Passage menselijke neurale stamcellen
August 22nd, 2007
De mogelijkheid om menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs) te manipuleren in vitro het mogelijk maakt om hun bruikbaarheid te onderzoeken als cel transplantatie voor therapeutische doeleinden en voor de menselijke ontwikkeling van het zenuwstelsel te verkennen. Dit protocol bevat een methode voor het kweken en de passage hNSPCs in de hoop van de toenemende reproduceerbaarheid van het menselijk stamcelonderzoek.
Hallo, ik ben Steve. Ik werk in het lab van Dr. Flanagan in de afdeling Pathologie bij UC, Irvine. Vandaag ga ik je laten zien hoe je humane neurale voorlopercellen splitst.
Deze techniek omvat het coderen van een nieuwe flacon met een oplossing van humaan fibronectine, het losmaken van de cellen met celdissociatiebuffer, en vervolgens het neutraliseren van de celdissociatiebuffer met een 10% serumoplossing, het centrifugeren van de celsuspensie en het opnieuw suspenderen van de cellen in vers medium, en het overbrengen van de celsuspensie naar een nieuwe flacon. In ons lab kweken we humane neurale voorlopercellen door de helft van hun medium om de andere dag te verversen, en we passen ze ongeveer een keer per week over door ze een op een of twee te splitsen. Wanneer ik cellen passeer, tel ik ze mogelijk als ik ze wil inruilen voor een immunochemisch experiment, of als ik een transfectie wil doen met een nucleair effector.
Het is belangrijk om een celdissociatiebuffer te gebruiken bij het verpakken van cellen omdat het, ten eerste, niet-enzymatisch is, in tegenstelling tot trypsine, en het veel zachter is voor cellen. Hallo, we zijn nu in de weefselkweekruimte. En voordat ik je laat zien hoe een confluente flacon met humane voorlopercellen eruit ziet, ga ik eerst de weefselkweek voorbereiden. Eerst ga ik het UV-licht uitzetten en het licht en de luchtstroom aanzetten.
Vervolgens ga ik de kap desinfecteren met 70%ethanol door een papieren handdoek te besproeien en de kap af te vegen. Het is belangrijk om een papieren handdoek met 70%ethanol te besproeien en niet direct de binnenkant van de kap, omdat het besproeien van de kap met 70%ethanol de HEPA-filter kan beschadigen, wat erg duur is. Vervolgens ga ik alle reagentia en instrumenten besproeien.
En tenslotte ga ik de vacuümslangen besproeien, en we zijn er klaar voor. Laten we deze cellen eens bekijken. Deze cellen zien er ongeveer 80% confluent uit.
Dit zijn humane neurale voorlopercellen geïsoleerd uit menselijke foetussen, en we kweken ze in T 25 flacons. We splitsen ze ongeveer elke week, één op één of twee. Ik ben nu klaar om mijn cellen over te brengen.
En eerst ga ik een nieuwe T 25 flacon brengen die ik vier uur heb gecoat met humaan fibronectine van BD biosciences. Dus ik heb de fibronectine-oplossing verwijderd. Ik ga deze flacon spoelen met BBS voordat ik de cellen in de flacon breng.
En nu ga ik de cellen uit de 37 graden incubator halen. Daar zijn ze. Nu ga ik de PBS-wasoplossing van de nieuwe flacon verwijderen die gecoat was met humaan fibronectine.
En ik ga twee milliliter oude geconditioneerde media toevoegen aan de nieuwe flacon. Dus nu moet ik mijn cellen spoelen met PBS voordat ik ze van het oppervlak kan halen. Dus eerst ga ik het resterende medium verwijderen, ongeveer twee mils PBS toevoegen, direct zonder de cellen nat te maken om ze niet uit te drogen.
Ik ga ongeveer twee minuten wachten voordat ik PBS verwijder en celdissociatiebuffer aanbreng om de cellen van het oppervlak van de flacon te halen. Nu ga ik PBS verwijderen, en nogmaals, ik ga proberen om direct celdissociatiebuffer toe te voegen zodat de cellen niet uitdrogen. Dus ik ga 1,5 mils celdissociatiebuffer toevoegen.
En in tegenstelling tot PBS, ga ik het direct op de cellen aanbrengen en ik ga proberen om zoveel mogelijk oppervlak te bedekken. Dus ik beweeg de flacon van links naar rechts terwijl ik deze buffer langzaam op de cellen aanbreng. En ik ga nu ongeveer vijf minuten wachten tot de cellen van het oppervlak beginnen te komen.
En ik ga de flacon op kamertemperatuur in de kap laten staan. Zoals je hier kunt zien, beginnen de cellen eerst rond te worden en dan beginnen ze van het oppervlak te komen en je kunt al sommige cellen zien zweven. En als je de flacon breed aan de zijkant tikt, helpt dat ze los te laten komen.
Het is nu vijf minuten geweest, en zoals je kunt zien, is de oplossing erg dicht geworden met cellen die van het oppervlak zijn gekomen. En nu ga ik het effect van celdissociatiebuffer neutraliseren door 4,5 mils serumhoudend medium toe te voegen. Dus ik ga 10% verhit geïnactiveerd foetaal bovien serum in D-M-E-M-F 12-medium gebruiken, en ik ga het direct op het oppervlak van de flacon aanbrengen om er zeker van te zijn dat er geen cellen meer aan het oppervlak vastzitten.
En ik ga, en ik ga voorzichtig pipeteren omhoog en omlaag om eventuele resterende cellen los te maken. En vervolgens ga ik de celsuspensie overbrengen in een 15 mil conische buis. En ik ga het een minuut op duizend RPM draaien.
