라이트의 전체 세포 레코딩은 망막 통에 흥분성의 시냅틱 전류를 Evoked

오늘은 패치 클램프 기록을 위해 호랑이도롱뇽의 망막 절편을 준비하는 방법을 보여드리겠습니다. 먼저, 두 종류의 현미경 슬라이드를 준비하겠습니다. 우리는 슬라이드를 유체 챔버로 사용할 수 있도록 접착성 웰이 부착된 슬라이드를 사용합니다.

첫 번째 슬라이드 위에 진공 그리스를 두 줄의 평행한 띠 모양으로 바릅니다. 그런 다음 거름종이를 가져와 빛의 너비에 맞춰 직사각형 조각으로 자릅니다. 이제 자른 조각 중 하나를 그리스 레일 위에 놓고, 슬라이드에 잘 부착되도록 아래로 누릅니다.

다른 조각에 대해서도 동일하게 작업합니다. 두 번째 종류의 슬라이드에는 작은 고무 블록이 접착되어 있습니다. 우선, 블록 사이에 진공 그리스를 약간 바릅니다. 또한, 조직 절편기(tissue slicer)에 새 면도날을 장착합니다.

마지막으로, 해부 과정에 필요한 도구인 포셉 두 쌍, 가위 한 쌍, 그리고 빛 유발 전류를 기록하기 위해 머리에서 눈을 분리하는 도구를 준비합니다. 해부는 IR 광 아래에서 수행해야 하지만, 시연을 위해 지금부터는 밝은 곳에서 작업을 진행하겠습니다. 먼저 눈을 분리하여 얼음처럼 차가운 링거액으로 적신 조직지 위에 놓고 현미경으로 관찰합니다.

그다음, 안구가 손상되지 않도록 안구에서 과도한 결합 조직을 제거합니다. 저는 항상 표면을 따라 절개합니다. 이것이 현미경을 통해 보이는 모습입니다.

다음으로, 면도날을 사용하여 각막에 작은 절개창을 만듭니다. 이를 위해 포셉으로 안구를 고정하는 동시에 면도날의 끝부분을 각막 위로 누릅니다. 그 다음 포셉으로 각막을 잡고 가위로 제거하여 수정체를 꺼냅니다.

포셉으로 렌즈에 쉽게 접근할 수 있도록 아이 컵(eye cup)의 가장자리를 약간 누릅니다. 그다음, 홍채를 제거합니다. 포셉으로 홍채를 잡은 상태에서 aura serato를 따라 절개하여 아이 컵만 남깁니다.

그다음 I cup을 두 개의 직사각형 조각으로 자릅니다. 먼저 절반으로 자른 후 상단과 하단 가장자리를 다듬습니다. 이제 이전에 준비한 슬라이드 중 하나를 가져와 I cup 조각 하나를 집어 망막 면이 아래로 향하게 하여 여과지에 놓습니다.

그 다음, 슬라이드 위에 망막만 남도록 공막을 들어 올립니다. 그 후, 챔버에 링거액을 빠르게 첨가합니다. 두 번째 망막 조각에 대해서도 동일한 절차를 반복하겠습니다.

하지만 이번에는 망막을 여과지에 내려놓는 동안 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 왼손에 든 포셉을 사용하여 공막을 조심스럽게 누릅니다. 마지막으로, 망막을 200 to 300 micrometer 너비의 조각으로 절단합니다.

다음으로, 실험에 사용할 슬라이스를 선택합니다. 적절한 슬라이스를 고르기 위해 슬라이스를 90도 회전시켜 망막의 층을 확인합니다. 손상되지 않았으며, 서로 다른 층을 나타내는 뚜렷한 수평 띠가 보이는 슬라이스를 선택합니다.

슬라이스를 다른 슬라이스로 옮기기 위해 링거액 브릿지(ringers bridge)를 만든 다음, 용액을 통해 슬라이스를 조심스럽게 이동시킵니다. 슬라이스를 내려놓을 때는 거름종이가 유리면에 수직이 되도록 고무 블록에 밀착시킵니다. 이제 패치 클램프 기록(patch clamp recording)을 위한 준비가 완료되었습니다.

세포 내액(intracellular solution)을 냉동고에 소분하여 보관함으로써 하루에 실제로 필요한 양만 해동하여 사용합니다. 전극을 채우기 전, 전극 팁을 막을 수 있는 미세 입자들을 제거하기 위해 용액을 필터링합니다. 신경절 세포(ganglion cells)로부터 기록하기 위해 보로실리케이트 모세관 유리(borosilicate capillary glass)를 이용하여 패치 전극을 제작합니다.

전극 저항이 2~4 MΩ 사이로 생성되는 설정을 선택합니다. 전극을 채울 때 전극 팁에 기포가 없는지 확인해야 합니다. 손가락으로 유리를 톡톡 쳐서 기포를 제거하는 것이 도움이 됩니다.

