라이트의 전체 세포 레코딩은 망막 통에 흥분성의 시냅틱 전류를 Evoked

오늘은 패치 클램프 기록을 위해 호랑이 도롱뇽의 망막 절편을 준비하는 방법을 보여드리겠습니다. 먼저, 두 종류의 현미경 슬라이드를 준비하겠습니다. 우리는 슬라이드를 유체 챔버로 사용할 수 있도록 접착 웰이 부착된 슬라이드를 사용합니다.

첫 번째 슬라이드 위에 진공 그리스를 두 줄로 평행하게 도포합니다. 그런 다음 거름종이를 가져와 직사각형 모양으로 자릅니다. 이제 자른 종이 조각 하나를 그리스 레일 위에 올리고, 슬라이드에 잘 밀착되도록 아래로 누릅니다.

다른 부품에 대해서도 동일하게 작업합니다. 두 번째 종류의 슬라이드에는 작은 고무 블록들이 접착되어 있습니다. 우선, 블록 사이에 진공 그리스를 약간 바릅니다. 또한, 조직 절편기(tissue slicer)에 새로운 면도날을 장착합니다.

마지막으로, 해부 과정에 필요한 도구인 핀셋 두 쌍, 가위 한 쌍, 그리고 빛 유발 전류를 기록하기 위해 머리에서 눈을 분리하는 도구를 준비합니다. 해부는 적외선(IR) 광원 아래에서 수행해야 하지만, 시연을 위해 지금부터는 가시광선 아래에서 진행하겠습니다. 먼저 눈을 분리하여 얼음처럼 차가운 링거 용액(ringer solution)으로 적신 티슈 페이퍼 위에 놓고 현미경으로 관찰합니다.

그런 다음, 안구가 손상되지 않도록 안구에서 여분의 결합 조직을 제거합니다. 항상 표면을 따라 절개합니다. 이것이 현미경을 통해 보이는 모습입니다.

다음으로, 면도날을 사용하여 각막에 작은 절개창을 만듭니다. 이를 위해 포셉으로 눈을 고정한 상태에서 면도날의 끝부분을 각막으로 눌러줍니다. 그 후 포셉으로 각막을 잡고 가위로 제거하여 수정체를 꺼냅니다.

포셉으로 렌즈에 쉽게 접근할 수 있도록 안구 컵의 가장자리에 약간의 압력을 가합니다. 다음으로虹彩(홍채)를 제거합니다. 포셉으로 홍채를 잡은 상태에서 aura serato를 따라 절개하여 안구 컵만 남을 때까지 제거합니다.

그다음 I 컵을 두 개의 직사각형 조각으로 자릅니다. 먼저 절반으로 자른 후 상단과 하단 가장자리를 다듬습니다. 이제 이전에 준비한 슬라이드 하나를 가져와 I 컵 조각을 집어 망막 면이 아래로 향하게 하여 여과지에 놓습니다.

그런 다음 공막을 당겨 슬라이드 위에 망막만 남게 합니다. 그 후, 링어 용액을 챔버에 빠르게 첨가합니다. 두 번째 망막 조각에 대해서도 동일한 절차를 반복하겠습니다.

하지만 이번에는 망막을 여과지에 내려놓으면서 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 왼손에 쥔 포셉을 사용하여 공막을 조심스럽게 누릅니다. 마지막으로 망막을 200 to 300 µm 너비의 조각으로 자릅니다.

다음으로, 실험에 사용할 절편을 선택합니다. 적절한 절편을 고르기 위해, 망막의 층을 확인할 수 있도록 절편을 90도 회전시킵니다. 손상이 없고 서로 다른 층을 나타내는 뚜렷한 수평 띠가 보이는 절편을 선택합니다.

슬라이드를 한 곳에서 다른 곳으로 옮기기 위해, Ringer's bridge를 만든 후 용액을 통해 슬라이드를 조심스럽게 이동시킵니다. 슬라이스를 내려놓을 때, 거름종이가 유리면에 수직으로 배치되도록 고무 블록에 밀착시킵니다. 이제 패치 클램프 기록을 수행할 준비가 되었습니다.

세포 내 용액은 하루에 실제로 필요한 양만 해동하여 사용할 수 있도록 냉동실에 소분하여 보관합니다. 전극을 채우기 전, 전극 팁을 막을 수 있는 작은 입자들을 제거하기 위해 용액을 필터링합니다. 신경절 세포의 기록을 위해 보로실리케이트 모세관 유리를 사용하여 패치 전극을 제작합니다.

전극 저항이 2~4 MΩ 사이가 되도록 풀(pull) 설정을 선택합니다. 전극을 채울 때 전극 팁에 기포가 없는지 확인해야 합니다. 손가락으로 유리를 톡톡 쳐주면 기포를 제거하는 데 도움이 됩니다.

