Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스​​ 제닉 C. 엘레간스의 생성

Sea elegance는 세포 계통에 대한 지식과 전체 게놈의 염기서열 분석 및 분석을 통해 생성된 풍부한 정보로 인해 매우 유용한 모델 유기체입니다. 이 비디오에서는 sea elegance에 플라스미드를 micro 주입하는 과정과 형광 현미경을 사용하여 transgenic 자손을 선택하는 과정을 시연합니다.투명한 다세포 동물인 sea elegance는 in vivo에서 형광 표지된 단백질을 발현하는 transgenes를 시각화하는 데 이상적입니다. 안녕하세요, 제 이름은 로라 버코위츠(Laura Berkowitz)이고 앨라배마 대학교 생물과학부 콜드웰 연구소의 연구원입니다.

저는 앨라배마 대학의 캘웰 연구소(Calwell Lab)에서 근무하는 아담 나이트(Adam Knight)입니다. 오늘은 형질전환 바다의 우아함을 생성하기 위해 플라즈민 미세주입을 준비하고 수행하는 방법을 보여드리고, 형질전환 바다의 우아함을 선보이고 유지하는 방법을 보여드리겠습니다. 시작하겠습니다.

미세주입을 시작하기 전에 몇 가지 준비 단계가 있는데 지금 보여드리겠습니다. 먼저, 주입할 플라스미드 DNA를 준비하고, 두 개의 플라스미드가 필요한데, 하나는 관심 유전자의 조직 특이적 발현을 암호화하는 것이고, 다른 하나는 선택 가능한 형질전환 마커를 제공하는 것입니다. 플라스미드를 마이크로리터당 50나노그램의 일대일 비율로 함께 혼합합니다.

다음에는 주사를 위해 벌레를 고정하는 데 사용할 오거 패드를 준비합니다. 오거 패드를 만들기 위해 먼저 벤치 탑에 여러 개의 22 x 50mm 커버 안경을 배치하십시오. 목초지 피펫을 사용하여 녹은 2% 아그로스 한 방울을 하나의 커버 유리에 놓고 즉시 두 번째 커버 유리를 첫 번째 유리와 90도 각도로 떨어뜨린 방울 위에 놓습니다.

에어로가 몇 초 동안 굳어지도록 한 다음 상단 커버 유리를 제거합니다. 에어로의 평평한 디스크의 직경은 15mm에서 20mm 사이여야 합니다. 애완 동물처럼 패드를 몇 시간 또는 밤새 공기 중에서 완전히 건조시킵니다.

건조되면 패드를 커버 유리 상자에 넣어 실온에서 보관하십시오. 다음으로, DNA 용액을 위한 니들 로더를 준비합니다. 이렇게하려면 100 마이크로 리터의 모세관 튜브를 가져 와서 화염 한가운데에서 가열하고 약 두 배 길이로 빠르게 당깁니다.

모세관 튜브가 냉각되면 두 반쪽을 분리하십시오. 주입을 위해 10-20개의 니들 로더를 비축하십시오. 마이크로 원심분리기 튜브에 똑바로 세워서 보관할 수 있습니다.

브랙, 조심해. 니들 로더 포인트는 매우 날카롭습니다. 이제 마이크로 주사 바늘을 만드십시오.

이 바늘은 내부 유리 필라멘트가 포함된 특수 모세관 튜브로 만들어집니다. 이 필라멘트는 DNA 용액의 심지 역할을 합니다. 바늘을 만들기 위해 우리는 Niki PP eight 30 Polar를 사용합니다.24.8의 열 설정으로 한 번에 여러 바늘을 당겨 보관합니다.

모델링 점토 스트립에 여러 바늘을 장착할 수 있습니다. 커버 유리의 작은 파편을 사용하여 당겨진 바늘 끝을 부수십시오. 이 파편은 18 x 18mm 커버 유리를 Kim 물티슈로 감싸고 여러 조각으로 부서질 때까지 부드럽게 압력을 가하여 준비합니다.

크기가 약 3 x 4mm인 샤드를 사용합니다. DNA와 바늘을 준비하는 것 외에도 약 50-100 개를 적절하게 준비하십시오. 각 발현 벡터에 대해 두 개의 야생형 웜을 주입합니다.

이제 미세 주입 현미경을 설정할 준비가 되었습니다. 현미경 설정을 시작하려면 미세주입 바늘 암과 홀더에 연결된 헬륨 탱크의 메인 밸브를 엽니다. 가스가 라인으로 들어갈 수 있도록 조절기를 닫습니다.

압력을 35PSI로 가져오면 풋 페달을 사용하여 가스를 방출할 수 있습니다. 다음으로, 니들 로더를 표준 입 피펫 튜브에 삽입하고 소량의 플라스미드 혼합물을 약 1마이크로리터 떨어뜨립니다. 이제 저항이 느껴질 때까지 미세주입 바늘을 통해 로더를 완전히 삽입하십시오.

부드럽게 불어 DNA 용액을 배출한 다음 로더를 제거합니다. DNA가 로드되면 바늘을 미세 주입 암에 삽입하고 작은 내부 고무 개스킷 안에 조심스럽게 넣은 다음 매니퓰레이터의 암에 고정합니다. 그런 다음 오거 패드의 한쪽 가장자리에 덮개 유리 파편을 깨는 바늘을 놓습니다.

