을 연구해야 할 연구는이 기술을 어려움에 빠질수...

<table><tbody><tr><td>Multiclamp 700A</td><td>패치 클램프 증폭기</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SZX9</td><td>해부 현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX50WI</td><td>정립 현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>40배 및 10배 수침 렌즈, 형광 필터 및 수은 램프가 장착됨</td></tr><tr><td>P-97</td><td>마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lucivid</td><td>현미경 이미지 인젝터</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8채널 관류 시스템</td><td>미세관류</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bits++</td><td>디지털 비디오 프로세서</td><td>Cambridge Research Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>적외선 접안렌즈</td><td>기타</td><td>ITT 시각 정보 솔루션(ITT Visual Information Solutions)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>접착식 실리콘 웰</td><td>기타</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td>직경 20mm, 깊이 1.0mm</td></tr><tr><td>막 여과기</td><td>필터</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWPO1300</td><td>.45&amp;#x03BC;m HA</td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>전극 유리</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>필터</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6789-0402</td><td>4mm 필터, .2um 나일론 막, 폴리프로필렌 하우징</td></tr><tr><td>IR 카메라</td><td>현미경 장착 카메라</td><td>Sony Corporation</td><td>SPT-M324</td><td>Extrawave HAD, B7W 비디오 카메라</td></tr><tr><td>피크로톡신</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>스트리크닌</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸-4-아세트산 나트륨염</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7013</td><td></td></tr><tr><td>호랑이 도롱뇽 유생</td><td>동물</td><td>Charles E. Sullivan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

라이트의 전체 세포 레코딩은 망막 통에 흥분성의 시냅틱 전류를 evoked

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

우리는 시냅스 회로 망막에 underlies 시각 정보 처리 연구를 전체 세포 패치 클램프 기법을 사용합니다. 이 비디오에서는, 우리는 망막 슬라이스 준비에서 개별 세포의 빛을 evoked 흐름 전체 세포 레코딩을 수행하는 과정을 통해 여러분을 안내할 것입니다. 우리는 동물 모델로 수생 호랑이 도롱뇽을 사용합니다. 우리는 눈 해부를 설명함으로써 시작하고 조각이 electrophysiological 레코딩을위한 마운트하는 방법 보여줍니다. 슬라이스가 기록 챔버에 배치되면, 우리는 전체 셀 전압 클램프 레코딩을 수행하는 방법을 보여줍니다. 우리는 빛이 - evoked 현재 답변을 이끌어내는 수있는 통에 photoreceptors에 시각적 자극이 프로젝트를 만듭니다. 8 채널 재관류 시스템을 우리가 신속하게 다른 에이전트 사이를 전환할 수있게 의하여 기록하는 동안 우리는 약리 요원으로 슬라이스를 perfuse. 망막 슬라이스 준비 널리 특히 전체 마운트 준비에 액세스할 수 없습니다 amacrine 또는 바이폴라 세포를 연구, 망막의 패치 클램프 녹음에 사용됩니다.

이 동영상은 수생 호랑이 도롱뇽의 망막 통에 전체 셀 전압 클램프 레코딩 과정을 보여줍니다. 우리는뿐만 아니라 망막의 시각적인 자극하는 동안 패치 클램프 레코딩을 수행하는 방법으로 슬라이스의 준비를 보여줍니다.

라이트의 전체 세포 레코딩은 망막 통에 흥분성의 시냅틱 전류를 Evoked

우리는 망막의 시각 정보 처리를 뒷받침하는 시냅스 회로를 연구하기 위해 전체 세포 패치 클램프(whole-cell patch clamp) 기술을 사용합니다. 본 영상에서 우리는 ...

