Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen door herprogrammeren embryonale fibroblasten van muizen met een vier transcriptiefactor, Doxycycline Induceerbare Lentivirale transductiesysteem

Hallo, mijn naam is Brad Hamilton. Ik werk in de afdeling onderzoek en ontwikkeling hier bij STEM Gen. Vandaag zullen we je een procedure laten zien voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit muis embryonale fibroblasten.

Deze procedure kan worden gebruikt om zowel geïnduceerde pluripotente stamcellen te genereren als om het herprogrammeringsproces te bestuderen. Dus laten we beginnen. Begin met het zaaien van muis embryonale fibroblasten, of meth cellen op een met gelatine beklede schaal van 15 centimeter met een dichtheid van vier maal 10 tot de vijfde cellen per schaal.

Voeg nu 30 milliliter meth groeimedium toe en incubeer de cellen gedurende twee dagen bij 37 graden Celsius en 5% koolzuurgas totdat ze ongeveer 80% confluent zijn. Wanneer het incuberen is voltooid, zuigt u het medium af en voegt u 30 milliliter groeimedium toe dat is aangevuld met geconcentreerd lentivirus.

Wieg de schaal voorzichtig om een gelijkmatige verdeling van het medium te garanderen. Incubeer de cellen een nacht lang bij 37 graden Celsius en 5% koolzuurgas met virale transductie voltooid. Laten we nu verder gaan met doxycycline geïnduceerde herprogrammering.

Om de herprogrammering te beginnen, probeer 20 tot 24 uur na transductie de getransduceerde cellen met trypsine en centrifugeer ze gedurende vijf minuten bij 200 Gs. Zuig vervolgens voorzichtig het medium van het cellenpellet af en suspendeer de cellen in groeimedium. Eenmaal gesuspendeerd, zaai de getransduceerde mes in een geschikte concentratie voor de grootte van de cellencultuur schaal die u gebruikt.

Hier gebruiken we 2,5 maal 10 tot de vijfde cellen per 10 centimeter schaal voor herprogrammeringsefficiëntie experimenten en IPS kolonie isolatie en twee maal 10 tot de vierde cellen per putje in vier putjes platen Voor immunochemische experimenten. Om de transductie-efficiëntie te controleren, incubeer de cellen een nacht lang bij 37 graden Celsius en 5% koolzuurgas. In dit stadium kunnen de cellen indien nodig worden ingevroren in vloeibare stikstof voor toekomstige analyse.

De volgende dag, zuigt u het medium af en vervangt u het door vers groeimedium dat is aangevuld met doxycycline tot een eindconcentratie van twee microgram per milliliter. We voegen een negatieve controle toe met medium zonder doxycycline. Incubeer tenslotte de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolzuurgas.

We hebben het herprogrammeringsproces gestart. Over het algemeen zullen pluripotente stamcelkolonies groot genoeg zijn voor isolatie na 16 tot 22 dagen.

Voordat we die procedure demonstreren, moeten we eerst de transductie-efficiëntie verifiëren met behulp van chemie om de transductie-efficiëntie te bepalen. Immunochemisch testen wordt uitgevoerd op de cellen die 48 uur na doxycycline inductie opnieuw zijn geplaatst in vier putjes platen. Alle volumes die in dit protocol worden vermeld, moeten worden aangepast aan de grootte van de cellencultuur plaat. Begin met het voorzichtig wassen van de cellen.

Eenmaal met PBS dat geen magnesium of calciumionen bevat, fixeer de cellen met 500 microliter 4% paraform aldehyde in PBS gedurende 15 minuten. Was de cellen bij kamertemperatuur nogmaals voorzichtig twee keer met PBS. Perme de cellen vervolgens door 500 microliter ijskoud 0,2% Tween 20 in PBS toe te voegen en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te incuberen.

Na het nogmaals wassen van de cellen. Voeg 200 microliter blokkeringsbuffer toe gedurende één uur bij kamertemperatuur om niet-specifieke antilichaambinding te blokkeren. Voeg nu 200 microliter van het gewenste primaire antilichaam toe.

Hier gebruiken we de pluripotentiemarkers T 4K LF vier, SOX twee en cmic. Incubeer de cellen een nacht lang bij vier graden Celsius. De volgende dag. Na het voorzichtig wassen van de cellen twee keer met PBS, incubeer ze met 200 microliter secundair antilichaam gedurende één uur bij kamertemperatuur en bescherm de platen tegen licht.

Hier gebruiken we de geschikte secundaire antilichamen geconjugeerd met fluoro vieren voor visualisatie, met behulp van een omgekeerde fluorescerende microscoop na incubatie. Was de cellen nogmaals twee keer en voeg vervolgens DPI toe en incubeer opnieuw gedurende 10 minuten om de kernen te visualiseren. Ten slotte, na een laatste wasbeurt, voeg antifa aqua mount toe voordat u de cellen met de omgekeerde fluorescerende microscoop beeldt om de transductie-efficiëntie te bepalen.

Begin met isolatie en expansie van pluripotente stamcellen. Na het starten van het herprogrammeringsproces, controleert u de culturen elke dag en vervangt u het geschikte medium elke 48 uur. We gebruiken doxycycline aangevuld medium om de cellen gedurende de eerste 12 dagen te kweken en vervolgens verwijderen we het doxycycline uit het medium.

De geïnduceerde pluripotente stamcel- of IPS-kolonies die handmatig worden geselecteerd voor expansie zijn doxycycline. Onafhankelijke cellen moeten dagelijks worden gecontroleerd op morfologische veranderingen die duiden op het herprogrammeringsproces. Elk experiment zal anders zijn, maar kolonies zijn over het algemeen groot genoeg voor isolatie tussen 16 tot 22 dagen na DS-inductie de dag voordat u begint met het isoleren en trypsiniseren van de herprogrammeerde kolonies.

Bereid een 24-putjesplaat voor door te zaaien met een gamma-bestraalde feederlaag van mets met een dichtheid van vijf maal 10 tot de vierde cellen per putje. Incubeer de cellen een nacht lang bij 37 graden Celsius en 5% koolzuurgas. De volgende dag pikt u handmatig elke IPS-kolonie en trypsiniseer het om de celaggregaten te dissociëren. Plaats de IPS-cellen in muis embryonale stamcelmedium in de afzonderlijke putjes van de voorafgaande 24-putjesplaat en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolzuurgas.

Ververs het medium elke 24 uur. Controleer de IPS-kolonies dagelijks op groei en GFP-fluorescentie. We hebben onze culturen zes dagen geïncubeerd voordat we ze verpakten in vier putjes platen voor pluripotentie-analyse.

Bepaal welke putjes van de 24-putjes