Passage menselijke neurale stamcellen
22 augustus 2007
De mogelijkheid om menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs) te manipuleren in vitro het mogelijk maakt om hun bruikbaarheid te onderzoeken als cel transplantatie voor therapeutische doeleinden en voor de menselijke ontwikkeling van het zenuwstelsel te verkennen. Dit protocol bevat een methode voor het kweken en de passage hNSPCs in de hoop van de toenemende reproduceerbaarheid van het menselijk stamcelonderzoek.
Hallo, ik ben Steve. Ik werk in het laboratorium van Dr. Flanagan bij de afdeling Pathologie van uc, Irvine. Vandaag ga ik u laten zien hoe u menselijke neurale precursorcellen splitst.
Deze techniek omvat het coaten van een nieuwe kolf met een oplossing van menselijk fibronectine, het losmaken van de cellen met een cel-dissociatiebuffer, het neutraliseren van de cel-dissociatiebuffer met een 10% serumoplossing, het centrifugeren van de celsuspensie, het opnieuw resuspenderen van de cellen in vers medium en het overbrengen van de celsuspensie naar een nieuwe kolf. In ons laboratorium kweken we menselijke neurale precursorcellen door om de dag de helft van hun medium te verversen, en we passen ze ongeveer één keer per week door ze in een verhouding van één op twee te splitsen. Wanneer ik cellen passageer, tel ik ze eventueel als ik ze wil gebruiken voor een immunochemisch experiment, of als ik een transfectie met een nucleaire effector wil uitvoeren.
Het is belangrijk om een cel-dissociatiebuffer te gebruiken bij het verpakken van cellen omdat deze ten eerste niet-enzymatisch is, in tegenstelling tot trypsine, en veel milder is voor de cellen. Hallo, we zijn nu in de weefselkweekruimte, en voordat ik laat zien hoe een confluente kolf met menselijke precursorcellen eruitziet, ga ik eerst de weefselkweek voorbereiden. Eerst schakel ik het UV-licht uit en zet ik het licht en de luchtstroom aan.
Vervolgens zal ik de zuurkast desinfecteren met 70% ethanol door een papieren handdoek te besproeien en de zuurkast af te nemen. Het is belangrijk om een papieren handdoek met 70% ethanol te besproeien en niet direct de binnenkant van de zuurkast, omdat het direct besproeien van de zuurkast met 70% ethanol het HEPA-filter kan beschadigen, wat zeer kostbaar is. Daarna zal ik alle reagentia en instrumenten besproeien.
En tot slot ga ik de vacuümslangen besproeien, en dan zijn we klaar. Laten we naar deze cellen kijken. Deze cellen zien er ongeveer 80% confluent uit.
Dit zijn humane neurale precursorcellen die zijn geïsoleerd uit menselijke foetussen, en we kweken ze in T 25-flasks. We splitsen ze ongeveer elke week in een verhouding van één op twee. Ik ben nu klaar om mijn cellen te passageren.
Eerst neem ik een nieuwe T 25-fles die ik vier uur lang heb gecoat met menselijk fibronectine van BD Biosciences. De fibronectine-oplossing is inmiddels verwijderd. Ik ga deze fles spoelen met BBS voordat ik de cellen naar de fles overbreng.
En nu ga ik de cellen uit de incubator van 37 °C halen. Daar zijn ze. Nu ga ik de PBS-wasoplossing verwijderen uit de nieuwe kolf die was gecoat met humaan fibronectine.
En ik ga twee milliliter oud geconditioneerd medium aan de nieuwe kolf toevoegen. Nu moet ik mijn cellen spoelen met PBS voordat ik ze van het oppervlak kan verwijderen. Eerst verwijder ik het resterende medium en voeg ik direct ongeveer twee ml PBS toe om te voorkomen dat de cellen uitdrogen.
Ik wacht ongeveer twee minuten voordat ik de PBS verwijder en de cel-dissociatiebuffer toevoeg, om de cellen van het oppervlak van de flask los te maken. Nu ga ik de PBS verwijderen en ik zal direct de cel-dissociatiebuffer toevoegen, zodat de cellen niet uitdrogen. Ik voeg 1,5 ml cel-dissociatiebuffer toe.