오늘은 패치 클램프 기록을 위해 호랑이도롱뇽의 망막 절편을 준비하는 방법을 보여드리겠습니다. 먼저, 두 종류의 현미경 슬라이드를 준비하겠습니다. 우리는 슬라이드를 유체 챔버로 사용할 수 있도록 접착성 웰이 부착된 슬라이드를 사용합니다.첫 번째 슬라이드 위에 진공 그리스를 두 줄의 평행한 띠 모양으로 바릅니다. 그런 다음 거름종이를 가져와 빛의 너비에 맞춰 직사각형 조각으로 자릅니다. 이제 자른 조각 중 하나를 그리스 레일 위에 놓고, 슬라이드에 잘 부착되도록 아래로 누릅니다.다른 조각에 대해서도 동일하게 작업합니다. 두 번째 종류의 슬라이드에는 작은 고무 블록이 접착되어 있습니다. 우선, 블록 사이에 진공 그리스를 약간 바릅니다. 또한, 조직 절편기(tissue slicer)에 새 면도날을 장착합니다.마지막으로, 해부 과정에 필요한 도구인 포셉 두 쌍, 가위 한 쌍, 그리고 빛 유발 전류를 기록하기 위해 머리에서 눈을 분리하는 도구를 준비합니다. 해부는 IR 광 아래에서 수행해야 하지만, 시연을 위해 지금부터는 밝은 곳에서 작업을 진행하겠습니다. 먼저 눈을 분리하여 얼음처럼 차가운 링거액으로 적신 조직지 위에 놓고 현미경으로 관찰합니다.그다음, 안구가 손상되지 않도록 안구에서 과도한 결합 조직을 제거합니다. 저는 항상 표면을 따라 절개합니다. 이것이 현미경을 통해 보이는 모습입니다.다음으로, 면도날을 사용하여 각막에 작은 절개창을 만듭니다. 이를 위해 포셉으로 안구를 고정하는 동시에 면도날의 끝부분을 각막 위로 누릅니다. 그 다음 포셉으로 각막을 잡고 가위로 제거하여 수정체를 꺼냅니다.포셉으로 렌즈에 쉽게 접근할 수 있도록 아이 컵(eye cup)의 가장자리를 약간 누릅니다. 그다음, 홍채를 제거합니다. 포셉으로 홍채를 잡은 상태에서 aura serato를 따라 절개하여 아이 컵만 남깁니다.그다음 I cup을 두 개의 직사각형 조각으로 자릅니다. 먼저 절반으로 자른 후 상단과 하단 가장자리를 다듬습니다. 이제 이전에 준비한 슬라이드 중 하나를 가져와 I cup 조각 하나를 집어 망막 면이 아래로 향하게 하여 여과지에 놓습니다.그 다음, 슬라이드 위에 망막만 남도록 공막을 들어 올립니다. 그 후, 챔버에 링거액을 빠르게 첨가합니다. 두 번째 망막 조각에 대해서도 동일한 절차를 반복하겠습니다.하지만 이번에는 망막을 여과지에 내려놓는 동안 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 왼손에 든 포셉을 사용하여 공막을 조심스럽게

whole-cell-recordings-light-evoked-excitatory-synaptic-currents

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 electrophysiological 레코딩을위한 마우스 망막의 어두운 적응 조각을 생성하는 절차를 설명합니다.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

여기 우리는 전기 생리학 및 Ca2 + 이미징에 적합 한천 - 임베디드 망막 조각의 준비를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 하나 하나 presynaptic 신경 터미널 직접 패치 - 클램프 녹음을 사용하여 망막 microcircuits의 리본 형태의 시냅스를 공부하실 수 있습니다.

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA 2 +</sup망막 조각의 단일 신경 터미널에서> 영상

이 문서는 그대로 마우스 망막에서 찬란 태그의 연결 인구에서 각각의 세포의 녹음을 묘사. 두 광자 여기 적외선을 사용하여 transgenetically 라벨이 세포들은 빛의 반응, 수용 필드 속성 및 형태학을 연구하기 위해 패치 - 클램프 녹음 대상으로했다.

