Name: Passage menselijke neurale stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Leer hoe je menselijke neurale stamcellen (hNSPCs) kweekt en splitst met behulp van fibronectincoating en celdissociatiebuffer. Deze methode verbetert de reproduceerbaarheid van stamcelonderzoek en ondersteunt studies naar neurale ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs dankbaar erkennen dr. Philip H. Schwartz van de National Human Resource Neural Stamcel op het Children&#39;s Hospital, Orange County Research Instituut voor het verstrekken van hNSPCs en de eerste instructie in hun kweken.

Opmerking: Voor routine kweken van onze hNSPCs, veranderen we 50-100% van de media om de andere dag en meestal passage hen 01u02 een keer per week. De cultuur media bevat 20% BIT-9500, 1X antibiotica / antimycotica, en groeifactoren (EGF, FGF, PDGF en elk bij 40 ng / ml) in DMEM: F12 base media. De voorbereiding van de Coated kolf en Dissociatie de Cellen <ol><li> Om nieuwe kolven voor te bereiden op de passage cellen, jas T25 flessen met 10 ug / ml humaan fibronectine in EMEM gedurende 4 uur of &#39;s nachts, in een 37 ° C weefselkweek incubator. Vlak voor passage van de cellen, verwijder de fibronectine-oplossing en spoel de kolven met PBS. </li><li> Breng de oude &quot;geconditioneerde&quot; media uit de cellen te worden gepasseerd om de nieuwe fibronectine gecoate kolven (zoals dat de helft van het uiteindelijke volume van de media voor elke kolf zal de &quot;geconditioneerde&quot; media). Deze kweekomstandigheden helpen om deze cellen in hun ongedifferentieerde toestand. </li><li> Wanneer alle van de media wordt verwijderd uit de cellen te worden gepasseerd, zodra spoel de cellen met PBS. Zorg ervoor dat niet uitdrogen van de cellen. </li><li> Voeg Cell Dissociatie Buffer (CDB) direct op de cellen (1,0-1,5 ml voor een T25 fles). Incubeer cellen in de buffer voor ongeveer 5 minuten bij kamertemperatuur. Voorzichtig tikken de kolf zal helpen versnellen cel onthechting. </li></ol> Centrifugeren, mengen, en Plating Cellen <ol><li> Voeg serum-bevattende media (DMEM: F12 met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum) (gebruik ~ 3X het volume van de CDB) om de kolf met vrijstaande cellen. Verwijder de media en cellen om een ​​15 ml conische buis. Gebruik een kleine hoeveelheid verse serum-bevattende media om de af te spoelen en de resterende cellen herstellen. </li><li> Centrifugeer de media en de cellen bij 1000 rpm (~ 200xg) gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig-off van de serum-bevattende media en resuspendeer de cellen in verse cultuur media, en neer te pipetteren om een ​​homogene celsuspensie te maken. </li><li> Overdracht de helft van de geresuspendeerde cellen in elke nieuwe kolf voor een 1:2 splitsing. Let op de nieuwe passage nummer op de kolf. </li></ol>

<ol><li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).</li>
<li>Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Stem+Cell+Manual%3A+A+Laboratory+Guide%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell culture.</a> Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).</li>
<li>Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture.+Progenitor+cells+from+human+brain+after+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture. Progenitor cells from human brain after death.</a> Nature. 411, 42-43 (2001).</li>
<li>Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+neural+progenitor+cells+from+post-mortem+human+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex.</a> J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).</li>
</ol>

We hebben ontdekt dat dit protocol een betrouwbare culturen van hNSPCs biedt. Een kritische factor voor onze cellen is dat ze moeten worden gehouden als tamelijk dicht culturen en kan niet worden gepasseerd om het punt dat de cellen schaars zijn. In onze handen, dun culturen groeien heel langzaam of helemaal niet meer te delen. Om deze reden hebben we doorgaans verdeeld onze culturen 1:2 of 1:3 als een cultuur is zeer dicht. Coating het oppervlak van een cultuur schotel met fibronectine is belangrijk, want het bevordert een goede celhechtin...