En in tegenstelling tot PBS, voeg ik het direct toe aan de cellen en probeer ik zoveel mogelijk oppervlak te bedekken. Daarom beweeg ik de kolf van links naar rechts terwijl ik deze buffer langzaam op de cellen toevoeg. Ik wacht nu ongeveer vijf minuten tot de cellen van het oppervlak beginnen los te laten.
Vervolgens laat ik de kolf op kamertemperatuur in de zuurkast staan. Zoals u hier kunt zien, beginnen de cellen eerst rond te worden en laten ze vervolgens het oppervlak los; u kunt zelfs al enkele cellen zien zweven. Als u voorzichtig tegen de zijkant van de kolf tikt, helpt dat om ze los te laten komen.
Er zijn nu vijf minuten verstreken en, zoals u kunt zien, is de oplossing zeer dens geworden door de cellen die los zijn gekomen van het oppervlak. Nu ga ik het effect van de cel-dissociatiebuffer neutraliseren door 4,5 ml serumhoudend medium toe te voegen. Hiervoor gebruik ik 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum in DMEM-F12 medium, dat ik direct op het oppervlak van de kolf zal toevoegen om er zeker van te zijn dat er geen cellen meer aan het oppervlak vastzitten.
Vervolgens pipetteer ik voorzichtig op en neer om eventuele resterende cellen los te maken. Daarna breng ik de celoplossing over in een conische buis van 15 ml. Deze centrifugeer ik gedurende één minuut bij 1000 RPM.
De cellen zijn nu gecentrifugeerd en we hebben hier een mooi celpellet. Ik ga het serummedium zeer voorzichtig verwijderen zonder het pellet te verstoren. Vervolgens zal ik het pellet resuspenderen in 4 mL van het medium.
Ik ga nu proberen de pellet opnieuw te suspenderen, zodat er geen celklonten meer achterblijven en de oplossing homogeen wordt en geen klonten meer bevat. Omdat ik een splitsing van 1:2 uitvoer, neem ik 2 mL van de 4 mL en breng deze over naar de nieuwe kolf die al 2 mL geconditioneerd medium bevat. Ten slotte zal ik de kolf labelen met het celtype, het passagenummer en de datum.
Dit is een blik op de cellen die we een half uur geleden hebben gesubcultured. En zoals u kunt zien, zijn de meeste cellen aan het oppervlak gehecht en zijn ze begonnen met het uitsturen van uitlopers. Dat is alles.
En nu ben ik klaar om te tellen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het kweken en passeren van menselijke neurale stam-/precursorcellen (hNSPCs) in vitro. De techniek is erop gericht de reproduceerbaarheid van onderzoek naar menselijke stamcellen te verbeteren en de exploratie van neurale ontwikkeling en potentiële therapeutische toepassingen te faciliteren.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Stamcelbiologie
- Celkweektechnieken
Achtergrond
- Menselijke neurale stam-/precursorcellen (hNSPCs) zijn cruciaal voor het bestuderen van de neurale ontwikkeling.
- In vitro manipulatie van hNSPCs kan leiden tot therapeutische vooruitgang.
- Reproduceerbaarheid in stamcelonderzoek is essentieel voor wetenschappelijke vooruitgang.
- Celcultuurtechnieken vormen de basis van neurowetenschappelijk onderzoek.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het kweken van hNSPCs.
- Om het gebruik van hNSPCs in experimentele toepassingen te vergemakkelijken.
- Om het begrip van de menselijke neurale ontwikkeling te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Het coaten van kolven met menselijk fibronectine.
- Het gebruik van cel-dissociatiebuffer om cellen los te maken.
- Het neutraliseren van de dissociatiebuffer met een serumoplossing.
- Het centrifugeren en resuspenderen van cellen in vers medium.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle passaging van hNSPCs met behulp van de beschreven methode.
- Verbeterde reproduceerbaarheid in celkweekpraktijken.
- Potentieel voor toepassing in immunochemische en transfectie-experimenten.