이것은 헤드 스테이지에 부착된 전극 홀더입니다. 전극 롤러에는 염화은 와이어가 들어 있습니다. 이것은 니가 브리지(niga bridge)가 포함된 접지 전극입니다.

여기 관류 피펫이 있습니다. 이 피펫은 8채널 미세 관류 시스템에 연결되어 있습니다. 주 관류는 중력 구동 방식이므로, 용액이 채워진 병에서 이 튜브를 통해 기록 챔버로 흘러 내려가게 됩니다.

암실에서 기록할 수 있도록, 현미경의 측면 포트에 TV 화면과 연결된 IR 카메라를 장착하였습니다. 상단 포트에는 이미지 프로젝터를 연결하여 망막에 시각적 자극을 투사할 수 있도록 하였습니다. 그리고 마지막으로 패치 클램프 증폭기를 연결하였습니다.

이제 망막 절편을 현미경 아래에 놓고, 주요 관류 설정을 위해 접지 전극을 배스(bath)에 추가합니다. 다음으로, 중력 관류 시스템의 튜브를 추가합니다. 반대편의 유리 튜브는 진공 흡입기에 연결되어 유체의 높이를 일정하게 유지합니다.

또한 흡입 튜브가 전기 숄더에 연결되어 있는지 확인합니다. 다음으로, 미세 관류 피펫을 배치합니다. 이를 현미경 대물렌즈와 함께 배스 안으로 내립니다.

슬라이스에 가까이 다가간 후, 용액이 슬라이스에 닿을 수 있도록 약간 뒤로 뺍니다. 관류를 시작하면 여기처럼 슬라이스가 약간 움직이는 것이 보여야 합니다. 이제 기록할 적절한 세포를 찾아보겠습니다.

우리는 절편의 바닥 쪽에 위치한 신경절 세포(ganglion cells)를 찾고 있습니다. 전극을 배양액에 넣기 전, 전극을 준비하며 약간의 양압을 가합니다. 현미경으로 전극의 위치를 확인한 후, 세포에 패치(patch)를 하기 위해 전극을 절편 바로 위까지 내립니다.

40 x 대물렌즈로 교체했습니다. 이제 기선 전류를 영점 조정하고 전극 저항을 확인합니다. 씰 테스트(seal test)는 10 mV 펄스를 연속적으로 가하는 과정으로, 이를 통해 전극과 세포 사이에 기밀한 씰이 형성되었는지 확인합니다.

이제 전극을 대상 세포로 내립니다. 세포체에 딤플(dimple)이 형성되는 것이 보이면, 튜브의 양압을 해제하여 견고한 밀봉(seal)을 형성합니다. 이제 저항이 매우 높아져 전류 기록(current trace)이 평탄하게 나타납니다.

작은 스파이크들은 전극에서 발생하는 정전용량 아티팩트입니다. 이는 다음과 같이 보정할 수 있으며, 이제 제거되었습니다. 이제 세포 내부로 진입해 보겠습니다.

이를 위해 전극 숄더에 연결된 튜브에 조심스럽게 작은 흡입 펄스를 가하며, 모든 것이 제대로 작동한다면 전류 트레이스가 이와 같이 변하는 것을 볼 수 있습니다. 현재 보이는 스파이크는 막 커패시턴스에 의해 교차되며, 이제 이에 대해 보정할 수 있습니다. 현재 샘플은 암실에서 준비된 상태입니다. 빛에 의해 유도된 반응을 기록할 수 있는지 확인해 보겠습니다.

오실로스코프에서 보이는 파형은 -60 mV로 전압 고정된 신경절 세포의 전류 응답입니다. 사용된 빛 자극은 일정하고 균일한 배경 위에 제시된 밝은 막대와 어두운 막대 형태입니다. 연구실에서 사용하는 소프트웨어는 한 회차 시험의 전체 기록을 보여줍니다.

어두운 막대의 시작과 밝은 막대의 끝에 반응하여 이 세포가 off-cell임을 확인할 수 있습니다. 상단의 흰색 선은 자극의 지속 시간을 나타냅니다. 이제 다양한 약물을 관류하며 실험을 진행할 수 있습니다.

예를 들어, GABA성 및 Gly 시너지성 억제를 차단할 수 있습니다. 1분 미만으로 대기한 후, 보통 여기서 약물의 효과가 나타나기 시작하는 것을 볼 수 있습니다. 반응은 더 강해지고 더 오래 지속되었습니다.

망막 절편 준비법은 망막 내 다양한 세포의 시냅스 전류를 기록하는 데 널리 사용되어 왔으며, 전극 용액에 형광 염료를 추가하면 세포 유형을 쉽게 확인할 수 있습니다. 해부학적으로, 본 연구에서는 유생 TGA 도롱뇽을 동물 모델로 사용합니다. 도롱뇽이 변온 동물이며 망막 세포가 크다는 점은 기록 조건에 유리하지만, 동일한 기술을 포유류 절편 준비에도 적용할 수 있습니다.