Dus de cellen zijn klaar met draaien en we hebben hier een prachtige celpellet. Ik ga het serummedium heel voorzichtig verwijderen zonder de pellet te verstoren. En vervolgens ga ik de pellet opnieuw opschorten in vier mils van het medium.
Dus ik ga proberen om de pellet op te schorsen zodat er geen celklompjes meer overblijven, zodat de oplossing homogeen wordt en geen klonten bevat. En aangezien ik een een op een of twee splitsing doe, ga ik twee van de vier mils nemen en ze overbrengen naar de nieuwe flacon die al twee mils van het geconditioneerde medium bevat. En tenslotte ga ik de flacon labelen met het celtype, het passagenummer en de datum.
Dit is een kijkje in de cellen die we een half uur geleden hebben gepasseerd. En zoals je kunt zien, hebben de meeste van hen zich aan het oppervlak gehecht en zijn ze begonnen met het uitzenden van uitlopers. Dat is alles, mensen.
En nu ben ik klaar om te tellen.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het kweken en passeren van humane neurale stam-/precursorcellen (hNSPCs) in vitro. De techniek heeft tot doel de reproduceerbaarheid van onderzoek met menselijke stamcellen te verbeteren en de verkenning van neurale ontwikkeling en mogelijke therapeutische toepassingen te vergemakkelijken.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Stamcellenbiologie
- Celcultuurtechnieken
Achtergrond
- Humane neurale stam-/precursorcellen (hNSPCs) zijn cruciaal voor het bestuderen van neurale ontwikkeling.
- In vitro manipulatie van hNSPCs kan leiden tot therapeutische vooruitgang.
- Reproduceerbaarheid in stamcelonderzoek is essentieel voor wetenschappelijke vooruitgang.
- Celcultuurtechnieken zijn fundamenteel in neurowetenschappelijk onderzoek.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode voor het kweken van hNSPCs te bieden.
- Om het gebruik van hNSPCs in experimentele toepassingen te vergemakkelijken.
- Om het begrip van humane neurale ontwikkeling te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bekleden van flasken met humane fibronectine.
- Gebruik van celdissociatiebuffer om cellen op te tillen.
- Neutralisatie van de dissociatiebuffer met een serumoplossing.
- Centrifugeren en hersuspenderen van cellen in vers medium.
Belangrijkste resultaten
- Succesvol passeren van hNSPCs met behulp van de beschreven methode.
- Verbeterde reproduceerbaarheid in celcultuurpraktijken.
- Mogelijkheid voor toepassing in immunochemie en transfectie-experimenten.
- Een routine vaststellen voor mediaverversingen en passeringsfrequentie.
Conclusies
- Het protocol biedt een systematische benadering voor hNSPC-kweek.
- Verbeteringen in reproduceerbaarheid kunnen leiden tot betere experimentele resultaten.
- Verder onderzoek kan het therapeutische potentieel van hNSPCs verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Standardized passaging of human neural stem/precursor cells (hNSPCs) supports reproducible in vitro models for target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease research. Reliable expansion of hNSPCs enables consistent assay inputs for phenotypic screening and lead identification programs. This protocol addresses variability in stem cell culture that can confound translational biomarker studies and preclinical model fidelity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neural pathway modulation using genetically stable hNSPCs expressing nestin and SOX2.
- Operational Value: Reduces culture-induced variability that obscures target engagement readouts in early screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides adherent, bipolar morphology hNSPCs suitable for high-content imaging of neurite outgrowth or synaptic marker expression.
- Operational Value: Standardized 1:2 split every 7 days supports scalable seeding densities for multi-well plate assays.
- Strategic Value: Fibronectin-coated flasks improve attachment efficiency, reducing well-to-well inconsistency in compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains undifferentiated marker expression, preserving multipotency for differentiation into disease-relevant neuronal subtypes.
- Operational Value: Conditioned media carryover during passaging supports paracrine factor studies relevant to neuroinflammatory pathways.
Pipeline & Workflow Integration
This passaging method fits within the discovery continuum from target validation through assay optimization to preclinical model generation, where hNSPC consistency impacts data reliability across stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via controlled expansion of hNSPCs for CRISPR screening or overexpression studies.
- Screening: Enables reproducible plating densities for quantifying compound effects on cell viability or differentiation markers.
- Analytics: Yields homogeneous suspensions amenable to flow cytometry or immunocytochemistry for quantitative readouts.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing a scalable source for generating neurons or glia for transplantation efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Defined coating and passaging frequency allows technology transfer across sites for multi-project stem cell programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in stem cell-derived assays through minimized passage-induced drift.
- Operational Value: Standardized dissociation and neutralization steps enhance day-to-day reproducibility.
- Strategic Value: Enables capital-efficient scale-up by reducing failed batches due to inconsistent subculture.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted decisions in neurodegenerative portfolios by improving data fidelity in target validation cascades.
Implementation Considerations
- Requires aseptic technique training for safe handling of dissociation buffers and serum supplements.
- Depends on access to human fibronectin-coated cultureware and sterile conical tubes for centrifugation.
- Necessitates standardization of passaging timing relative to confluence (~80%) to avoid overgrowth-induced differentiation.
- Adaptation to suspension or spheroid cultures would require matrix adjustments beyond adherent fibronectin coating.
- Limited to research-scale operations; GMP-compliant passaging would require closed-system bioreactors and qualified reagents.