- Vaststellen van een routine voor mediumvervangingen en passagingfrequentie.
Conclusies
- Het protocol biedt een systematische aanpak voor de kweek van hNSPCs.
- Verbeteringen in de reproduceerbaarheid kunnen leiden tot betere experimentele resultaten.
- Verder onderzoek kan het therapeutische potentieel van hNSPCs verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Gestandaardiseerde passaging van humane neurale stam-/precursorcellen (hNSPCs) ondersteunt reproduceerbare in vitro modellen voor targetvalidatie en mechanische risicoreductie in onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten. Betrouwbare expansie van hNSPCs maakt consistente assay-inputs mogelijk voor fenotypische screening en programma's voor lead-identificatie. Dit protocol pakt de variabiliteit in stamcelkweek aan die translationele biomarkerstudies en de getrouwheid van preklinische modellen kan beïnvloeden.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de modulatie van neurale paden mogelijk met behulp van genetisch stabiele hNSPCs die nestin en SOX2 tot expressie brengen.
- Operationele waarde: Vermindert kweek-geïnduceerde variabiliteit die de readouts van target engagement in vroege screening vertroebelt.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert hNSPCs met een adherente, bipolaire morfologie die geschikt zijn voor high-content imaging van neurietuitgroei of de expressie van synaptische markers.
- Operationele waarde: Een gestandaardiseerde 1:2 splitsing elke 7 dagen ondersteunt schaalbare zaaidichtheden voor assays in multi-well platen.
- Strategische waarde: Met fibronectine gecoate flessen verbeteren de aanhechtingsefficiëntie, waardoor inconsistenties tussen wells bij compound screening worden verminderd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de expressie van ongedifferentieerde markers, waardoor de multipotentie voor differentiatie naar ziekte-relevante neuronale subtypen behouden blijft.
- Operationele waarde: De overdracht van geconditioneerd medium tijdens het passeren ondersteunt studies naar paracriene factoren die relevant zijn voor neuro-inflammatoire pathways.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze passagemethode past binnen het continuüm van ontdekking, van targetvalidatie via assay-optimalisatie tot de generatie van preklinische modellen, waarbij de consistentie van hNSPC's de betrouwbaarheid van de gegevens in alle fasen beïnvloedt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing via gecontroleerde expansie van hNSPCs voor CRISPR-screening of overexpressiestudies.
- Screening: Maakt reproduceerbare plating-dichtheden mogelijk voor het kwantificeren van effecten van verbindingen op celviabiliteit of differentiatiemarkers.
- Analytics: Levert homogene suspensies op die geschikt zijn voor flowcytometrie of immunocytochemie voor kwantitatieve read-outs.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan op preklinisch werk door een schaalbare bron te bieden voor het genereren van neuronen of glia voor studies naar transplantatie-effectiviteit.
- Enterprise Reuse: Gedefinieerde coating- en passagefrequenties maken technologieoverdracht tussen locaties mogelijk voor multi-project stamcelprogramma's.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid van assays afgeleid van stamcellen door het minimaliseren van drift veroorzaakt door passages.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde dissociatie- en neutralisatiestappen verbeteren de dagelijkse reproduceerbaarheid.
- Strategische waarde: Maakt kapitaalefficiënte opschaling mogelijk door het aantal mislukte batches als gevolg van inconsistente subcultuur te verminderen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen in neurodegeneratieve portfolio's door de data-getrouwheid in target-validatiecascades te verbeteren.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist training in aseptische technieken voor de veilige hantering van dissociiebuffers en serumsupplementen.
- Afhankelijk van toegang tot met menselijk fibronectine gecoate kweekmaterialen en steriele conische buizen voor centrifugatie.
- Vereist standaardisatie van de timing van het passeren ten opzichte van de confluentie (~80%) om differentiatie door overgroei te voorkomen.
- Aanpassing aan suspensie- of sferoïdkweken zou matrixaanpassingen vereisen die verder gaan dan de adherente fibronectinecoating.
- Beperkt tot operaties op onderzoeksschaal; GMP-conform passeren vereist bioreactoren met gesloten systemen en gekwalificeerde reagentia.