이것은 헤드 스테이지에 부착된 전극 홀더입니다. 전극 롤러에는 염화은 와이어가 포함되어 있습니다. 이것은 niga 브릿지가 있는 접지 전극입니다.

여기 관류 피펫이 있습니다. 이 피펫은 8채널 미세 관류 시스템에 연결되어 있습니다. 주 관류는 중력 구동 방식이므로, 단순히 용액이 채워진 병에서 튜브를 통해 기록 챔버로 흘러 내려가게 됩니다.

암실에서 기록할 수 있도록 현미경의 측면 포트에 TV 화면과 연결된 IR 카메라를 장착하였습니다. 상단 포트에는 망막에 시각적 자극을 투사할 수 있는 이미지 프로젝터를 연결하였습니다. 마지막으로 패치 클램프 증폭기를 연결하였습니다.

이제 망막 절편을 현미경 아래에 배치하고, 메인 관류 시스템을 설정하기 위해 접지 전극을 배스에 추가합니다. 다음으로, 중력 관류 시스템의 튜브를 추가합니다. 반대편의 유리 튜브는 진공 흡입 장치에 연결되어 유체 수준을 일정하게 유지합니다.

또한 흡입 튜브가 전기 숄더(electro shoulder)에 연결되어 있는지 확인합니다. 다음으로, 미세 관류 피펫을 배치합니다. 현미경 대물렌즈에 맞춰 피펫을 배스 안으로 내립니다.

슬라이스에 가까이 다가가면, 용액이 슬라이스에 닿을 수 있도록 약간 뒤로 물립니다. 퍼퓨전(perfusion)을 켜면 여기처럼 슬라이스가 약간 움직이는 것이 보여야 합니다. 이제 기록하기에 적합한 세포를 찾아보겠습니다.

슬라이스 바닥 쪽에 위치한 신경절 세포를 찾습니다. 전극을 수조에 넣기 전에 전극을 준비하고, 약간의 양압을 가합니다. 현미경 하에서 전극을 찾으면, 세포에 패치를 하기 위해 슬라이스 바로 위까지 전극을 내립니다.

40배 대물렌즈로 교체했습니다. 이제 기선 전류(baseline current)를 0으로 맞추고 전극 저항을 확인합니다. 씰 테스트(seal test)는 10mV 펄스를 연속적으로 가하는 과정으로, 이를 통해 전극과 세포 사이에 기밀한 씰(tight seal)이 형성되었는지 확인할 수 있습니다.

이제 전극을 대상 세포로 내립니다. 세포체에 딤플(dimple)이 형성되는 것이 보이면, 튜브의 양압을 해제하여 단단한 밀봉(seal)을 형성합니다. 이때 저항이 매우 높아져 전류 추적선(current trace)이 평평하게 보입니다.

작은 스파이크들은 전극에서 발생하는 커패시턴스 아티팩트입니다. 이는 다음과 같이 보정할 수 있으며, 이제 제거되었습니다. 이제 세포 내부로 진입해 보겠습니다.

이를 위해 전극 숄더에 연결된 튜브에 조심스럽게 작은 흡입 펄스를 가하며, 모든 것이 제대로 작동한다면 전류 트레이스가 이와 같이 변화하는 것을 볼 수 있습니다. 현재 보이는 스파이크는 막 커패시턴스에 의해 상쇄되며, 현재 이는 암실에서 준비된 표본입니다. 이제 빛에 의해 유도된 반응을 기록할 수 있는지 확인해 보겠습니다.

오실로스코프에서 확인할 수 있는 파형은 -60 mV로 전압 고정된 신경절 세포의 전류 반응입니다. 사용된 빛 자극은 일정하고 균일한 배경 위에 제시된 밝고 어두운 막대 형태입니다. 연구실에서 사용하는 소프트웨어는 한 차례의 실험에 대한 전체 기록을 보여줍니다.

어두운 바의 시작과 밝은 바의 종료에 반응하여 이것이 off 세포임을 확인할 수 있습니다. 상단의 흰색 선은 자극의 지속 시간을 나타냅니다. 이제 다양한 약리학적 제제를 관류하는 실험을 진행할 수 있습니다.

예를 들어, GABA 작동성 및 Gly 시너지성 억제를 차단할 수 있습니다. 1분 미만으로 기다리면 보통 이곳에서 약물의 효과가 나타나기 시작합니다. 반응은 더 강해지고 더 오래 지속되었습니다.

망막 절편 제작법은 망막 내 다양한 세포로부터 시냅스 전류를 기록하는 데 널리 사용되어 왔으며, 전극 용액에 형광 염료를 첨가하면 세포 유형을 쉽게 확인할 수 있습니다. 해부학적으로, 본 연구에서는 유생 TGA 도롱뇽을 동물 모델로 사용합니다. 도롱뇽은 변온 동물이며 망막 세포의 크기가 크다는 점이 기록 조건에 유리하지만, 동일한 기술을 포유류 표본에도 적용할 수 있습니다.