<table><tbody><tr><td>BIT-9500 (BSA, Insuline, Transferrine)</td><td>Reagens</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>09500</td><td></td></tr><tr><td>Antibioticum-Antimycoticum</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12 (1X)</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>EMEM (1X)</td><td>Reagens</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>MT-10-010-CV</td><td>Gedistribueerd door Fisher onder het aangegeven catalogusnummer</td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>FGF, humaan basis recombinant</td><td>Reagens</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AB</td><td>Reagens</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-00AB</td><td></td></tr><tr><td>EGF, humaan recombinant</td><td>Reagens</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40052</td><td>Gedistribueerd door Fisher onder het aangegeven catalogusnummer</td></tr><tr><td>Celkweekfles, 25 cm2</td><td>Instrument</td><td>Corning</td><td>10-126-28</td><td>Gedistribueerd door Fisher onder het aangegeven catalogusnummer</td></tr><tr><td>Fibronectine, humaan, natuurlijk</td><td>Reagens</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40008A</td><td>Gedistribueerd door Fisher onder het aangegeven catalogusnummer</td></tr><tr><td>Humaane neurale stam-/precursorcellen</td><td>Cellen</td><td>National Human Neural Stem Cell Resource</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cel-dissociatiebuffer</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>13150-016</td><td></td></tr></tbody></table>

passage menselijke neurale stamcellen

Passaging Human Neural Stem Cells

De mogelijkheid om menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs) te manipuleren in vitro biedt een middel om hun bruikbaarheid te onderzoeken als cel transplantatie voor therapeutische doeleinden, alsmede voor vele fundamentele processen van de menselijke neurale ontwikkeling en pathologie te verkennen. Dit protocol biedt een eenvoudige methode van het kweken en de passage hNSPCs in de hoop de standaardisering van deze techniek en het vergroten van de reproduceerbaarheid van het menselijk stamcelonderzoek. De hNSPCs we gebruiken werden geïsoleerd uit dode postnatale hersenen cortex door de Nationale menselijke neurale stamcellen Resource en gegroeid als aanhanger culturen op flessen bekleed met fibronectine (Palmer et al., 2001;.. Schwartz et al., 2003). We cultuur onze hNSPCs in een DMEM: F12 serum-vrij medium aangevuld met EGF, FGF, en PDGF en passage hen 01u02 ongeveer om de zeven dagen. Met behulp van deze voorwaarden, de meerderheid van de cellen in de cultuur te behouden een bipolaire morfologie en uitdrukkelijke markers van ongedifferentieerde neurale stamcellen (zoals Nestin en Sox2).

De mogelijkheid om menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs) te manipuleren in vitro het mogelijk maakt om hun bruikbaarheid te onderzoeken als cel transplantatie voor therapeutische doeleinden en voor de menselijke ontwikkeling van het zenuwstelsel te verkennen. Dit protocol bevat een methode voor het kweken en de passage hNSPCs in de hoop van de toenemende reproduceerbaarheid van het menselijk stamcelonderzoek.

Passage menselijke neurale stamcellen

De mogelijkheid om humane neurale stam-/precursorcellen (hNSPCs) in vitro te manipuleren, biedt een manier om hun bruikbaarheid als celtransplantaten te onderzoeken voor ...

Hallo, ik ben Steve. Ik werk in het laboratorium van Dr. Flanagan bij de afdeling Pathologie van uc, Irvine. Vandaag ga ik u laten zien hoe u menselijke neurale precursorcellen splitst.Deze techniek omvat het coaten van een nieuwe kolf met een oplossing van menselijk fibronectine, het losmaken van de cellen met een cel-dissociatiebuffer, het neutraliseren van de cel-dissociatiebuffer met een 10% serumoplossing, het centrifugeren van de celsuspensie, het opnieuw resuspenderen van de cellen in vers medium en het overbrengen van de celsuspensie naar een nieuwe kolf. In ons laboratorium kweken we menselijke neurale precursorcellen door om de dag de helft van hun medium te verversen, en we passen ze ongeveer één keer per week door ze in een verhouding van één op twee te splitsen. Wanneer ik cellen passageer, tel ik ze eventueel als ik ze wil gebruiken voor een immunochemisch experiment, of als ik een transfectie met een nucleaire effector wil uitvoeren.Het is belangrijk om een cel-dissociatiebuffer te gebruiken bij het verpakken van cellen omdat deze ten eerste niet-enzymatisch is, in tegenstelling tot trypsine, en veel milder is voor de cellen. Hallo, we zijn nu in de weefselkweekruimt

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het introduceren van een gen van interesse in een cel is een krachtige methode voor het ophelderen van de functie in vivo. Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het transfecteren een cultuur van menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs) met de Nucleofector elektroporatie apparaat gemaakt door Amaxa.

Transfecteren menselijke neurale stamcellen met de Amaxa Nucleofector

Kennis van het exacte aantal levensvatbare cellen is nodig voor vele weefselkweek manipulaties. Dit protocol beschrijft hoe onderscheid te maken tussen levende en dode cellen en kwantificeren cellen met behulp van een hemacytometer. Hoewel het beschrijft het tellen van menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs), kan het worden gebruikt voor andere celtypen.