샤드와 오거 패드의 전체 표면을 할로우 카본 오일로 덮습니다. 그런 다음 오거 패드를 무대에 놓습니다.tage 도립 현미경의. 오거 패드가 제자리에 놓인 후 Forex 대물렌즈와 명시야 조명을 사용하여 시야 중앙에 바늘을 배치하되 아직 오일 속으로 내리지 마십시오.

그런 다음 커버 유리 조각의 내부 가장자리를 중앙에 배치한 다음 초점을 맞춥니다. 바늘을 오일 속으로 내려 커버 유리 조각과 동일한 초점면으로 가져옵니다. 40 x 대물렌즈로 전환하여 배율을 높인 다음 샤드의 가장자리에 다시 초점을 맞추고 필요한 경우 바늘 끝의 위치를 변경합니다.

이제 주사 바늘 끝을 부러뜨립니다. 커버 유리 조각의 가장자리에 바늘을 부드럽게 밀어 넣는 동시에 풋 페달을 통해 짧은 가스 펄스를 가합니다. 바늘이 충분히 부러져 열릴 것입니다.

작은 액체 방울이 바늘 끝에서 너무 커서 과도한 액체 흐름이 빠져 나오면 동물을 죽일 수 있으므로 구멍이 생기는 것은 바람직하지 않습니다. 바늘이 준비되면 미세 주입을 시작합니다. 다음으로 바늘을 위로 올려 스테이지에서 오거 패드를 제거합니다.

그러나 X 축 또는 Y 축 위치를 변경하지 마십시오. 스테이지를 바늘 아래에서 빼냅니다. 오거 패드를 제거하고 해부 현미경에 놓습니다.

오일 표면 아래의 패드에 단어를 옮깁니다. 벌레가 오거 패드에 닿을 때까지 부드럽게 쓰다듬으면 축축한 벌레가 마른 농업에 달라붙어야 합니다. 오거 패드를 s에 빠르게 다시 놓습니다.tage, 웜을 필드의 중앙에 놓습니다.

그런 다음 바늘을 벌레와 같은 초점면으로 내립니다. 반전된 스코프의 필터를 Hoffman 조명으로 전환합니다. 이 대비 필터를 사용하면 웜의 형태학적 세부 사항을 볼 수 있습니다.

40 x 대물렌즈를 사용하여 생식핵의 벌집 패턴 아래에 있는 벌레 생식선의 거친 감각 중심에 초점을 맞춥니다. 바늘을 향하는 벌레의 측면에 위치한 생식선을 선택하십시오. 벌금. 끝부분에도 초점이 맞춰질 때까지 바늘의 위치를 조정합니다.

생식선 중앙에 바늘을 부드럽게 삽입하고 짧은 가스 압력 펄스를 가하여 생식선 팔로 한두 방울의 DNA를 배출합니다. 많은 연습과 기술을 통해 원위 덩어리에 퍼진 액체의 파동을 관찰해야 합니다. 매번 고드 센터를 칠 수 있습니다.

웜을 주입하는 동안 빠르게 작업하는 것이 중요하다는 점을 명심하십시오. 쉽게 건조시킬 수 있기 때문입니다. 전체 프로세스는 이상적으로는 1-2분 미만이 소요됩니다.

주입이 완료되면 스테이지에서 오거 패드를 제거하고 해부 스코프에 놓습니다. 1마이크로리터의 M nine 버퍼를 주입된 웜에 직접 적용합니다. 이것은 헤일로 탄수화물 오일의 표면 아래에 피펫 팁을 담그는 것을 수반할 수 있습니다.

버퍼는 웜을 다시 수화해야 하며 그런 다음 에어로스 패드 표면에서 떠오르고 웜 픽을 사용하여 웜을 일반 플레이트로 옮깁니다. 이제 주입된 벌레를 Adam에게 넘겨주고 그는 형질전환 계통의 선택과 유지 관리를 보여줄 것입니다. 주입된 벌레는 신선한 씨를 뿌린 60mm 플레이트로 옮겨져 번식할 수 있습니다.

이러한 웜은 P zero 세대를 나타냅니다. 일반적으로 주입된 동물은 자손이 나타날 때까지 2-3일 동안 섭씨 20도에서 배양합니다. 자손이 나타나면 형질전환 기생충에 대한 검사를 시작할 준비가 된 것입니다.

F1 자손은 형질전환 마커의 증거를 위해 관찰됩니다. 이 경우 선택 가능한 마커는 형광성이므로 형광 실체 현미경을 사용하여 스크리닝할 수 있습니다. 각 형광 운반체 F1 동물은 새 플레이트에 개별적으로 복제됩니다.

주입된 P zero는 모든 F1 중에서 1-5명의 형광 자손만 생산할 수 있습니다. F1 자웅동체가 자손이 나타날 때까지 2-3일 동안 20도에서 번식하도록 합니다. F 2 세대가 준비되면 형질전환 동물도 관찰됩니다. F 형질전환 마커를 유전하고 발현한 두 동물은 안정적인 계통으로 간주됩니다.

각각의 독립적이고 안정적인 계통은 각각의 지렁이 계통이 각 세대마다 여러 형질전환 동물을 새로운 플레이트로 옮겨 각 계통을 전파하기 때문에 유지되어야 합니다. 이 작업은 형광 실체 현미경을 사용하여 수행해야 합니다. 선택 가능한 마커가 유전자 복제 수의 가변성을 제어하기 위해 형광성인 경우, 주입된 구성물당 최소 3개의 독립적인 안정 라인을 생성합니다.

방금 micro inject expression, vector constructs, elgan을 보고 안정적인 선을 선택하는 방법을 보여드렸습니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.