손상 망막의 특성 Electrophysiological GFP - 표현 세포 집단

이 비디오는 쥐의 뇌 절편에서 망막 생성 및 피질 생성 시냅스의 전기 생리학적 기록을 설명합니다. dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN)를 포함하는 절편은 기록 챔버에 배치됩니다. 자극 피펫은 망막 신경절 세포(RGC)를 자극하고 망막 자극 시냅스를 조사하기 위해 시신경관에 배치되거나 피질 뉴런을 자극하고 피질 생성 시냅스를 조사하기 위해 망상 시상핵(nucleus reticularis thalami)에 배치됩니다. 자극을 받으면 망막 신경세포와 피질 뉴런은 흥분성 신경전달물질을 방출하여 LGN 중계 뉴런에서 시냅스 전류를 생성합니다. 이러한 전류는 패치 클램프 기록 피펫을 사용하여 기록됩니다.

쥐 뇌 절편에서 Retinogeniculate 및 Corticogeniculate 시냅스에 대한 전기생리학적 연구

이 비디오는 어둡게 적응된 마우스 망막 조직 절편 제제에서 빛을 유발하는 시냅스 후 반응을 기록하는 것을 보여줍니다. 망막 절편은 기록 챔버에 배치되고, 기록 피펫은 망막 신경절 세포와의 전기적 연속성을 확립하는 데 사용됩니다. 광 펄스(light pulses)는 신경절 세포(ganglion cell)에서 흥분성 시냅스후 전위(excitatory post-synaptic potentials)를 생성하기 위해 적용되며, 이는 피펫에 의해 기록됩니다.

마우스 망막 절편의 뉴런에서 빛을 유발한 시냅스후 반응(Light-Evoked Postsynaptic Responses in Neurons of Mouse Retinal Slices)

이 비디오는 내측 전전두엽 피질(mPFC) 축삭을 광유전학적으로 자극하고 LEC에서 피라미드 뉴런의 반응을 기록하여 외측 내후각 피질(LEC)의 시냅스 효율성을 연구하는 절차를 보여줍니다. 이 방법은 시냅스 가소성을 연구하기 위해 패치 클램프 녹음과 광 자극에 의한 시냅스 활성화를 결합합니다.

쥐 뇌 절편에서 시냅스 사건의 광유전학적 자극 및 전기생리학적 기록

우리는 수생 호랑이 도롱뇽 (에서 얇은 망막 조각의 준비를...

양서류 망막 슬라이스 준비 광수와 2 차 신경 세포에서 동시에 전체 세포 녹음

우리는 쥐의 눈에서 망막 절편을 준비하고 망막 뉴런의 빛 반응을 기록하는 방법을 보여줄 것입니다. 전체 절차는 어두운 환경에서 수행됩니다.

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

우리는 망막 표면에 평행하게 절편의 평면과 성인 포유류 망막의 수평 슬라이스 준비를 개발했다. nonradially 중심 망막 신경 세포의 수지상 필드 패치 클램프 및 이미징 기술과 신호 처리의 연구를 허용, 절단되지 않았다.

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

여기에서, 우리는 측방 geniculate 핵을 포함하는 급성 두뇌 조각의 준비를 위한 프로토콜 및 망막 생성 성 및 코르티코겐iculate 시냅스 기능의 전기 생리학적 조사를 제시합니다. 이 프로토콜은 동일한 급성 뇌 슬라이스에서 높은 방출 및 낮은 방출 확률로 시냅스를 연구하는 효율적인 방법을 제공합니다.

망막 생성 및 코르티코제네틸레이트 시냅스 기능의 전기 생리학적 조사

이 연구는 광수용체 세포체를 제거함으로써 면역조직화학, in situ hybridization 및 전기생리학 실험을 위해 더 빠른 항체 확산과 내부 망막 뉴런에 대한 패치 피펫 접근을 개선할 수 있는 대체 편평 장착 망막 제제를 제시합니다.

척추동물 망막의 내부 핵층 뉴런 연구를 위한 개선된 평판 준비로서의 망막 분할

배우세요 호랑이도롱뇽 망막 슬라이스를 준비하고 패치 클램프 기법으로 시각 자극에 따른 흥분성 시냅틱 전류를 기록하는 방법을. 이 기법은 망막 생리학 및 시각 신경과학 연구에 활용됩니다.

라이트의 전체 세포 레코딩은 망막 통에 흥분성의 시냅틱 전류를 Evoked

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