Het tellen van menselijke neurale stamcellen

Neurale stamcellen werden bereid uit de hippocampus van de volwassen niet-winterslaap jaarling Arctic grondeekhoorns (AGS). Deze neurale stamcellen kan worden uitgebreid door middel van talrijke passages, gedifferentieerde en onderhouden als een bijna 50:50 neuron te glia-cultuur.

Groei en differentiatie van volwassen hippocampus Arctic grondeekhoorn neurale stamcellen

Een eenvoudige en betrouwbare methode op isolatie en de cultuur van neurale stamcellen uit afgedankte menselijke foetale corticale weefsel wordt beschreven. Culturen zijn afgeleid van bekende menselijke neurologische aandoeningen kunnen worden gebruikt voor de karakterisering van pathologische cellulaire en moleculaire processen, maar ook als een platform om de farmacologische werkzaamheid beoordelen.

Generatie van neurale stamcellen uit afgedankte menselijke foetale Cortical weefsel

Hersentumorpatiënten regelmatig een craniale radiotherapie, en terwijl voordelig, deze behandeling resulteert vaak in slopende cognitieve dysfunctie. Dit ernstige onopgeloste probleem is op dit moment geen klinische verhaal, en heeft gedreven onze inspanningen om op basis van stamcellen therapieën ontwikkelen voor het herstel van straling geïnduceerde cognitieve verlaagt.

Stamceltransplantatie strategieën voor het herstel van de cognitieve disfunctie veroorzaakt door Cranial Radiotherapie

This video demonstrates the method to differentiate human neural stem cells from neurospheres into neural and astrocyte progenitors using enzymatic treatment and culturing in a growth factor-rich medium, which eventually leads to maturation into specialized progenitor cells.

Differentiating Human Neural Stem Cells into Neural and Astrocyte Progenitors

Neurale stamcellen geoogst uit de volwassen hersenen worden steeds gebruikt in toepassingen, variërend van het fundamenteel onderzoek van de ontwikkeling van het zenuwstelsel aan het verkennen van potentiële klinische toepassingen in de regeneratieve geneeskunde. Dit maakt strenge controle op de isolatie en kweekomstandigheden gebruikt om deze cellen cruciaal voor experimentele resultaten goed groeien.

Groeiende neurale stamcellen uit Conventionele en Niet-conventionele Regio&#39;s van de Adult knaagdierhersenen

Dit protocol beschrijft een nieuwe mechanische snij methode die de sferische expansie van neurale stamcellen en voorlopercellen aggregaten zonder dissociatie een enkele celsuspensie maakt. Handhaving van cel / cel contact maakt een snelle en stabiele groei voor meer dan 40 passages.

Een cGMP-toepassing Uitbreiding Methode voor Aggregaten van menselijke neurale stamcellen en stamcellen afgeleid uit pluripotente stamcellen of foetaal hersenweefsel

Een werkwijze werd ontwikkeld om direct voort humane neurale stamcellen van hematopoïetische progenitorcellen verrijkte uit perifere bloedcellen.

Direct Inductie van Human neurale stamcellen uit perifeer bloed hematopoïetische voorlopercellen

Met het doel om veranderingen in miRNA's in gedifferentieerde menselijke neurale stamcellen (hNSC's) te karakteriseren, beschrijven we hNSC-differentiatie op een driedimensionaal systeem, de evaluatie van veranderingen in microRNA-expressie door miRNA PCR-array en computationele analyse voor miRNA-doelwitvoorspelling en de validatie ervan door middel van een dual luciferase-assay.

Differentiatie van een menselijke neurale stamcellen Line op Three Dimensional Culturen, Analyse van MicroRNA en vermeende doelwit-genen

Het volwassen zoogdierspinaalmerg bevat neurale stam-/voorlopercellen (NSPC's) die kunnen worden geïsoleerd en uitgebreid in cultuur. Dit protocol beschrijft het oogsten, isoleren, kweken en passeren van NSPC's die zijn gegenereerd uit de periventriculaire regio van het volwassen ruggenmerg van de rat en van menselijke orgaantransplantatiedonoren.

Isolatie van neurale stamcellen / stamcellen uit de periventriculaire regio van de volwassen rat en Human Spinal Cord

Leer hoe je menselijke neurale stamcellen (hNSPCs) kweekt en splitst met behulp van fibronectincoating en celdissociatiebuffer. Deze methode verbetert de reproduceerbaarheid van stamcelonderzoek en ondersteunt studies naar neurale ontwikkeling.

Passage menselijke neurale stamcellen

Meer video's verkennen